Name: Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T14:15:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: Leer de productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum voor wondgenezing met een vereenvoudigd protocol. Deze methode versnelt de genezing in murine cornea-epitheel en verlaagt kosten voor patiënten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Ya-Lan Chien en Chia-Ying Lee voor de uitstekende technische assistentie, en OnLine English company voor de taalkundige editie. Deze studie werd gedeeltelijk gefinancierd door Chang Gung Medical Research Project (Grant No. CMRPG3L1491).

Het onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen aan het begin van het protocolgedeelte. Alle protocollen en procedures werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki en werden beoordeeld en goedgekeurd door de Chang Gung Medical Foundation Institutional Review Board. Alle vrijwilligers werden geïnformeerd over de aard van deze studie en ondertekenden een geïnformeerd toestemmingsformulier voorafgaand aan hun opname. De verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gehele experimentele procedure zijn weergegeven in figuur 1 en figuur 2, evenals in de materiaaltabel.
1. Bereiding van de materialen die nodig zijn om mACS-oogdruppels te produceren
<ol><li>Bereid 250 ml 10% glyceroloplossing en houd een infusieset van 21 G met vlindervleugels, een spuit van 3 ml zonder naald en zes vacutainerbuizen van 10 ml met heparine 158 USP-eenheden klaar (figuur 1).</li>
	<li>Sluit de bloedafnamenaald van 21 G aan op de spuit van 3 ml en zuig 3 ml 10% glyceroloplossing op in de bereide spuit. OPMERKING: Alle materialen moeten worden gesteriliseerd voordat de naald wordt ingebracht.</li>
	<li>Verdeel de 10% glyceroloplossing achtereenvolgens in de vacutainerbuizen, met ongeveer 0,5 ml 10% glyceroloplossing in elk (figuur 3A). OPMERKING: Vanwege de negatieve druk in de reageerbuis moet de naald er onmiddellijk na het ingaan uitkomen om 3 ml glyceroloplossing gelijkmatig over de zes reageerbuizen te verdelen.</li>
	<li>Steriliseer de huid van de patiënt met 75% alcohol steriele wattenstaafjes. Doorprik de oppervlakkige ader van de bovenste ledematen van de patiënt met de 18 G bloedafnamenaald. Trek in totaal 60-70 ml veneus bloed uit de oppervlakkige ader.</li>
</ol>2. Voorbereiding voor mACS oogdruppels
<ol><li>Injecteer achtereenvolgens 10 ml van het getrokken veneuze bloed in elk van de zes vacutainerbuizen (figuur 3B). OPMERKING: Deze stap is afhankelijk van de onderdruk van het vacuüm om de buizen te vullen. Om verstoring van bloedcellen en hemolyse te voorkomen, mag u geen positieve druk uitoefenen.</li>
	<li>Plaats de zes vacutainerbuizen gedurende 4 uur in de incubator met een constante temperatuur van 37 °C (figuur 3C). OPMERKING: De hypoxische status wordt gehandhaafd en gestabiliseerd door de resterende negatieve druk in een afgesloten buis die glycerol heeft ontvangen.</li>
	<li>Verwijder de buizen na 4 uur uit de incubator en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur bij 3.500 × g .</li>
	<li>Bereid op dit punt de materialen voor mACS-extractie voor, inclusief de gesteriliseerde oogdruppelflessen, een spuit van 3 ml met de naald, een filter van 0,22 μm, een naald van 18 G en een paar steriele handschoenen (figuur 2). OPMERKING: De operatietafel moet worden afgeveegd met 75% alcohol om een aseptische omgeving te garanderen. Het supernatant is na centrifugeren al een halffabricaat van mACS.</li>
	<li>Plaats de zes buizen op het buizenrek en open de doppen na volledige centrifugatie (figuur 3D). OPMERKING: Steriliteit is niet vereist in deze stap.</li>
	<li>Trek steriele handschoenen aan en trek de mACS één voor één uit met een spuit van 3 ml met een naald van 18 G. OPMERKING: Zorg ervoor dat u tijdens deze stap niet de onderste bloedcellaag tekent (figuur 3E).</li>
	<li>Trek de naald eruit, sluit deze aan op het 0,22 μm filter en sluit de 23 G, 1,5 in bloedafnamenaald met de originele 3 ml spuit aan op de uitlaat hieronder (figuur 3F).</li>
	<li>Duw de naald voorzichtig door het filter van 0,22 μm in de voorbereide steriele oogdruppelflessen (figuur 3G).</li>
	<li>Herhaal de bovenstaande stappen totdat alle mACS is gefilterd en opgeslagen in oogdruppelflessen (figuur 3H).</li>
	<li>Bewaar de mACS oogdruppels bij 4 °C voor onmiddellijk gebruik; bewaren bij -20 °C voor langdurige bewaring. OPMERKING: Bewaar ze niet langer dan 2 weken bij 4 °C of langer dan 3 maanden bij -20 °C 9,19.</li>
</ol>3. Ex vivo wondgenezingsmodel van muriene cornea-epitheel
OPMERKING: Het volgende ex vivo diermodel was gebaseerd op eerdere ervaringen van Hung et al. met mechanische verwondingen van het hoornvliesepitheel20. De volgende stappen moeten onder de microscoop worden uitgevoerd om een goed omschreven en consistente cornea-epitheelwond te creëren.
<ol><li>Verdoof de C57BL/6 muizen met 3%-4% isofluraan. Steek de huidbiopsie over het centrale hoornvlies van de muizen, waardoor een ondiepe cirkel op het epitheel achterblijft als een uniforme wondrand. OPMERKING: Wees voorzichtig om oogbolbreuk te voorkomen.</li>
	<li>Debride het cornea-epitheel binnen het bevestigde gebied tot aan de Bowman's laag, met een corneale roestringverwijderaar uitgerust met een 0,5 mm braam.</li>
	<li>Om het ex vivo diermodel van de mechanische hoornvlieswond vast te stellen, oogst je de oogbol en bereid je de cultuur goed voor.<ol><li>Euthanaseer de muizen eerst; Druk vervolgens voorzichtig op de superieure en inferieure orbitale randen van de muizen, breng de punt van de tang over de retrobulbaire ruimte en uit de oogbol en houd deze bij de tang.</li>
		<li>Knip de oogzenuw en het periorbitale zachte weefsel af met een hoornvliesschaar om de oogbol perfect te isoleren.</li>
		<li>Maak een bord met 96 putten met gesmolten was erin. Maak snel een rond gat met behulp van de uiteinden van de tang en wacht vervolgens op stolling.</li>
	</ol></li>
	<li>Bereid de te testen media voor: 0,5% mACS, 0,5% AS ter vergelijking, normale zoutoplossing als negatieve controle en Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). OPMERKING: mACS wordt verkregen met behulp van het hierboven genoemde protocol.</li>
	<li>Voor de ex vivo cultuur plaats je de geoogste oogbol op de voorbereide 96-well plaat. Voeg 200 μL van elk medium toe aan de 96-well plaat.</li>
	<li>Plaats de 96-well kweekplaat in de incubator bij 37 °C met 5% CO2. Zorg ervoor dat de cultuurmedia elke 24 uur worden vervangen.</li>
	<li>Om het sequentiële wondgenezingseffect te bevestigen, controleert u het epitheliale wondgebied elke 8 uur onder de microscoop door fluoresceïnekleuring.<ol><li>Los de fluoresceïne op het fluoresceïnepapier op met een normale zoutoplossing.</li>
		<li>Laat de fluoresceïnekleurstof op het centrale hoornvlies van de muizen vallen en observeer en documenteer het vervolgens onder een microscoop. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 4. OPMERKING: Eén druppel (ongeveer 0,05 ml) fluoresceïnekleurstof is voldoende voor de waarneming.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Fox, R. I., Chan, R., Michelson, J. B., Belmont, J. B., Michelson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beneficial+effect+of+artificial+tears+made+with+autologous+serum+in+patients+with+keratoconjunctivitis+sicca%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Beneficial effect of artificial tears made with autologous serum in patients with keratoconjunctivitis sicca.</a> Arthritis and Rheumatology. 27 (4), 459-461 (1984).</li>
<li>Noble, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+autologous+serum+eye+drops+with+conventional+therapy+in+a+randomised+controlled+crossover+trial+for+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Comparison of autologous serum eye drops with conventional therapy in a randomised controlled crossover trial for ocular surface disease.</a> The British Journal of Ophthalmology. 88 (5), 647-652 (2004).</li>
<li>Bradley, J. C., Bradley, R. H., McCartney, D. L., Mannis, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+growth+factor+analysis+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Serum growth factor analysis in dry eye syndrome.</a> Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (8), 717-720 (2008).</li>
<li>Alshammari, T. M., Al-Hassan, A. A., Hadda, T. B., Aljofan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+serum+sample+extraction+methods+and+their+suitability+for+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Pharmaceutical+Journal%22%5BJournal%5D)">Comparison of different serum sample extraction methods and their suitability for mass spectrometry analysis.</a> Saudi Pharmaceutical Journal. 23 (6), 689-697 (2015).</li>
<li>Tsubota, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+dry+eye+by+autologous+serum+application+in+Sj%C3%B6gren%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Treatment of dry eye by autologous serum application in Sjögren's syndrome.</a> The British Journal of Ophthalmology. 83 (4), 390-395 (1999).</li>
<li>Urzua, C. A., Vasquez, D. H., Huidobro, A., Hernandez, H., Alfaro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+double-blind+clinical+trial+of+autologous+serum+versus+artificial+tears+in+dry+eye+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Randomized double-blind clinical trial of autologous serum versus artificial tears in dry eye syndrome.</a> Current Eye Research. 37 (8), 684-688 (2012).</li>
<li>Cui, D., Li, G., Akpek, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for ocular surface disorders.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 21 (5), 493-499 (2021).</li>
