Visualisatie van metabolieten geïdentificeerd in het ruimtelijke metaboloom van de traditionele Chinese geneeskunde met behulp van DESI-MSI

Dit artikel beschrijft voornamelijk een kosteneffectieve methode voor het bereiden van plantenmonsters en beeldvorming met behulp van DESI-MSI, en kan de nadelen overwinnen die gepaard gaan met droge weefsels, die gemakkelijk breken wanneer stikstof inblaast. De wortel werd gecryosectie op het cryostaatmicrotoom, terwijl het blad werd bereid door bedrukking, wat een dure machine vereist of de signaalintensiteit verliest. Onze methode kan deze beperkingen overwinnen.

Deze methode kan worden gebruikt in ruimtelijke metabolomica van planten, zoals distributie en beweging van toxische stoffen in planten onder abiotische en biotische stress. Neem om te beginnen schoongemaakte wortels en bladeren van een twee jaar oude salvia miltiorrhiza-plant en snijd direct in plakjes met een dwarsdoorsnededikte van ongeveer drie tot vijf millimeter. Plak het monster vervolgens op een hechtingsmicroscoopglasglaasje met dubbelzijdige tape.

Plaats nog een microscoopglasplaat boven het monster en wikkel ze met een afdichtingsfilm zoals een sandwich. Bevries vervolgens het sandwichmonster gedurende ten minste vier uur bij min 80 graden Celsius en onderwerp het vervolgens gedurende twee uur aan een luchtvacuüm met de ingesloten temperatuur op min 75 tot min 82 graden Celsius en vacuümmeter op 2,5 tot 3,7 pascal. Voor analyse brengt u de monsters, nadat u ze uit de koelcel hebt verwijderd, op kamertemperatuur in een exsiccator om condensatie op het monsteroppervlak te voorkomen voordat u het monster aan matrixtoepassing onderwerpt.

Implementeer de opstelling van de instrumentendetector en massakalibratie in elektrospray-ionisatie of ESI-modus. Voer de detectoropstelling uit met behulp van leucine en cefaline in wateracetonitril in een verhouding van één op één en voer massakalibratie uit met natriumformiaat en waterisopropanol in een verhouding van één op één. Haal de ESI-bron eruit en monteer de DESI-eenheid op de massaspectrometer.

Sluit de stikstofgastoevoer aan op de DESI-unit en stel de gasdruk in op ongeveer 0,5 megapascal. Vul een spuit van vijf milliliter met leucine en cefaline en mierenzuur in watermethanol in een verhouding van één tot negen en bevestig de spuit aan de krachtige spuitpomp om oplosmiddel te bieden voor ionisatie van de chemicaliën in het monster. Bevestig vervolgens een oplosmiddelleverend capillair aan de spuit en de DESI-sproeier.

Het capillair dat capillair levert, is een standaard capillair van afmetingen met een inwendige diameter van 75 micrometer en een buitendiameter van 375 micrometer. Start de spuitpomp en stel de infusiesnelheid in op twee microliter per minuut om een constante stroom en spray van het oplosmiddel te krijgen. Zet de stikstofgaskraan uit en zet hem na ongeveer 15 seconden aan.

Een kleine druppel oplosmiddel blaast uit op het podium en er is spray te zien als de oplosmiddelstroom in een constante toestand is. Pas vervolgens de positie van de spuit aan in termen van de spuithoek, XYZ-as, uitsteeksel en hoogte. Gebruik rode en zwarte markers als referenties om het massaspectrometriesignaal te optimaliseren om een signaalintensiteit van ongeveer één keer 10 tot de vijfde in de gevoeligheidsmodus te krijgen.

Omdat het uitsteeksel van de sproeier de belangrijkste factor is die de signaalintensiteit beïnvloedt, past u het uitsteeksel aan door de stikstofgasbescherming te veranderen met behulp van een moersleutel van vijf millimeter. De spuitrichting beïnvloedt de kwaliteit van het massabeeld. Draai daarom de spuit totdat de spray recht is.

