Dit protocol beschrijft de hele procedure voor de analyse van axonaal transport. Met name de berekening van de transportsnelheid, exclusief het pauzeren, en de visualisatiemethode met behulp van open-access software "KYMOMAKER" worden hier getoond.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dit protocol beschrijft de hele procedure voor de analyse van axonaal transport. Met name de berekening van de transportsnelheid, exclusief het pauzeren, en de visualisatiemethode met behulp van open-access software "KYMOMAKER" worden hier getoond.
Neuronale cellen zijn sterk gepolariseerde cellen die stereotiep meerdere dendrieten en een axon herbergen. De lengte van een axon vereist een efficiënt bidirectioneel transport door motoreiwitten. Verschillende rapporten hebben gesuggereerd dat defecten in axonaal transport geassocieerd zijn met neurodegeneratieve ziekten. Ook het mechanisme van de coördinatie van meerdere motoreiwitten is een aantrekkelijk onderwerp geweest. Omdat het axon unidirectionele microtubuli heeft, is het gemakkelijker om te bepalen welke motoreiwitten bij de beweging betrokken zijn. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het transport van axonale lading cruciaal voor het blootleggen van het moleculaire mechanisme van neurodegeneratieve ziekten en de regulatie van motoreiwitten. Hier introduceren we het hele proces van axonale transportanalyse, inclusief het kweken van primaire corticale neuronen van muizen, transfectie van plasmiden die coderen voor ladingseiwitten, en richtings- en snelheidsanalyses zonder het effect van pauzes. Bovendien wordt de open-access software "KYMOMAKER" geïntroduceerd, die het mogelijk maakt om een kymograaf te genereren om transportsporen in hun richting te markeren en het axonale transport gemakkelijker te visualiseren.
Kinesine-familieleden en cytoplasmatisch dyneïne zijn motoreiwitten die langs de microtubuli in cellen bewegen om hun lading te transporteren1. De meeste kinesines bewegen naar het plus-uiteinde, terwijl dyneïne naar het min-uiteinde van een microtubuli beweegt. De functies en mechanismen van vrachttransport in het neuronale axon zijn uitgebreid onderzocht. Vanwege hun lengte hebben axonen stabiel transport over lange afstanden nodig om de gezondheid van neuronen te behouden. Defecten in het transport van mitochondriën, autofagosomen en blaasjes die amyloïde-β-eiwitprecursor (APP) bevatten, zijn gemeld als oorz....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De experimenten werden goedgekeurd door de Animal Studies Committee van de Universiteit van Hokkaido, in navolging van de ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) richtlijnen. Vrouwelijke C57BL/6J-muizen (zwanger, 15,5 dagen) werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Preparaat van primaire corticale gekweekte neuronen van muizen
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Primaire gekweekte neuronen uit de E15.5-muiscortex werden gekweekt in een schaal met glazen bodem zoals beschreven. APP-EGFP, Alcα-EGFP of Alcβ-EGFP werden bijvoorbeeld tot expressie gebracht in de primaire corticale neuronen. Van APP en Alcα is bekend dat ze in het axon worden getransporteerd door kinesine-1 2,17. APP associeert met kinesine-1 via het adaptereiwit JIP1 (JNK-interagerend eiwit 1), terwijl Alcα direct bi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Er wordt een analysemethode voor axonaal transport beschreven, die de berekening van de gesegmenteerde snelheid en het genereren van kymografen omvat. Een kritieke stap tijdens de transfectiestap is het handhaven van de gezondheid van gekweekte neuronen. De transfectiemethode beschreven door Jiang en Chen29 werd gevolgd met kleine wijzigingen. Zachte menging van de DNA/CaCl2-oplossing en 2x HBS verhoogde de efficiëntie van transfectie door de grootte va.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dit werk werd ondersteund door KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid for Young Scientists) en de Akiyama Life Science Foundation for YS. We willen onze dankbaarheid betuigen aan Dr. Masataka Kinjo en Dr. Akira Kitamura, Laboratory of Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University voor het leveren van kritische input en expertise die het onderzoek enorm hebben geholpen. De waarneming met TIRF-microscopie werd uitgevoerd met behulp van het instrument dat was geïnstalleerd in het Laboratory of Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University. Het instrument is geregistreerd in het O....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Apo TIRF 100x/1.49 OIL | Nikon | ||
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo fischer scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | Wako | 013-25773 | |
| CalPhos Mammalian Transfection Kit | Takara | 631312 | |
| Cell strainer 40 µm Nylon | Falcon | 352340 | |
| CoolSNAP HQ | Photometrics | ||
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| D-Glucose | Wako | 041-00595 | |
| DMEM/Ham’s F-12 | Wako | 042-30555 | |
| Dumont No. 7 forceps | Dumont | No.7 | |
| Feather surgical blade | Feather | No.11 | |
| Feather surgical blade handle | Feather | No. 3 | |
| Gentamicin | Wako | 079-02973 | |
| Gentamicin Sulfate | Wako | 075-04913 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo fischer scientific | 35050061 | |
| HEPES | DOJINDO | 342-01375 | |
| Horse Serum, heat inactivated | Thermo fischer scientific | 26050088 | |
| KCl | Wako | 163-03545 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| KYMOMAKER | http://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html | ||
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L5520 | |
| MetaMorph version 6.2r1 | Metamorph | ||
| Na2HPO4 | Wako | 197-02865 | |
| NaCl | Wako | 197-01667 | |
| NaHCO3 | Wako | 191-01305 | |
| Neurobasal Medium | Thermo fischer scientific | 21103049 | |
| Nikon ECLIPSE TE 2000-E | Nikon | ||
| Nunc Lab-Tek 8 well Chambered Coverglass | Thermo fischer scientific | 155411 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636-500MG | |
| Trizma base | Merck | T1194-10PAK | solved with water to make 0.1 M Tris-HCl (pH.8.5) |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar