Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

Momenteel hebben we een beperkt begrip van de biologie van plasmodiuminfectie van de lever. Dit protocol heeft ons geholpen veel transgene lijnen te genereren die hebben geholpen bij het beantwoorden van enkele kritische vragen over de biologie van het organisme. Een fundamenteel begrip van de parasiet en zijn biologie is nodig om nieuwe instrumenten en benaderingen te ontwikkelen om de infectie van malaria te bestrijden.

De methode van transgenese die we hier beschrijven, heeft ons geholpen een aantal belangrijke en complexe biologie van zowel het organisme als de gastheer te ontcijferen. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Carson Bowers, mijn laboratoriummanager. Na het genereren van met P.Bergehei geïnfecteerde muizen en het euthanaseren ervan, verzamelt u twee milliliter bloed van twee geïnfecteerde muizen in vijf milliliter Elsevier-oplossing in een steriele omgeving.

Centrifugeer het bloed bij 450 G gedurende acht minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatans weg en suspendeer de celpellet opnieuw in 10 milliliter volledige RPMI-media. Centrifugeer de celsuspensie opnieuw en suspendeer de pellet opnieuw in 25 milliliter volledig RPMI-medium.

Breng de celsuspensie over in een T75-kweekkolf met een filterdop en incubeer met zacht schudden om de cellen in suspensie te houden. Verzamel aan het einde van de incubatie 500 microliter van het monster. Centrifugeer en suspendeer de pellet opnieuw in 10 microliter volledig RPMI-medium.

Maak vervolgens een dun bloeduitstrijkje. Kleur het bloeduitstrijkje met Giemsa-kleuring en bepaal de frequentie van schizonten. Voor een optimale transfectie-efficiëntie moet 60 tot 70% van de parasieten zich in het schizontstadium bevinden.

Bereid een gradiëntcentrifugatiebuffer voor door 13 milliliter dichtheidsgradiëntvoorraadmedium te reconstitueren in een centrifugatiebuis van 50 milliliter. Breng 25 milliliter bloedkweek over in een verse centrifugatiebuis van 50 milliliter. Leg vervolgens voorzichtig 20 milliliter gradiëntcentrifugatiebuffer op de bodem van de centrifugatiebuis, gebruik een smalle glazen pipet om een gradiëntkolom te creëren en zorg voor een duidelijke scheiding tussen de buffer en de media.

Centrifugeer de voorbereide buffer en media gedurende 20 minuten bij 450 G zonder onderbreking bij kamertemperatuur. Verwijder met behulp van een weidepipet voorzichtig de schizontlaag op het grensvlak van de kweekmedia en de gradiëntcentrifugatiebuffer. Plaats het in een nieuwe centrifugatiebuis van 50 milliliter.

Suspendeer de geïsoleerde schizonten opnieuw in volledige RPMI-media en verhoog het totale volume tot 40 milliliter. Na het centrifugeren en weggooien van het supernatant, suspendeert u de schizont opnieuw in 10 milliliter volledige RPMI-media. Breng vervolgens een milliliter van deze oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter voor elke transfectie en pelleteer de geïnfecteerde cellen door centrifugatie bij 16.000 G gedurende vijf seconden.

Combineer vervolgens 100 microliter van de elektroporatiebuffer bij kamertemperatuur met vijf microgram doelplasmide-DNA in een microcentrifugebuisje van 1,5 milliliter. Verwijder na het centrifugeren van de geïnfecteerde cellen het supernatans en suspendeer de cellen voorzichtig opnieuw in de bereide nucleoefectoroplossing plus plasmide-DNA. Breng de suspensie vervolgens over in elektroporatie, cuvetten en transfect met behulp van een geschikt nucleofectorprogramma.

Voeg vervolgens 100 microliter compleet RPMI-medium toe aan de cuvet. Breng de hele oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en plaats deze op ijs. Controleer de parasitemiespiegels bij de muizen die zijn ingeënt met de getransfecteerde schizont dagelijks vanaf twee dagen na inoculatie.

