Name: Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-06-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 28 s
Description: Leer de Z-REX-methode om signaalreacties te analyseren in larven van Danio rerio. Deze techniek koppelt specifieke ligand-doelwitinteracties aan fenotypische veranderingen met hoge precisie, wat waardevolle inzichten biedt voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Financiering: Novartis FreeNovation, NCCR en EPFL.

<ol><li>Long, M. J. C., Ly, P., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+harnessing+non-enzymatic+post-translational+modifications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A primer on harnessing non-enzymatic post-translational modifications for drug design.</a> RSC Medicinal Chemistry. 12 (11), 1797-1807 (2021).</li>
<li>Parvez, S., Long, M. J. C., Poganik, J. R., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+signaling+by+reactive+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Redox signaling by reactive electrophiles and oxidants.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8798-8888 (2018).</li>
<li>Parvez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-REX+on-demand+redox+targeting+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">T-REX on-demand redox targeting in live cells.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2328-2356 (2016).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+electrophile+tagging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Precision electrophile tagging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochemistry. 57 (2), 216-220 (2018).</li>
<li>Van Hall-Beauvais, A., Zhao, Y., Urul, D. A., Long, M. J. C., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-protein-specific+redox+targeting+in+live+mammalian+cells+and+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-protein-specific redox targeting in live mammalian cells and C. elegans.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 10 (3), 43(2018).</li>
<li>Long, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt3+is+a+privileged+first+responder+in+isozyme-specific+electrophile+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Akt3 is a privileged first responder in isozyme-specific electrophile response.</a> Nature Chemical Biology. 13 (3), 333-338 (2017).</li>
<li>Poganik, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wdr1+and+cofilin+are+necessary+mediators+of+immune-cell-specific+apoptosis+triggered+by+Tecfidera%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Wdr1 and cofilin are necessary mediators of immune-cell-specific apoptosis triggered by Tecfidera.</a> Nature Communications. 12 (1), 5736(2021).</li>
<li>Lin, H. -Y., Haegele, J. A., Disare, M. T., Lin, Q., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generalizable+platform+for+interrogating+target-+and+signal-specific+consequences+of+electrophilic+modifications+in+redox-dependent+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A generalizable platform for interrogating target- and signal-specific consequences of electrophilic modifications in redox-dependent cell signaling.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (19), 6232-6244 (2015).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Wakabayashi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1-null+mutation+leads+to+postnatal+lethality+due+to+constitutive+Nrf2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Keap1-null mutation leads to postnatal lethality due to constitutive Nrf2 activation.</a> Nature Genetics. 35 (3), 238-245 (2003).</li>
<li>Huang, K. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Z-REX%3A+Shepherding+reactive+electrophiles+to+specific+proteins+expressed+either+tissue-specifically+or+ubiquitously%2C+and+recording+the+resultant+functional+electrophile-induced+redox+responses+in+larval+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Z-REX: Shepherding reactive electrophiles to specific proteins expressed either tissue-specifically or ubiquitously, and recording the resultant functional electrophile-induced redox responses in larval fish.</a> Nature Protocols. , (2023).</li>
<li>Long, M. J. C., Assari, M., Aye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiding+in+plain+sight%3A+The+issue+of+hidden+variables%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Hiding in plain sight: The issue of hidden variables.</a> ACS Chemical Biology. 17 (6), 1285-1292 (2022).</li>
</ol>

Isoform-specifieke klein-molecuul kinaseremmers, waarvan de ontdekking mogelijk werd gemaakt door REX-technologieën, zijn ingediend voor octrooiaanvraag

Z-REX beschreven in dit protocol demonstreert een robuuste strategie voor elektrofiel-doelpaaronderzoek en signaalwegdeconvolutie in levende vissen. De op nabijheid gerichte toediening maakt dosering en ruimtelijke controle van de elektrofiele samengestelde behandeling mogelijk. In tegenstelling tot conventionele bolusdoseringsmethoden, waarbij de suprafysiologische concentraties van elektrofiel die worden ingezet vaak leiden tot off-target problemen, maakt de relatief kleine hoeveelheid elektrofiel die aan het systeem wordt vrijgegeven Z-REX grotendeels niet-invasief. We hebben 0,1-6 μM Ht-PreHNE (alkyn) gebruikt in zebravisembryo's en de resultaten toonden aan dat de behandeling niet schadelijk is voor de embryo-ontwikkeling11.
De Z-REX-procedure is over het algemeen langer dan T-REX, een techniek voor het screenen/bestuderen van elektrofiele sensoreiwitten in gekweekte cellen. Stel dat het doel van het experiment is om te screenen op elektrofiele-doelinteracties; we raden aan om eerst een uitgebreide screening door T-REX in gekweekte cellen uit te voeren en Z-REX te gebruiken voor in vivo validatie en fenotypische / pathway-analyse. In vergelijking met celkweek zijn de vereisten voor het uitvoeren van Z-REX basistechnieken voor het houden van vissen naast biochemische experimentele vaardigheden die door T-REX worden vereist. Een typisch tijdsbestek voor Z-REX (van viskruising tot licht-induceerbare elektrofiele levering) is 2-3 dagen, wat niet meer dan 1 dag langer is dan de typische tijd voor een T-REX-experiment op getransfecteerde levende cellen. Live beeldvorming voor fenotypische analyse kan 2-10 uur na lichtverlichting worden uitgevoerd; klikkoppeling met biotine-azide voor pull-down assay duurt 3 dagen; qRT-PCR voor het testen van transcriptionele respons duurt 3 dagen; ALS het kleuren duurt 5 dagen. Deze stappen zijn ongeveer vergelijkbaar met hun celkweekequivalenten, hoewel de interpretatie van gegevens een goed begrip van visfysiologie en reporterstammen vereist.
Als meervoudig variabele procedure12 zijn voor Z-REX verschillende controlegroepen nodig om onzekerheden in de resultaten uit te sluiten (figuur 1D). Veel voorkomende controlegroepen zijn: (1) alleen DMSO/voertuigbehandeling; (2) sondebehandeling, maar zonder lichtverlichting; (3) lichtverlichting, maar zonder sondebehandeling; (4) P2A-gesplitste constructie, waarbij Halo en de POI afzonderlijk worden uitgedrukt, zodat de nabijheidslevering wordt verbroken; en (5) hypomorfe mutanten, waarvan de elektrofiele detectieresidu(en) gemuteerd is/zijn, zoals Akt3 (C119S)6 en Keap1 (C151S, C273W, C288E)5, die we in eerdere studies hebben gebruikt.
Als downstream-assays western blot-analyse omvatten, moet deyolking vóór de oogst worden uitgevoerd. De dooiereiwitten verminderen de betrouwbaarheid van lysaatconcentratiebeoordelingen en kunnen niet-specifiek binden aan antilichamen. Bij het uitvoeren van levende visbeeldvorming of whole-mount IF-kleuring hebben we ook niet-specifieke fluorescerende signalen in de dooierzak waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van autofluorescerende eiwitten in de dooierzak, of niet-specifieke binding van de antilichamen zelf. Als het autofluorescentiesignaal het signaal verstoort, raden we aan de dooierzak uit te sluiten van kwantificering of verschillende regio's afzonderlijk te kwantificeren. Dechorinatie is noodzakelijk voor het beeldvorming van levende vissen en de if-kleuringstest voor de hele montage. Het chorion kan interfereren met beeldvorming en later met kwantificering / celtelling. Dechorinatie is echter alleen van toepassing op embryo's ouder dan 1 dpf; Jongere embryo's in de blastulatie-/gastrulatie-/segmentatiestadia zijn te kwetsbaar om te worden gedechorioneerd.
Het hier beschreven Z-REX-protocol is gebaseerd op mRNA-gestuurde ectopische POI-expressie. De procedure is snel in vergelijking met het gebruik / genereren van transgene vislijnen. mRNA-gedreven expressie is alomtegenwoordig en van voorbijgaande aard en duurt ten minste 2 dagen voor mRNA's die in dit protocol worden gebruikt. De duur van de expressie zal echter waarschijnlijk in andere gevallen variëren. Deze aanpak biedt dus een snel en meer globaal onderzoeksvenster naar de effecten van een specifieke elektrofiele etiketteringsgebeurtenis, compatibel met verschillende high-throughput / high-content assays. Transgene lijnen met stabiele Halo-POI-expressie in specifieke weefsels zijn ook compatibel met Z-REX11. Dergelijke lijnen worden het best gebruikt wanneer een preciezere vraag moet worden gesteld, bijvoorbeeld wanneer een fenotype in een specifiek orgaan wordt voorspeld op basis van celkweekgegevens, of wanneer screening van mRNA-injectie-experimenten voorspelt dat een specifiek orgaan gevoelig is voor een elektrofiele etiketteringsgebeurtenis. Een hartspecifieke antioxidantresponsinductie via Z-REX werd aangetoond met behulp van Tg (gstp1: GFP; DsRed-P2A-myl7: Halo-TeV-Keap1) vis in onze vorige publicatie11. Het kan ook mogelijk zijn om Z-REX uit te voeren op transgene vissen ouder dan 2 dpf.