<li>Jirsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+autologous+serum+eye+drops+in+severe+dry+eye+patients%3B+subjective+and+objective+parameters+before+and+after+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The application of autologous serum eye drops in severe dry eye patients; subjective and objective parameters before and after treatment.</a> Current Eye Research. 39 (1), 21-30 (2014).</li>
<li>Pan, Q., Angelina, A., Marrone, M., Stark, W. J., Akpek, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+dry+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for dry eye.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 2 (2), (2017).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+versus+artificial+tear+drops+for+dry+eye+disease%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis+of+randomized+controlled+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops versus artificial tear drops for dry eye disease: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials.</a> Ophthalmic Research. 63 (5), 443-451 (2020).</li>
<li>Soni, N. G., Jeng, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+topical+therapy+for+ocular+surface+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Blood-derived topical therapy for ocular surface diseases.</a> The British Journal of Ophthalmology. 100 (1), 22-27 (2016).</li>
<li>Solomon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((anti-inflammatory+forms+of+interleukin-1+in+the+tear+fluid+and+conjunctiva+of+patients+with+dry-eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+and+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">anti-inflammatory forms of interleukin-1 in the tear fluid and conjunctiva of patients with dry-eye disease.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42 (10), 2283-2292 (2001).</li>
<li>Meijer, H., Reinecke, J., Becker, C., Tholen, G., Wehling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+production+of+anti-inflammatory+cytokines+in+whole+blood+by+physico-chemical+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+Research%22%5BJournal%5D)">The production of anti-inflammatory cytokines in whole blood by physico-chemical induction.</a> Inflammation Research. 52 (10), 404-407 (2003).</li>
<li>Bielory, B. P., Shah, S. P., O'Brien, T. P., Perez, V. L., Bielory, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+therapeutics+for+ocular+surface+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging therapeutics for ocular surface disease.</a> Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology. 16 (5), 477-486 (2016).</li>
<li>Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dry+eye+disease%3A+an+immune-mediated+ocular+surface+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder.</a> Archives of Ophthalmology. 130 (1), 90-100 (2012).</li>
<li>Yang, J., Guo, A., Li, Q., Wu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-rich+plasma+attenuates+interleukin-1%CE%B2-induced+apoptosis+and+inflammation+in+chondrocytes+through+targeting+hypoxia-inducible+factor-2%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+and+Cell%22%5BJournal%5D)">Platelet-rich plasma attenuates interleukin-1β-induced apoptosis and inflammation in chondrocytes through targeting hypoxia-inducible factor-2α.</a> Tissue and Cell. 73, 101646(2021).</li>
<li>Shakouri, S. K., Dolati, S., Santhakumar, J., Thakor, A. S., Yarani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+for+degenerative+diseases+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum for degenerative diseases and prospects.</a> Growth Factors. 39 (1-6), 59-70 (2021).</li>
<li>Gull, M., Pasek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+glycerol+and+its+derivatives+in+the+biochemistry+of+living+organisms%2C+and+their+prebiotic+origin+and+significance+in+the+evolution+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Catalysts%22%5BJournal%5D)">The role of glycerol and its derivatives in the biochemistry of living organisms, and their prebiotic origin and significance in the evolution of life.</a> Catalysts. 11 (1), 86(2021).</li>
<li>Drew, V. J., Tseng, C. L., Seghatchian, J., Burnouf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reflections+on+dry+eye+syndrome+treatment%3A+therapeutic+role+of+blood+products%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Reflections on dry eye syndrome treatment: therapeutic role of blood products.</a> Frontiers in Medicine. 5, 33(2018).</li>
<li>Hung, K. H., Yeh, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+and+in+vivo+animal+models+for+mechanical+and+chemical+injuries+of+corneal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ex vivo and in vivo animal models for mechanical and chemical injuries of corneal epithelium.</a> Journal of Visualized Experiments. (182), e63217(2022).</li>
<li>Geerling, G., Maclennan, S., Hartwig, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+serum+eye+drops+for+ocular+surface+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Autologous serum eye drops for ocular surface disorders.</a> The British Journal of Ophthalmology. 88 (11), 1467-1474 (2004).</li>