Zodra de infectie is bevestigd, begint u met de selectie van geneesmiddelen door het geneesmiddel oraal toe te dienen en het drinkwater ad libitum aan te bieden. Bewaak parasitemie met behulp van bloeduitstrijkjes vanaf zes dagen na de start van de behandeling met pyromethamine. Wanneer parasitemie ten minste 1% bereikt, breng de parasieten over naar naïeve B6-muizen om parasietvoorraden in het bloedstadium te creëren.

Zodra parasitemie 2% tot 5% bereikt, voorraden genereren en deze cryopreservatie maken. Scheid een dag voor de muggeninfectie de vrouwelijke muggen door een handschoen gevuld met water verwarmd tot 37 graden Celsius bovenop de kooi te plaatsen met zowel mannelijke als vrouwelijke muggen. Gebruik een insectenaspirator om de vrouwelijke muggen die door de warmtebron worden aangetrokken te verwijderen en ze over te brengen naar een kleinere kooi voor infectie.

Bepaal op de dag van muggenvoeding en infectie parasitemie bij de geïnfecteerde B6-muizen. Parasitemie tussen 2% en 5% is optimaal voor muggeninfectie. Na verificatie van de parasitemie, breng je de infectie over op de vrouwelijke muggen door de verdoofde muizen op de gekooide vrouwelijke muggen te plaatsen onder sternale ligging.

Spreid de voor- en achterpoten handmatig om het grootste oppervlak te bieden voor het voeden van muggen. Laat de geïnfecteerde muizen 15 minuten in elke kooi en controleer elke vijf minuten of de muizen niet wakker zijn. Zodra het voeren is voltooid en de muizen zijn geëuthanaseerd, moet u ze veilig weggooien volgens de richtlijnen van de instelling.

Om een succesvolle infectie bij de muggen te verifiëren, isoleert u de middendarmen van de muggen door het terminale abdominale segment 10 dagen na infectie met een tang te verwijderen. Bekijk vervolgens de middendarmen onder gepolariseerd licht om de aanwezigheid van oöcysten te detecteren. Ontleed 18 dagen na infectie vijf tot 10 muggen om het aantal aanwezige sporozoïeten te evalueren.

Om de sporozoïeten te isoleren en te tellen, verwijdert u voorzichtig de kop van de mug terwijl u druk uitoefent op de thorax met een tang of een fijne snijnaald. De speekselklieren blijven vastzitten aan de verwijderde kop. Verwijder vervolgens eventuele extra muggenresten uit de speekselklieren en plaats ze in een microcentrifugebuis met 400 microliter muggendissectiemedia.

Verstoor vervolgens de geïsoleerde speekselklieren door ze 15 tot 20 keer door een naaldspuit van 30 gauge te halen, Plaats daarna 10 microliter van de verstoorde speekselklieren in muggendissectiemedia in een hemocytometer en tel. Breng ten slotte de speekselklieren opnieuw in de gewenste concentratie muggendissectiemedia of PBS voor injectie bij muizen of cryo-conservering op lange termijn. Net als microscopie worden afbeeldingen van volwassen en onvolwassen P.berghei schizont in geparasiteerde muizenbloedculturen gepresenteerd.

Zoals microscopiebeelden van een muggenkop met de speekselklieren nog intact tijdens dissectie, en de ontlede speekselklier onder lagere en hogere vergrotingen worden getoond. De generatie van groen fluorescentiesignaal in de PB, GFP 11 geïnfecteerde HEPA, GFP één tot 10 gastheercellen duidde op de lysis van de parasitofore vacuole. Het is belangrijk om de chaisson-laag voorzichtig te verwijderen zonder de gradiëntinterface te verstoren.

Ook vergt het enige oefening om de speekselklieren samen met de kop betrouwbaar te verwijderen tijdens de lichte isolatie van sporen. Na isolatie kunnen transgene sporozoïeten cryo-geconserveerd worden of vers worden gebruikt voor in vivo of in vitro infectiestudies.