Een groot aantal cellulaire signaleringsgebeurtenissen omvat reacties tussen kleine reactieve moleculen (endogeen geproduceerd in de cel of xenobiotica / xenometabolieten, zoals geneesmiddelen) en hun eiwitdoelwit. In veel gevallen kan een substoichiometrisch niveau van dergelijke covalente bindingsgebeurtenissen cellulaire reacties veroorzaken, wat leidt tot veranderingen in bijvoorbeeld ontwikkeling, metabolisme, apoptose en / of immuunrespons1. Het deconstrueren van het werkingsmechanisme (MOA) door specifieke bindingsgebeurtenissen te koppelen aan hun fenotypische gevolgen is echter een uitdaging gebleken. Traditionele bolusdoseringsmethoden waarbij hoge concentraties van de reactieve soorten worden geïntroduceerd, resulteren vaak in een veelheid aan eiwitten die worden gewijzigd, evenals overmatige toxiciteit voor het modelorganisme2. Dergelijke omstandigheden zijn verre van ideaal. Er werd een methode ontwikkeld om deze problemen in celcultuur op te lossen met behulp van precisie gelokaliseerde elektrofiele toediening in een native cellulaire context, genaamd T-REX (targetable reactive electrophiles and oxidants)3. In de tussenliggende jaren is de focus verlegd naar experimenten in hele organismen, die de mogelijkheid bieden om eiwitten in specifieke cellulaire contexten in niet-getransformeerde cellen te bestuderen. Daarom hebben we de techniek uitgebreid om compatibel te zijn met verschillende modellen, waaronder Danio rerio embryomodellen. Hierin presenteren we Z-REX (zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten) (figuur 1).
Om Z-REX te begrijpen, presenteert dit artikel eerst REX-technologieën en hun onderliggende concepten. In de kern modelleren deze technieken endogene fysiologische reactieve elektrofiele soorten (RES) signalering door na te bootsen hoe natuurlijke elektrofielen lokaal in vivo worden geproduceerd met spatiotemporale precisie. Het eiwit van belang (POI) wordt uitgedrukt als een fusieconstruct tot Halo; de laatste verankert de weefseldoorlatende en inerte sonde met de gefotografeerde RES in een 1:1 stoichiometrie. Een van die endogene RES is 4-hydroxynonenal (HNE hierna), die is gefotografeerd in de sonde Ht-PreHNE. In veel gevallen gebruiken we een alkyne-gefunctionaliseerde versie van HNE [d.w.z. HNE (alkyne)], die in wezen identieke biologische eigenschappen heeft als HNE, maar kan worden gelabeld door klikchemie. De sonde, die ook is gefunctionaliseerd met een chlooralkaan voor reactiviteit met Halo, wordt aangeduid als Ht-PreHNE (alkyn). Het complex van de Halo-POI-fusie en de aldus gevormde sonde maakt proximale afgifte van RES aan de gesmolten POI mogelijk bij bestraling met UV-licht. Als de POI snel reageert met het vrijgekomen RES, stelt de resulterende covalente labeling van de POI met RES ons in staat om kinetisch bevoorrechte cysteïnes te identificeren.
Z-REX neemt de bovengenoemde voordelen van REX-technologieën en past ze breed toe om specifieke signaalroutes in levende vissen te bestuderen. Dit protocol is geoptimaliseerd voor zebravissen (D. rerio), omdat het genetisch traceerbare gewervelde organismen zijn die transparant zijn tijdens de ontwikkeling, en dus ideaal voor optochemische / genetische technieken zoals REX-technologieën. Niettemin zal een soortgelijke strategie waarschijnlijk ook goed werken bij andere genetisch verhandelbare vissoorten, aangezien de brede toepasbaarheid van de methode te wijten is aan het pseudo-intramoleculaire mechanisme van lipide-afgeleide elektrofiele (LDE) levering. De procedure is inderdaad zeer biocompatibel, omdat vissen gedurende ten minste 48 uur kunnen worden behandeld met de Z-REX-gefotografeerde elektrofiel [bijv. Ht-PreHNE (alkyne)] zonder merkbare gevolgen voor de ontwikkeling. Een soortgelijk protocol functioneert in C. elegans 4,5.
Het protocol beschrijft eerst het gebruik van mRNA-injectie om een voorbijgaande expressie van een niet-inheemse Halo-POI-fusieconstruct te produceren in embryonale zebravismodellen, 1-1,5 dagen na de bevruchting (dpf). Dit resulteert in de expressie van het ectopische eiwit in de meerderheid van de cellen in de vis (hierna 'alomtegenwoordig' genoemd), in plaats van in specifieke weefsels of locaties; uit de gegevens blijkt echter dat in bepaalde gevallen celspecifieke effecten kunnen worden waargenomen. Na injectie worden de embryo's geïncubeerd met een lage concentratie [0,3-5 μM Ht-PreHNE(alkyne)] van de sonde gedurende maximaal 30,5 uur na de bevruchting (hpf). Vervolgens wordt op een door de gebruiker voorgeschreven tijdstip de levering van het RES aan de POI in vissen bereikt door fotouncaging gedurende 2-5 minuten. Na fotouncaging van de RES kan een verscheidenheid aan downstream fenotypische assays worden uitgevoerd gedurende de volgende 2-10 uur: 1) live beeldvorming van reporterlijnen (figuur 2A); 2) beoordeling van de doeletikettering door middel van western blot-analyse (figuur 3); 3) transcriptomische analyse (figuur 4); of 4) immunofluorescentie in de gehele montage (figuur 5).
Als voorbeeld van live imaging van reporterlijnen wordt Z-REX gedemonstreerd in combinatie met live imaging van vislijnen, Tg (lyz: TagRFP) en Tg (mpeg1: eGFP), om te meten hoe RES-modificatie van een specifieke elektrofiele sensor-POI (namelijk Keap1) respectievelijk neutrofielen- en macrofaagniveaus verlaagt, zonder waarneembare effecten op andere cellen in de vis. We hebben echter eerder aangetoond dat de POI-labeling en de daaruit voortvloeiende routesignalering van T-REX-studies kunnen worden gereproduceerd met Z-REX voor verschillende eiwitten: Akt3 6, Keap17 en Ube2v26. Over het algemeen kunnen wetenschappers met Z-REX de gevolgen bestuderen van covalente modificatie van POI's door RES in de context van verschillende complexe redoxroutes. Deze techniek is klaar om doelen en hun functionele residuen te lokaliseren voor covalent medicijnontwerp en nieuwe medicijnmechanismen in een meer contextueel relevant model voor het hele dier.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>1.5-mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C-S</td><td></td></tr><tr><td>10-cm Petri dishes</td><td>Celltreat</td><td>229692</td><td></td></tr><tr><td>2-mL microcentrifuge tube</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C-S</td><td></td></tr><tr><td>30% Acrylamide and bis-acrylamide solution</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Celltreat</td><td>229506</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>A/0600/15</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>GoldBio</td><td>A201-100</td><td></td></tr><tr><td>All Blue Prestained Protein Standards</td><td>BioRad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-dPEG11-azide</td><td>Quanta Biodesign</td><td>102856-142</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Dye</td><td>BioRad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>VWR</td><td>HARV30-00200</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Supelco, Inc</td><td>1.02445.1000</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Cu(TBTA)</td><td>Lumiprobe</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>CuSO4</td><td>Sigma</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-mouse-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150107</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rabbit-Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150075</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>Donkey anti-rat-AlexaFluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175475</td><td>1:1000 (IF)</td></tr><tr><td>ECL substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>ECL-Plus substrate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32132</td><td></td></tr><tr><td>End-to-end rotator</td><td>FinePCR</td><td>Rotator AG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td></td></tr><tr><td>Forceps (blunt)</td><td>self made</td><td></td><td>self made by blunting sharp forceps (Fine Science Tools, Dumont #5, 11252-40)</td></tr><tr><td>Forceps (sharp)</td><td>Fine Science Tools</td><td>Dumont #5, 11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Gel loading tip</td><td>Fisher</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Gel/blot imager</td><td>Vilber</td><td>Fusion FX imager</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads</td><td>Sigma</td><td>45-G1145</td><td></td></tr><tr><td>Glass stage micrometer</td><td>Meiji Techno.</td><td>MA285</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated FBS</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Heated ultrasonic bath</td><td>VWR</td><td>89375-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>High capacity streptavidin agarose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20359</td><td></td></tr><tr><td>Ht-PreHNE alkyne probe</td><td>self-made</td><td>-</td><td>Parvez, S. et al. T-REX on-demand redox targeting in live cells. Nat Protoc. 11 (12), 2328-2356, (2016).</td></tr><tr><td>Imaging plate (10% HBSS buffer, for live embryos)</td><td></td><td></td><td>Made with Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer</td></tr><tr><td>Imaging plate (PBS, for formaldehyde-fixed embryos)</td><td></td><td></td><td>Made with Petri dish, and 2% agarose in PBS</td></tr><tr><td>Injection plate</td><td></td><td></td><td>Made with microinjection mold, Petri dish, and 2% agarose in 10% HBSS buffer</td></tr><tr><td>LDS</td><td>Apollo</td><td>APOBI3331</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR</td><td>20864.32</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection mold</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td></td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Microscope for micro-injection</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>Microscope light source</td><td>Olympus</td><td>&nbsp;KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M3516</td><td></td></tr><tr><td>mMessage mMachine SP6 Transcription Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti- &beta;-actin-HRP</td><td>Sigma</td><td>A3854</td><td>1:20000 (WB)</td></tr><tr><td>Mouse anti-HaloTag</td><td>Promega</td><td>G921A</td><td>1:500 (IF)</td></tr><tr><td>Multi-mode reader</td><td>BioTek Instruments</td><td>Cytation 5</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic acid agarose gel electrophoresis apparatus</td><td>Biorad</td><td>Mini-Sub Cell GT Systems</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)20</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>customized: (dT)20</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>Sigma</td><td>O3756</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-2XHA-P2A-TeV-Keap1-2xHA&nbsp;</td><td>self-cloned</td><td>-</td><td>Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL</td></tr><tr><td>pCS2+8 Halo-TeV-Keap1-2xHA</td><td>self-cloned</td><td>-</td><td>Available from Prof. Yimon AYE's group at EPFL</td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>WPI</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>Protein electrophoresis equipment and supplies</td><td>Biorad</td><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-active Caspase-3</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>559565</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Rat anti-HA-HRP</td><td>Sigma</td><td>H3663</td><td>1:500 (IF and WB)</td></tr><tr><td>Rat anti-RFP</td><td>ChromoTek</td><td>5F8</td><td>1:800 (IF)</td></tr><tr><td>Refrigerated centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>RNAseOUT recombinant ribonuclease inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>RnaseZap RNA decontamination solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rocking Shaker</td><td>DLAB</td><td>SK-R1807-S</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Teknova</td>

monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - z-rex ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Monitoring On-Target Signaling Responses in Larval Zebrafish - Z-REX Unmasks Precise Mechanisms of Electrophilic Drugs and Metabolites

Reactieve metabolieten en gerelateerde elektrofiele geneesmiddelen behoren tot de meest uitdagende kleine moleculen om te bestuderen. Conventionele benaderingen om het werkingsmechanisme (MOA) van dergelijke moleculen te deconstrueren, maken gebruik van bulkbehandeling van experimentele exemplaren met een overmaat van een specifieke reactieve soort. In deze benadering maakt de hoge reactiviteit van elektrofielen niet-discriminerende etikettering van het proteoom op een tijd- en contextafhankelijke manier; Redoxgevoelige eiwitten en processen kunnen ook indirect en vaak onomkeerbaar worden beïnvloed. Tegen een dergelijke achtergrond van talloze potentiële doelwitten en indirecte secundaire effecten blijft het koppelen van fenotype aan specifieke doelbetrokkenheid een complexe taak. Zebravissen gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) - een on-demand reactief-elektrofiel toedieningsplatform aangepast voor gebruik in larvale zebravissen - is ontworpen om elektrofielen af te leveren aan een specifiek eiwit van belang (POI) in anders onverstoorbare levende visembryo's. Belangrijke kenmerken van deze techniek zijn een laag niveau van invasiviteit, samen met doserings-, chemotype- en spatiotemporeel gecontroleerde precisie-elektrofiele toediening. Dus, in combinatie met een unieke reeks controles, omzeilt deze techniek off-target effecten en systemische toxiciteit, anders waargenomen na ongecontroleerde bulkblootstelling van dieren aan reactieve elektrofielen en pleiotrope elektrofiele geneesmiddelen. Door gebruik te maken van Z-REX kunnen onderzoekers een voet aan de grond krijgen in het begrijpen van hoe individuele stressreacties en signaleringsoutputs worden veranderd als gevolg van specifieke reactieve ligandbetrokkenheid met een specifieke POI, onder bijna fysiologische omstandigheden bij intacte levende dieren.