<li>Rutgers, M., Saris, D. B., Dhert, W. J., Creemers, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+of+autologous+conditioned+serum+for+treatment+of+osteoarthritis%2C+in+vitro+effects+on+cartilage+metabolism+and+intra-articular+levels+after+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile of autologous conditioned serum for treatment of osteoarthritis, in vitro effects on cartilage metabolism and intra-articular levels after injection.</a> Arthritis Research & Therapy. 12 (3), R114(2010).</li>
<li>Antebi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+physiological+hypoxia+potentiates+the+therapeutic+function+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Short-term physiological hypoxia potentiates the therapeutic function of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 265(2018).</li>
<li>Chen, Y. M., Wang, W. Y., Lin, Y. C., Tsai, S. H., Lou, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+autologous+serum+eye+drops+with+contact+lenses+in+the+treatment+of+chemical+burn-induced+bilateral+corneal+persistent+epithelial+defects%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Use of autologous serum eye drops with contact lenses in the treatment of chemical burn-induced bilateral corneal persistent epithelial defects.</a> BioMed Research International. 2022, 6600788(2022).</li>
<li>Diaz-Valle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+efficacy+of+topical+insulin+with+autologous+serum+eye+drops+in+persistent+epithelial+defects+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Comparison of the efficacy of topical insulin with autologous serum eye drops in persistent epithelial defects of the cornea.</a> Acta Ophthalmologica. 100 (4), e912-e919 (2022).</li>
<li>Metheetrairut, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+epitheliotrophic+factors+in+platelet-rich+plasma+versus+autologous+serum+and+their+treatment+efficacy+in+dry+eye+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Comparison of epitheliotrophic factors in platelet-rich plasma versus autologous serum and their treatment efficacy in dry eye disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 8906(2022).</li>
<li>NaPier, E., Camacho, M., McDevitt, T. F., Sweeney, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+keratopathy%3A+current+challenges+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic keratopathy: current challenges and future prospects.</a> Annals of Medicine. 54 (1), 666-673 (2022).</li>
<li>Garcia-Conca, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+treatment+of+hyposecretory+dry+eye+with+platelet-rich+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of treatment of hyposecretory dry eye with platelet-rich plasma.</a> Acta Ophthalmologica. 97 (2), e170-e178 (2019).</li>
<li>Gholian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+autologous+conditioned+serum+dressings+in+hard-to-heal+wounds%3A+a+randomised+prospective+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Use of autologous conditioned serum dressings in hard-to-heal wounds: a randomised prospective clinical trial.</a> Journal of Wound Care. 31 (1), 68-77 (2022).</li>
<li>Raeissadat, S. A., Rayegani, S. M., Jafarian, N., Heidari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+applications+in+the+treatment+of+musculoskeletal+diseases%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Science+OA%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum applications in the treatment of musculoskeletal diseases: a narrative review.</a> Future Science OA. 8 (2), 776(2022).</li>
<li>Tokawa, P. K. A., Brossi, P. M., Baccarin, R. Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum+in+equine+and+human+orthopedic+therapy%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Veterinary+Science%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum in equine and human orthopedic therapy: A systematic review.</a> Research in Veterinary Science. 146, 34-52 (2022).</li>
<li>Evans, C. H., Chevalier, X., Wehling, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+conditioned+serum.+Physical+Medicine+and+Rehabilitation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Autologous conditioned serum. Physical Medicine and Rehabilitation.</a> Clinics of North America. 27 (4), 893-908 (2016).</li>
<li>Coskun, H. S., Yurtbay, A., Say, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+rich+plasma+versus+autologous+conditioned+serum+in+osteoarthritis+of+the+knee%3A+clinical+results+of+a+five-year+retrospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Platelet rich plasma versus autologous conditioned serum in osteoarthritis of the knee: clinical results of a five-year retrospective study.</a> Cureus. 14 (4), e24500(2022).</li>
</ol>