Na al deze stappen is de installatie klaar voor experimenten en is deze normaal gesproken stabiel gedurende ongeveer drie weken bruikbaarheid na de eerste installatie. Voor DESI-MS-beeldvorming is geen monstervoorbehandeling vereist. Verwijder echter indien mogelijk de overtollige media op de dia's.

Maak een afbeelding van het voorbeeld op de dia. Zonder het oppervlak van het monster aan te raken om onzuiverheden te voorkomen, plaatst u de dia op de plaatpositie op de DESI-trap, die twee plaatposities heeft, A en B.Gebruik standaarddia's of een volledige dia om in de positie te passen. Een volledige dia biedt plaats aan maximaal vier dia's en heeft dus een veel groter oppervlak voor experimenten.

Open de high-definition massabeeldverwerkingssoftware. Stel een nieuwe plaat in op het tabblad Verkrijgen en selecteer de juiste plaatpositie, A of B, en het plaattype. Selecteer op de pagina Afbeelding selecteren de vier hoeken van de dia en vervolgens wordt de afbeelding automatisch aangepast aan de juiste richting.

Als u de MS-parameters wilt instellen, selecteert u het experimenttype als DESI-MS-modus die vaak wordt gebruikt en waarin alleen het bovenliggende ion wordt gedetecteerd. Selecteer vervolgens de polariteit als positief of negatief, omdat het instrument slechts één polariteit in een experiment kan gebruiken. Pas vervolgens de gevoeligheidsmodus toe om meer informatie over chemicaliën in kleine hoeveelheden te krijgen.

Teken vervolgens een rechthoek om het scangebied op het tabblad Patroon te definiëren en stel de pixelgrootte in door de X- en Y-grootten van de pixel gelijk te houden. Stel de scansnelheid in op niet meer dan vijf keer de pixelgrootte. Sla het project op en exporteer een werkblad voor de MS-acquisitiesoftware.

Importeer vervolgens het werkblad in de MS-acquisitiesoftware en sla het op als een nieuwe voorbeeldlijst. Druk op Start uitvoeren om het scannen van MS-afbeeldingen te starten en er kunnen meerdere afbeeldingen aan de experimentwachtrij worden toegevoegd door meer werkbladen te importeren. Laad het gegevensbestand van het monster in de massabeeldverwerkingssoftware en stel de parameters in voor DESI-beeldverwerking.

Omdat leucine en cefaline werden gebruikt voor de interne vergrendelingsmassa en de slotmassa het enige punt is om de polariteit van het experiment te identificeren, is het cruciaal om de juiste slotmassa in te stellen. Stel 556.2772 in voor de positieve modus en 554.2620 voor de negatieve modus. Als u een lijst met doelchemicaliën wilt maken, laadt u het verwerkte gegevensbestand om de DESI-afbeelding van het monster te visualiseren.

Klik op de knop Normalisatie om de gegevens te normaliseren door totale ionchromatografie om de relatieve intensiteit van een specifieke chemische stof naar de referentie te krijgen, en vervolgens kunnen verschillende monsters met elkaar worden vergeleken. Teken een interessegebied of ROI en kopieer meerdere exemplaren op de voorbeeldafbeelding. Selecteer vervolgens alle ROI's en exporteer multivariate analyse om MS-informatie uit alle ROI's te extraheren.

Massaspectrometrie beeldvorming van de wortel- en hele bladsecties toont de ruimtelijke verdeling van de geselecteerde verbindingen. De kleur van elke afzonderlijke pixel vertegenwoordigt de relatieve intensiteit van de verhouding tussen massa en lading en kan dus worden geassocieerd met de natuurlijke verdeling en de overvloed van het metabolietion in het monster. De verdeling van de doelverbindingen, tanshinon IIA en rozemarijnzuur, is zichtbaar in verschillende delen van de wortel.

De verbinding tanshinol A werd gedetecteerd in de bladsecties Als een protocol dat gericht is op reproduceerbaarheid, is het belangrijkste om de signaalintensiteit te optimaliseren door de positie van de spuit in verschillende dimensies aan te passen.