Live beeldvorming van met Z-REX behandelde transgene neutrofielen/macrofaag reporter vissen, Tg(lyz:TagRFP) en Tg(mpeg1:EGFP). Inductie van neutrofielen/macrofaag apoptose door Keap1 HNEylatie. (Zie ook figuur 2). Het effect van elektrofiele etikettering van Keap1 op neutrofielen- en macrofaagniveaus werd beoordeeld door heterozygote transgene embryo's afgeleid van Tg (lyz: TagRFP) of Tg (mpeg1: EGFP) te injecteren met mRNA dat codeert voor Halo-Keap1 en vervolgens te behandelen met Ht-PreHNE (alkyn). Volgens de procedures voor stap 6.1-downstream assay werd optie 1-HNE(alkyn) vrijgegeven en werd Keap1 gelabeld. Neutrofielen- en macrofaagniveaus werden beoordeeld door live beeldvorming van reporterlijnen, respectievelijk Tg (lyz: TagRFP) en Tg (mpeg1: eGFP). Het niveau van beide celtypen daalde met 30%-40% na Z-REX-behandeling, waarbij HNE aan Keap1 werd geleverd. Integendeel, er werd geen verlies van neutrofielen of macrofagen waargenomen in de technische controlegroepen van Z-REX [zonder licht en Ht-PreHNE (alkyn), licht alleen, of Ht-PreHNE (alkyn) alleen] (figuur 1D en figuur 2A-D).
De inductie van neutrofielen/macrofaag apoptose duidde op een succesvolle HNE-toediening aan Keap1 via Z-REX. Details voor de routeanalyse en het apoptosemechanisme zijn gepubliceerd5. Om rekening te houden met off-target effecten van HNE(alkyne) werden verschillende controles gebruikt. (1) Onder dezelfde experimentele omstandigheden werden embryo's in plaats van Halo-TeV-Keap1-mRNA geïnjecteerd met Halo-P2A-Keap1-mRNA. P2A linker maakte het mogelijk om de Halo en Keap1 eiwitten onafhankelijk van elkaar tot expressie te brengen. In dit scenario kon HNE(alkyne) vrijgegeven uit Halo Keap1 niet labelen, omdat het niet langer proximaal was aan Halo (Figuur 1D); vandaar dat de apoptose-signaleringsroute niet werd geactiveerd. In deze groep werden geen veranderingen in macrofaag- of neutrofielenspiegels waargenomen (figuur 2A,B). (2) Dezelfde experimentele omstandigheden werden uitgevoerd met behulp van mRNA-codering halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E), een mutant van Keap1 die niet reageert op HNE (alkyn) (figuur 1D). Er werden geen veranderingen in macrofaag- of neutrofielenspiegels waargenomen (figuur 2G,H).
Biotine azide-klik koppeling en biotine pull-down assay. Beoordeling van doeletikettering. (Zie ook figuur 3). De beoordeling van de doeletikettering werd uitgevoerd met behulp van WT-embryo's, geïnjecteerd met mRNA-codering van Halo-TeV-Keap1-2xHA (Halo-POI-fusieconstruct) of Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA (P2A-gesplitste constructie, waarin Halo en Keap1 niet zijn gefuseerd; Figuur 1D). Gelabeld Keap1-eiwit werd alleen naar beneden getrokken in de groep die fusie-eiwit tot expressie bracht en behandeld met Z-REX (tweede rijstrook in de bovenste anti-HA-vlek), maar niet in andere controlegroepen (geen mRNA-injectie, fusieconstruct zonder Z-REX of P2A-gesplitst construct). De resultaten geven aan dat de HNE (alkyn) met succes aan Keap1 werd geleverd, en de gemodificeerde Keap1 werd vervolgens geconjugeerd met biotine door klikreactie, en de biotine-gelabelde Keap1 werd naar beneden getrokken door streptavidinehars.
Transcriptionele analyse. RNA-seq en qRT-PCR. (Zie ook figuur 4). De transcriptionele verandering na behandeling met Z-REX werd beoordeeld met RNA-seq en qRT-PCR. In RNA-seq werden verschillende immuungerelateerde genen na Z-REX gedownreguleerd. Daarentegen werden veel antioxidantrespons (AR) -gerelateerde genen geupreguleerd na Z-REX, wat het gevolg was van de inductie van de Keap1-Nrf2-AR-route bij HNEylatie op Keap110 (figuur 4A). In qRT-PCR-analyse werden vergelijkbare resultaten gevonden bij het analyseren van drie immuungerelateerde genen (lyz, mpeg1.1 en coro1a) (figuur 4B). De op- en neergaande regulatie van de respectievelijke genen toonde de succesvolle inductie van routes gemedieerd door Keap1 HNEylatie.
Whole-mount (co-)immunofluorescentie kleuringstest en colokalisatieanalyse. (Zie ook figuur 5). De exogene Halo-TeV-Keap1-2xHA en Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA expressie werden beoordeeld door middel van whole-mount immunofluorescence (IF) kleuring (Figuur 5A,B). De P2A-split-construct had twee keer het aantal HA-tags dan de TeV-fusion-construct, wat overeenkomt met een tweevoudig hoger anti-HA-signaal in de P2A-split-construct-mRNA-geïnjecteerde groep dan de andere, wat aangeeft dat het expressieniveau van de twee constructen vergelijkbaar was (figuur 5C). De expressieniveaus van de Halo-TeV-Keap1 (wt) en Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) werden ook vergelijkbaar gevonden bij het onderzoeken met anti-Halo (Figuur 5D, E). Colocalisatie van neutrofielen en actief caspase 3 in met Z-REX behandelde Tg(lyz:TagRFP) werd waargenomen door co-immunostaining met anti-RFP en anti-actief-Caspase 3 (figuur 5F). Active Caspase 3 is een indicator van apoptosegebeurtenissen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig01.jpg"> Figuur 1: Z-REX workflow. (A,B) Een 1-4 celstadium zebravis embryo wordt geïnjecteerd met (morfolino en) mRNA dat codeert voor Halo-POI (bijv. Halo-Keap1). Geïnjecteerde embryo's worden vervolgens behandeld met een sonde bestaande uit een HaloTag-ligand en een gefotocaged elektrofiel aangevuld met een alkyn-functionele groep, zoals Ht-PreHNE (alkyn) in B. Na het verwijderen van de overtollige hoeveelheid sonde, wordt het embryo blootgesteld