Alle auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

In deze studie wordt een protocol voor de bereiding van mACS beschreven en wordt het voordeel van mACS oogdruppels bij de wondgenezing van diermodellen verder aangetoond. De cruciale wijziging van dit mACS-protocol is de toevoeging van ongeveer 0,5 ml 10% glyceroloplossing in elke reageerbuis, die geschikte hypoxische omstandigheden creëert tijdens de incubatie van 4 uur bij 37 °C. Deze instelling voorziet de AS van de juiste stress en zet cellen ertoe aan om de nodige groeifactoren af te scheiden die de wondgenezing he...

De therapeutische effecten van autoloog serum (AS) bij droge ogen werden voor het eerst gemeld in de jaren 1980 door Fox et al.1. Er wordt aangenomen dat zowel de smerende eigenschap als de essentiële epitheliotrope biochemische componenten in AS, die natuurlijke tranen nabootsen, de proliferatie van cornea-epitheelcellen ten goede komen. In de afgelopen decennia zijn op basis hiervan verschillende onderzoeken uitgevoerd. Trofische componenten omvatten epidermale groeifactor (EGF), vitamine A, transformerende groeifactor β (TGF-β) en andere cytokines. Interessant is dat het serum rijk is aan TGF-β en vitamine A, waarvan wordt aangenomen dat ze een cruciale rol spelen bij epidermale proliferatie 2,3,4,5. Bovendien hebben verschillende studies bij de behandeling van patiënten met oculaire oppervlakteziekten enkele voordelen van AS-oogdruppels aangetoond in door de patiënt gerapporteerde uitkomsten, andere objectieve droge ogenparameters 6,7 en microscopische bevindingen zoals celdichtheid8. Meta-analyse studies toonden aan dat er enkele voordelen kunnen zijn bij het verbeteren van de syndromen van patiënten met AS-oogdruppelbehandeling, maar langetermijnresultaten en observaties ontbreken nog steeds 9,10.
In tegenstelling tot AS wordt bloedplaatjesrijk plasma (PRP) afgeleid van het toevoegen van een antistollingsmiddel tijdens de bereiding, met verdere differentiële centrifugatie en chemische activering van de bloedplaatjes. In vergelijking met AS zijn tal van chemicaliën en groeifactoren, zoals TGF-β, vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en EGF, aanwezig in PRP. Het is ook toegepast op oculaire oppervlakteziekten met klinische voordelen bij symptoomverlichting11.
Het verband tussen epitheeldefecten en ontsteking is complex. Met name immunopathofysiologie is een ander belangrijk probleem bij oculaire oppervlakteziekten. Pro-inflammatoire cytokines, zoals IL-1β en IFN-γ, worden verondersteld cruciale mediatoren te zijn in inflammatoire cascades12. Nieuwe wegen van behandeling worden dus geopend op basis van het begrijpen van het immuunmechanisme. Strategieën om dit ontstekingsproces te stoppen, waaronder de productie van interleukine-1 receptorantagonist (IL-1Ra) en andere ontstekingsremmende cytokines, kunnen ook een belangrijke rol spelen bij oculaire oppervlakteziekten13,14,15.
Sinds 1998 wordt Orthokine, een gecommercialiseerd autoloog geconditioneerd serum (ACS), klinisch gebruikt bij orthopedische patiënten die lijden aan artrose (OA), reumatoïde artritis (RA) en spinale aandoeningen13. In vergelijking met AS en PRP zijn behandeling met chemisch gecoate glasparels en hypoxische incubatie om monocyten te activeren de specifieke kenmerken van ACS16. Theoretisch kunnen meer ontstekingsremmende factoren worden uitgescheiden door overlevingsstress aan de cellen toe te voegen, wat resulteert in een hogere concentratie van essentiële immuunmodulerende componenten, waaronder IL-1Ra. De verbeterde therapeutische voordelen van ACS bij artrose, vergeleken met AS, zijn ook gemeld17. Oculaire oppervlakteziekten delen in sommige opzichten vergelijkbare immuunachtergronden met orthopedische ontstekingsziekten. Daarom, op basis van de succesvolle resultaten van van menselijk bloed afgeleide therapie op orthopedisch gebied, kan ACS voordelen hebben ten opzichte van conventionele behandelingen in de klinische praktijk door epitheliotrope en immuunmodulerende eigenschappen. Hoewel ACS op grote schaal is gebruikt bij orthopedische ontstekingsziekten, moeten de klinische toepassingen in de oogheelkunde nog worden onderzocht, wat kan worden belemmerd door de hoge kosten, het gebrek aan literatuurondersteuning en het gebrek aan standaardisatie van het voorbereidingsproces, wat resulteert in diverse prestaties.