aan licht om de elektrofiel van belang vrij te maken [bijv. HNE of zijn analoog, HNE (alkyne)]. De downstream-analyse wordt uitgevoerd op een bepaald/door de gebruiker gedefinieerd tijdstip. (C) Ontwerp en mechanisme van de Ht-PreLDE-sonde, die van toepassing is op verschillende lipide-afgeleide elektrofielen (LDE). (D) Negatieve/technische controlegroepen voor Z-REX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig02.jpg"> Figuur 2: Live beeldvorming van transgene neutrofielen/macrofaag reporter vissen onderworpen aan Z-REX. Z-REX-gemedieerde Keap1 HNEylatie induceert neutrofielen/macrofaag apoptose. (A) Representatieve beelden van Tg(lyz:TagRFP )-vissen die ofwel Halo-TeV-Keap1 (fusieconstruct) of Halo-P2A-Keap1 (gesplitste constructie) tot expressie brengen, en onderworpen zijn aan negatieve controleomstandigheden [geen behandeling, licht alleen, of Ht-PreHNE(alkyn) alleen of Z-REX]. Embryo leeftijd: 36 hpf. (B) Kwantificering van neutrofielenniveaus in A. (C) Representatieve beelden van Tg(mpeg1:eGFP) -vissen die Halo-TeV-Keap1 met of zonder Z-REX-behandeling tot expressie brengen. Embryo leeftijd: 34 hpf. (D) Kwantificering van macrofaagniveaus in C. (E,F) Tijdsverloopmeting van (E) neutrofielen en (F) macrofaagniveaus na behandeling met Z-REX. (G) Vergelijkbaar experiment als in A bij vissen die ofwel Halo-TeV-Keap1 (WT) ofwel Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) tot expressie brengen, een mutant die geen HNE-detectievermogen heeft. (H) Kwantificering van neutrofielenniveaus in G. Schaalstaven: 500 μm. Alle grafieken worden gepresenteerd met gemiddelde ± SEM. p-waarden werden berekend met eenrichtings-ANOVA (blauw) en tweezijdige Student's t-test (zwart). Dit cijfer is aangepast van Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig03.jpg"> Figuur 3: Biotine pull-down assay. WT-embryo's die Halo-TeV-Keap1-2XHA of Halo-2XHA-P2A-Keap1-2XHA tot expressie brengen, werden behandeld met Z-REX of respectievelijke negatieve controleomstandigheden (in dit geval geen sondebehandeling). Na de oogst werden embryo's gelyseerd en behandeld met TeV-protease vóór de biotine pull-down assay. De resultaten werden geanalyseerd door western blotting. Dit cijfer is aangepast van Huang et al. Z-REX: het begeleiden van reactieve elektrofielen naar specifieke eiwitten die weefselspecifiek of alomtegenwoordig tot expressie komen, en het registreren van de resulterende functionele elektrofiele geïnduceerde redoxreacties bij larvale vissen. Dit cijfer is aangepast van Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig04.jpg"> Figuur 4: Transcriptionele analyse. (A) RNA-seq resultaten van Z-REX-behandelde versus niet-behandelde embryo's. Statistisch significante differentieel tot expressie gebrachte (SDE) genen worden gemarkeerd. Immuniteitsgerelateerde SDE-genen zijn rood gekleurd. Antioxidant response (AR)-gerelateerde genen zijn groen gekleurd. Andere SDE-genen zijn blauw gekleurd. Alle p-waarden werden berekend met CuffDiff. (B-D) Drie immuniteitsgerelateerde SDE-genen van A: (B) lyz, (C) mpeg1.1 en (D) coro1a werden verder geanalyseerd met qRT-PCR, en alleen de met Z-REX behandelde embryo's toonden de onderdrukking van deze transcripten. Alle grafieken worden gepresenteerd met gemiddelde ± SEM. p-waarden werden berekend met eenrichtings-ANOVA (blauw) en tweezijdige Student's t-test (zwart). Dit cijfer is aangepast van Poganik et al.7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64846/64846fig05.jpg"> Figuur 5: Whole-mount immunofluorescentie kleuringstest . (A,B) Representatieve beelden van embryo's die ofwel (A) Halo-TeV-Keap1-2xHA of (B) Halo-2xHA-P2A-Keap1-2xHA immunogekleurd met anti-HA en secundair antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor568 tot expressie brengen. mRNA-geïnjecteerde vissen werden vergeleken met leeftijdsgematchte niet-geïnjecteerde vissen. (C) Kwantificering van het anti-HA-signaal in (A,B). D) Representatieve beelden van embryo's die Halo-TeV-Keap1 (WT) of Halo-TeV-Keap1 (C151S, C273W, C288E) immunogekleurd met anti-Halo en secundair antilichaam geconjugeerd met AlexaFluor647 tot expressie brengen. mRNA-geïnjecteerde vissen werden vergeleken met leeftijdsgematchte niet-geïnjecteerde vissen. (E) Kwantificering van het anti-halosignaal in D. p-waarden werden berekend met de tweezijdige Student's t-test. f) Tg(lyz:TagRFP) -embryo's die aan Z-REX werden onderworpen, werden co-immunogekleurd met anti-RFP en anti-actief Caspase 3 en respectievelijke fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen. Het witte vak markeert het vergrote gebied. Witte pijlen duiden op colocalisaties van neutrofielen en actieve Caspase 3. Schaalstaven: 500 μm. Alle grafieken worden weergegeven met gemiddelde ± SEM. Dit cijfer is aangepast van Poganik et al.7. en Huang et al.11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/64846fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: Lijst van buffers die in dit onderzoek zijn gebruikt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64846/Supplementary%20Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Zebravis gericht op reactieve elektrofielen en oxidanten (Z-REX) is een op chemische biologie gebaseerde methode voor het onderzoek van reactieve signalering van kleine moleculen. Deze techniek kan worden toegepast op levende vissen van verschillende ontwikkelingsstadia. Hier koppelen we standaardtests in zebravissen aan Z-REX voor signaalrouteanalyse.

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Reactive metabolites and related electrophilic drugs are among the most challenging small molecules to study. Conventional approaches to deconstruct the ...

En dus kunnen onderzoekers met behulp van Z-REX onderzoeken hoe individuele signaalreacties worden veranderd als reactie op een specifiek reactief ligand dat zich bezighoudt met een specifiek eiwit dat van belang is in bijna fysiologische omstandigheden in zebravislarven. Conventionele methoden zoals bulkdosisreactieve kleine moleculen veroorzaken doelwitten en toxiciteit en geven geen controle over de specificiteit van liganddoelen. Z-REX kan een specifieke ligand target engagement koppelen aan een specifiek fenotype met een hoge spatiotemporale precisie.We hebben onlangs aangetoond hoe een reactieve metaboliet HNE, een geassocieerd doelwit en route ontdekt door Z-REX, de ontwikkeling van precisie-isovormspecifieke kinaseremmers tegen triple-negatieve borstkankers mogelijk maakt. Begin met het uitlijnen van de embryo's in de groeven van een injectieplaat gevuld met verse 10% Hank's gebalanceerde zoutoplossing of HBSS. Dompel de naaldpunt onder in het medium en breng indien nodig injectiepulsen aan om luchtbellen in de punt te verwijderen Voor het injecteren van het embryo, penetreert u het chorion en de dooierzak in één beweging en brengt u een injectiepuls aan.Na het injecteren van de andere embryo's, spoel ze in een nieuwe petrischaal met verse HBSS-media met behulp van een spuitfles. Bundel de niet-geïnjecteerde embryo's in een andere plaat. Om de Z-REX-behandelingsanalyse uit te voeren, begint u met het verdelen van de geïnjecteerde embryo's in schalen van 10 centimeter.Vervang in een donkere ruimte met rood licht het medium door 30 milliliter 10% HBSS met of zonder één micromolair van de REX-sonde. Incubeer de embryo's bij 28,5 graden Celsius in het donker. Vervang 30 uur na de bevruchting de media in het donker.Na twee keer incubatie en mediavervanging te hebben herhaald, stelt u de embryo's bloot aan licht van een voorverwarmde UV-lamp die elke 30 seconden wervelt. Om een fenotypische test uit te voeren, verwijdert u de onbevruchte of dode embryo's van de plaat met de verdoofde embryo's. Verwijder met een scherpe tang het chorion van de embryo's.Monteer de embryo's op een 2% agarose plaat bereid met 10% HBSS medium en observeer onder een stereomicroscoop. Gebruik ImageJ om het neutrofielen- en macrofaagnummer van elke vis te tellen. Selecteer de Freehand Selection en omcirkel de hele vis en kies vervolgens de optie Find Maxima om de fluorescerende cellen te tellen In de huidige studie vertoonden met Z-REX behandelde embryo's een verlies van neutrofielen en macrofagen.Dit effect was afwezig in de onbehandelde groepen. De apoptose-signaalroute werd niet geactiveerd in de Halo-P2A-Keap1-groep, wat resulteerde in ongewijzigde macrofaag- en neutrofielenniveaus. Vergelijkbare resultaten werden ook waargenomen bij de Halo-TEV-Keap1-mutant die niet reageerde op de HNE.Transcriptionele en real-time kwantitatieve PCR-analyses toonden downregulatie van immuungerelateerde genen en upregulatie van antioxidantgenen na Z-REX. Immunofluorescentiekleuring toonde aan dat de P2A-split-construct twee keer meer HA-tags had dan de TeV-fusie-construct, wat wijst op vergelijkbare expressieniveaus. De expressieniveaus van het wildtype en het mutante type Halo-TeV-Keap1 waren ook vergelijkbaar.In de met Z-REX behandelde transgene neutrofielenreporterlijn werd ook colocalisatie van neutrofielen en actief caspase 3 waargenomen. Het belangrijkste is om uw documenten correct in te stellen. Beperken zal je resultaten echt verbeteren.We hebben Z-REX geadopteerd, een idee voor een platform voor geneesmiddelenscreening dat bekend staat als Localis-REX. Geen enkele andere techniek is tot nu toe in staat geweest om zo'n lokale specifieke en reactieve ligand- of doelkartering te bereiken. Het heeft ons geholpen om elektrofiele kandidaat-geneesmiddelen te ontwikkelen voor de behandeling van borstkanker.Gezien het groeiende belang van gelokaliseerde signalering op vele gebieden, kanker, immunologie, veroudering, enzovoort, belooft Z-Rex, het enige hulpmiddel dat in staat is om de gelokaliseerde reactieve ligandgerichte gebeurtenissen in kaart te brengen, tal van velden te helpen.