In dit videoartikel werd een nieuwe, kosteneffectieve en handige methode gedemonstreerd om de gemodificeerde ACS (mACS) of plasma rijk aan groeifactoren (PRGF) te genereren, waardoor een oogdruppeloplossing ontstaat met een vergelijkbare praktische waarde als gecommercialiseerde ACS'en. De belangrijkste ideeën over het toevoegen van anticoagulantia en het triggeren van de bloedcellen om ontstekingsremmende cytokines af te scheiden door gestreste incubatie werden behouden, maar in tegenstelling tot de chemisch geïnduceerde methoden, zoals die op basis van CrSO 4-gecoate glasparels en commerciële kits, wordt de kritieke stressstatus fysiek geïnduceerd door hypoxische incubatie in deze methode. Bovendien werd glycerol toegevoegd om extra voordelen te bieden, waaronder een toename van de stabiliteit van het membraan van bloedcellen, behoud van een goede osmotische extracellulaire vloeistofdruk18 en een geschikte bron van voedingsstoffen in hypoxische omstandigheden die overbelasting van de cellen voorkomen.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;96-wells kweekplaat</td><td>Merck KGaA, Duitsland</td><td>CLS3997</td><td></td></tr><tr><td>Barraquer ooglid spreider</td><td>katena</td><td>K1-5355</td><td>15 mm</td></tr><tr><td>Barraquer naaldhouder</td><td>Katena</td><td>K6-3310</td><td>zonder vergrendeling&nbsp;</td></tr><tr><td>Barron Vacuum Punch 8.0 mm</td><td>katena</td><td>K20-2108</td><td>voor het snijden van filterpapier</td></tr><tr><td>BD 10.0 mL vacutainerbuisjes met heparine 158 USP-eenheden</td><td>Becton, Dickinson and Company, VS</td><td>367880</td><td>Ten minste 6 buisjes, nodig om bloed te verzamelen voor volgende experimenten en om bloedklontering te voorkomen</td></tr><tr><td>BD 21 G vlinder-vleugelinfusieset</td><td>Becton, Dickinson and Company, VS</td><td>367281</td><td>Voor gelijkmatige verdeling van glyceroloplossing</td></tr><tr><td>C57BL/6 muizen&nbsp;</td><td>National Laboratory Animal Center</td><td>RMRC11005</td><td>voor muismodel</td></tr><tr><td>Castroviejo pincet 0.12 mm</td><td>katena&nbsp;</td><td>K5-2500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf, Duitsland</td><td>5811000428</td><td>3.500 x g gedurende 10 min</td></tr><tr><td>Cheng Yi 10.0 mL gesteriliseerde oogdruppelfles</td><td>Cheng Yi Chemical, Taiwan</td><td>CP405141</td><td>Moet steriel zijn en als opslagcontainer voor het eindproduct</td></tr><tr><td>Hoornvliesroestring verwijderaar met 0.5 mm frees</td><td>Algerbrush IITM; Alger Equipment Co., Inc. Lago Vista, TX</td><td>CHI-675</td><td>voor het afdoen van het hoornvliesepitheel</td></tr><tr><td>Dulbecco's gemodificeerd minimaal essentieel medium</td><td>Merck KGaA, Duitsland</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier&nbsp;</td><td>Toyo Roshi Kaisha, Ltd.</td><td>1.11</td><td></td></tr><tr><td>Fluoresceïne natrium oogdruppelstrips U.S.P</td><td>OPTITECH</td><td>OPTFL100</td><td>kleuring voor hoornvliesepitheeldefect&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Firstek, Taiwan</td><td>S300S</td><td>37 &deg;C gedurende 4 uur</td></tr><tr><td>Kanam steriele handschoenen</td><td>Kanam Latex Industries, India</td><td>EN455</td><td>Voor aseptische werking</td></tr><tr><td>Merck 0.22 &micro;m filter</td><td>Merck KGaA, Duitsland</td><td>PR05359</td><td>Ten minste 2 filters voor mACS-filtratie</td></tr><tr><td>Nang Kuang 250 mL 10% glyceroloplossing</td><td>Nang Kuang Pharmaceutical, Taiwan</td><td>19496</td><td>Om een geschikt membraanstabilisatie-effect en extracellulaire osmotische druk voor bloedcellen te bieden</td></tr><tr><td>Normale zoutoplossing</td><td>TAIWAN BIOTECH CO., LTD.</td><td>100-120-1101</td><td></td></tr><tr><td>Huidbiopsie punch 2mm</td><td>STIEFEL</td><td>22650</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Carl Zeiss Meditec, Dublin, CA</td><td>SV11</td><td>microscoop voor chirurgie</td></tr><tr><td>Terumo 18 G naald</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>SMACF0120-18BX</td><td>3.0 mL spuit met 18 G naald om het supernatant na centrifugatie te extraheren</td></tr><tr><td>Terumo 20.0 mL spuit</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>MDSS20ES</td><td>Kan worden gebruikt om serum te verzamelen na de eerste centrifugatie en het te gebruiken voor secundaire centrifugatie.</td></tr><tr><td>Terumo 3.0 mL spuit met de 23 G naald</td><td>Terumo, Taiwan</td><td>MDSS03S2325</td><td>3.0 mL spuit wordt gebruikt om het supernatant na centrifugatie te extraheren. Vervolgens worden de filter en de 23 G naald aangesloten voor injectie in de oogdruppelflesjes.</td></tr><tr><td>Westcott Tenotomy Schaar Medium</td><td>katena</td><td>K4-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel

Production of Modified Autologous Conditioned Serum and Ex Vivo Assessment of Its Healing Potential in Murine Corneal Epithelium

Van menselijk bloed afgeleide topische therapieën zijn de afgelopen decennia een zegen geweest voor clinici. Autoloog serum (AS) en bloedplaatjesrijk plasma (PRP) zijn verrijkt met epitheliotrope groeifactoren die essentieel zijn bij de genezing van hoornvlieswonden. In tegenstelling tot AS is PRP gebaseerd op een differentieel centrifugatiesysteem, wat meer van bloedplaatjes afgeleide groeifactoren oplevert. Autoloog geconditioneerd serum (ACS) behoudt niet alleen de bereiding van AS en PRP, maar richt zich ook op immuunmodulerende eigenschappen, die belangrijk zijn bij ontstekingsziekten.
Het ontbreken van gestandaardiseerde protocollen en hoge voorbereidingskosten zijn beperkingen voor de klinische toepassing van ACS. Dit video-experiment demonstreert een standaard werkwijze voor het bereiden van gemodificeerde autologe geconditioneerde serum (mACS) oogdruppels. Eerst werd glycerol toegevoegd aan heparinespuiten als de bloedcelstabilisator tijdens hypoxische incubatie. Om de bloedcellen te activeren, werd een incubatie van 4 uur bij 37 °C gestart. Vervolgens werden de bloedmonsters gecentrifugeerd bij 3.500 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Na filtratie van het supernatant door een filter van 0,22 μm werden de mACS-oogdruppels volledig voorbereid.
Een voorzichtige try-out van het therapeutische effect van mACS toonde aan dat het concurrentievoordelen kan hebben ten opzichte van conventionele AS in de hoornvlieswondgenezing in ex vivo muizenogen. De AS die in deze studie werd gebruikt, werd opgesteld volgens gepubliceerde studies en de klinische praktijk in ons ziekenhuis. Daarom kan de werkzaamheid van mACS op oculaire oppervlakteziekten in toekomstig onderzoek worden geëvalueerd door middel van in vivo dierstudies en klinische proeven.

Figuur 1 en figuur 2 tonen de materialen die nodig zijn voor het experiment en figuur 3 toont de opeenvolgende stappen en de succesvolle tussenproducten tijdens de bereiding van mACS. Eerst werd 0,5 ml 10% glyceroloplossing toegevoegd aan elke steriele reageerbuis van 10 ml (figuur 3A). Vervolgens werd 60-70 ml veneus bloed van de patiënt verkregen en 10 ml bloed in elke buis geïnjecteerd (<strong class...

Dit artikel beschrijft een protocol om het proces te vereenvoudigen en de bereiding van autoloog geconditioneerd serum (ACS) goedkoper te maken. Er zijn geen speciale spuiten of glasparels met een oppervlaktecoating nodig. Bovendien heeft het gemodificeerde ACS (mACS) concurrentievoordelen ten opzichte van conventioneel autoloog serum in de hoornvlieswondgenezing van muriene ogen ex vivo.

Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel

Human blood-derived topical therapies have been a boon to clinicians in recent decades. Autologous serum (AS) and platelet-rich plasma (PRP) are enriched ...

Dit proces presenteert een innovatief bloedafgeleide, mACS genaamd, dat geen complexe technische verwerking vereist. Het versnelt ook de wondgenezing in grotere mate dan conventioneel autoloog serum. Naast het bieden van een gestandaardiseerd voorbereidingsproces, kan deze techniek ook de kosten van serumoogdruppels verlagen, waardoor de toegang van patiënten tot een meer betaalbare behandelingsoptie wordt verbeterd.Deze techniek kan worden toegepast op gebieden die het bevorderen van wond- of weefselregeneratie, reparatie en ontstekingsremmen vereisen. Deze techniek zal een groot voordeel zijn voor moeilijk te genezen wonden en chronische ontstekingsziekten zoals ernstige oogoppervlakaandoeningen. Injecteer om te beginnen 10 milliliter van het eerder getrokken menselijke veneuze bloed in elk van de zes vacutainerbuizen.Plaats de buizen gedurende vier uur in een incubator bij 37 graden Celsius en centrifugeer de buizen vervolgens gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur op 3.500 G. Decap de buizen nadat je ze op het rek hebt geplaatst. Gebruik na het aantrekken van steriele handschoenen een spuit van drie milliliter uitgerust met een naald van 18 gauge om de mACS uit elke buis te

production-modified-autologous-conditioned-serum-ex-vivo-assessment

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Wij rapporteren een methode voor de fabricage van micropockets binnen electrospun membranen waarin celgedrag te bestuderen. Specifiek beschrijven we een combinatie van microstereolithography en elektrospinnen voor de productie van PLGA (poly (lactide-co-glycolide)) corneale biomateriaal inrichtingen voorzien microfeatures.

Combinatie van Microstereolithography en Electrospinning naar Membranen Uitgerust met Niches voor cornearegeneratie Produce

Een voorbeeld van adenovirale gentherapie in humane diabetische orgaan-gecultiveerde hoornvliezen wordt gepresenteerd met als doel de normalisatie van vertraagde wondgenezing en een duidelijk verminderde expressie van epitheliale stamcelmarkers in deze hoornvliezen. Het beschrijft ook de optimalisering van dit proces in stamcel-verrijkte limbale epitheelculturen.