monitoring-on-target-signaling-responses-larval-zebrafish-z-rex

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier beschreven is een protocol voor de semi-geautomatiseerde beeldvorming van weefsel-specifieke fluorescentie in zebravis embryo's.

Semi-geautomatiseerde beeldvorming van Tissue-specifieke fluorescentie in zebravis embryo&#39;s

De zebravis is een uitstekend experimenteel organisme om gewervelde ontwikkelingsprocessen en model menselijke ziekten te bestuderen. Hier, een protocol over hoe je een handmatige high-throughput chemische scherm presteren in de zebravis embryo's met een beschrijven we whole-mount in situ hybridisatie (WISH) uitgelezen.

A Manual Small Molecule Screen Naderend High-throughput Met behulp van zebravis embryo&#39;s

We presenteren een methode voor de elektroretinografische (ERG) analyse van zebravislarven met behulp van micromanipulatie en elektroretinografietechnieken. Dit is een eenvoudige en duidelijke methode voor het testen van de visuele functie van zebravislarven in vivo.

Electroretinogram Analyse van de Visual Response in zebravis Larven

Hier presenteren we een protocol te onderzoeken larvale zebravis en fathead minnow motorische activiteiten en photomotor Reacties (PMR) met behulp van een geautomatiseerd tracking-software. Wanneer opgenomen in algemene toxicologie bioassays, geven analyses van deze gedragingen een diagnostisch instrument om te onderzoeken van chemische topicale. Dit protocol wordt beschreven met behulp van cafeïne, een neurostimulant model.

Experimentele Protocol voor de behandeling van de gedragsmatige reactie profielen in larvale vissen: toepassing op de Neuro-stimulerende cafeïne

Hier presenteren we een protocol voor de ontwikkeling en de karakterisering van een zebravismodel van epilepsie als gevolg van de voorbijgaande remming van het DEPDC5-gen.

Gedrags- en fysiologische analyse in een zebravismodel van epilepsie

Zebravis embryo's worden gebruikt voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen. Ze ontwikkelen zich extern en zijn gevoelig voor chemicaliën, waardoor subtiele fenotypische veranderingen kunnen worden opgespoord. Het experiment vereist slechts een kleine hoeveelheid stof, die direct wordt toegevoegd aan de plaat die embryo's bevat, waardoor het testsysteem efficiënt en kosteneffectief is.

Snelle evaluatie van de toxiciteit van chemische verbindingen met behulp van zebravis embryo's

Hier beschrijven we de synthese van door drugs geladen liposomen en hun micro-injectie in larve zebravissen met als doel de levering van geneesmiddelen aan macrofaagcellen te richten.

Targeting Drugs aan Larvale Zebrafish Macrofagen door injecterendrug-loaded Liposomen

We beschrijven de workflow en data-analyse van een screeningssysteem voor het evalueren van de toxiciteit van chemische verbindingen op basis van de schrikreactie van zebravisembryo's. Het systeem registreert de bewegingen van zebravisembryo's bij blootstelling aan een trillingsstimulus en maakt een geïntegreerde evaluatie van algemene toxiciteit/letaliteit en neuromusculaire toxiciteit mogelijk.

Evaluatie van de toxiciteit van chemicaliën met behulp van een Zebrafish Vibration Startle Response Screening System

Dit protocol beschrijft een screeningprocedure voor geneesmiddelen bij zebravislarven 3-7 dagen na de bevruchting, gevolgd door morfologische beoordeling.

Screening van kleine moleculen en toxiciteitstesten bij zebravislarven in een vroeg stadium

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer de Z-REX-methode om signaalreacties te analyseren in larven van Danio rerio. Deze techniek koppelt specifieke ligand-doelwitinteracties aan fenotypische veranderingen met hoge precisie, wat waardevolle inzichten biedt voor kankeronderzoek.

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten (Video) | JoVE Journal

Monitoring van on-target signaalreacties bij larvale zebravissen - Z-REX ontmaskert precieze mechanismen van elektrofiele geneesmiddelen en metabolieten

Meer video's verkennen