Adenovirale Gentherapie voor Diabetische keratopathie: Effecten op wondgenezing en Stem Cell Marker Expressie in Human Organ-gekweekte Corneas en Limbale epitheelcellen

Een primaire kweek van runder corneale endotheelcellen werd gebruikt om het mechanisme van corneale endotheel-mesenchymale overgang te onderzoeken. Verder werd een rat hoornvliesendotheel cryoinjury model gebruikt om corneale endotheel-mesenchymale overgang in vivo te demonstreren.

In vitro en in vivo modellen voor de studie van het hoornvlies endotheel-mesenchymale transitie

Een protocol voor een ex vivo hoornvlies orgel cultuur model nuttig voor wond genezing studies wordt beschreven. Dit modelsysteem kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van de drug toxiciteit in een georganiseerde 3D meercellige omgeving of agenten om regeneratieve genezing te bevorderen.

Ex Vivo wondgenezing hoornvlies orgel cultuur Model voor Studies

Hier presenteren we een protocol om hoornvliesendodelialcellen (CEC) los te koppelen van het membraan (DM) van Descemet met behulp van een neodymium:YAG (Nd:YAG) laser als ex vivo ziektemodel voor bullous keratopathie (BK).

Ontwikkeling van een niet-invasieve, laser-assisted experimenteel model van hoornvlies endotheel celverlies

Dit protocol beschrijft de kritieke stappen die nodig zijn om hoornvliesendotheliale celculturen uit explants van menselijk of schapenweefsel vast te stellen en te kweken. Er wordt ook een methode gepresenteerd voor het subculturen van hoornvliescellen op membranous biomaterialen.

Groei van menselijke en schapen hoornvlies endotheliale cellagen op biomateriële membranen

Hier worden diermodellen op basis van muis en konijn ontwikkeld voor mechanisch en chemisch letsel van hoornvliesepitheel om nieuwe therapieën en het onderliggende mechanisme te screenen.

Ex vivo en in vivo diermodellen voor mechanische en chemische verwondingen van cornea-epitheel

Descemet's Stripping Only is een experimentele procedure waarbij patiënten met centrale cornea guttae als gevolg van Fuchs Endothelial Corneal Dystrophy het membraan van Descemet laten strippen voor perifere cellen om de endotheellaag te regenereren. We presenteren een nieuwe methodologie die DSO simuleert in dystrofische menselijke hoornvliezen ex vivo met versnelde genezing gestimuleerd door eFGF1 (NM141).

Een menselijk hoornvliesorgaancultuurmodel van Descemet's strippen alleen met versnelde genezing gestimuleerd door gemanipuleerde fibroblastgroeifactor 1

We ontwikkelden een rattenmodel van ernstige hoornvliesontsteking door middel van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen. De studie evalueerde ontstekingspatronen van het hoornvlies, epitheliale proliferatie en veranderingen in limbale stamcellen onder ontstekingsomstandigheden.

Het opzetten van een model voor ernstige hoornvliesontsteking bij ratten op basis van hoornvliesepitheelcurettage in combinatie met hoornvlieshechtingen

Ex vivo orgaancultuur van het hoornvlies van varkens en epitheliale wondgenezing bieden een economisch, ethisch, reproduceerbaar en kwantitatief middel voor het testen van de oculaire toxiciteit van chemicaliën. Ze helpen ook bij het ophelderen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de regulatie van epithelisatie en weefselherstel, en bij het evalueren van therapieën voor de behandeling van diabetische keratopathie en vertraagde wondgenezing.

Evaluatie van therapeutische en chemische toxiciteit met behulp van orgaangekweekte varkenshoornvliezen en epitheliale wondgenezing

Er wordt een reproduceerbaar protocol gepresenteerd voor de bereiding, verrijking en toepassing van een in situ blauwlicht-crosslinkable gelatine-riboflavine hydrogel voor het herstel van corneale stromale wonden bij konijnen, inclusief procedurele stappen voor chirurgische behandeling, gedeeltelijke tarsorrofie en postoperatieve zorg.

Fabricage en chirurgische toepassing van verrijkte, foto-gekruiste gelatine–riboflavine hydrogels voor herstel van hoornvlieswonden bij konijnen

Leer de productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum voor wondgenezing met een vereenvoudigd protocol. Deze methode versnelt de genezing in murine cornea-epitheel en verlaagt kosten voor patiënten.

Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel (Video) | JoVE Journal

Productie van gemodificeerd autoloog geconditioneerd serum en ex vivo beoordeling van het genezingspotentieel ervan in murine cornea-epitheel

Meer video's verkennen