Ultrastructurele lokalisatie van endogene LC3 door middel van on-section correlatieve licht-elektronenmicroscopie

Lokalisatie van eiwitten in de context van de ultrastructuur van de cel is al tientallen jaren een krachtig onderzoeksinstrument. Met dit protocol hebben we de eiwitten uitgebreid die weinig of moeilijk te lokaliseren zijn. We gebruiken fluorescentiemicroscopie om eiwitten op een gevoelige en screenbare manier te labelen en combineren dit met elektronenmicroscopie om de ultrastructuur van de cel opnieuw te vullen.

Hier zullen we CLEM op autofagie-eiwitten demonstreren, maar het kan echt worden toegepast op elke biologische vraag waarbij de ultrastructuur van de cel van belang is, vooral bij de studie van zeldzame gebeurtenissen. De procedure wordt samen met mij gedemonstreerd door Tineke Veenendaal, een senior onderzoekstechnicus van ons laboratorium. Vervang om te beginnen de PBS met 0,15% glycine door 1% gelatine in PBS voorverwarmd tot 37 graden Celsius.

Schraap en breng de cellen in gelatine over in een microcentrifugebuis. Pelleteer de cellen bij 6.000 G gedurende één minuut bij kamertemperatuur in een microcentrifuge en verwijder vervolgens de gelatine zonder de pellet te verstoren. Voeg 12% gelatine opgewarmd tot 37 graden Celsius toe aan de pellet en resuspendeer voorzichtig door te pipetteren met pipetpunten of glazen weidepipetten die op dezelfde temperatuur zijn voorverwarmd.

Incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius en pellet de cellen vervolgens gedurende één minuut bij 6.000 G. Laat de gelatine 30 minuten stollen op ijs. Om de met gelatine ingebedde cellen uit de buis te verwijderen, snijdt u het buisuiteinde met de pellet met een scheermesje af van de rest van de buis.

Snijd vervolgens het buisuiteinde met de celkorrel doormidden loodrecht op de eerste snede. Plaats de twee buiseindhelften met de celpellet in 2,3 molaire sucrose en incubeer gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Dit zorgt ervoor dat de helften van de celpellets iets krimpen en loskomen van de plastic buis.

Verwijder de buishelften met de in gelatine ingebedde celpellet uit de sucrose en verwijder vervolgens de celpellethelften met een pincet van de plastic buishelften. Snijd de pellet handmatig in blokken van de juiste grootte met een scheermesje en gebruik een stereo-ontleedmicroscoop om het onderwerp tijdens het snijden te vergroten. Incubeer de celblokken 's nachts in 2,3 molaire sucrose bij vier graden Celsius.

Plaats ze op een aluminium monsterhouderpen. Laat voldoende sacharose rond de randen van het blok zodat het een dunne kraag vormt tussen het blok en de pin. Snap vries het in en bewaar het in vloeibare stikstof.

Snijd de voorkant van het blok af om het oppervlak af te vlakken om secties van ongeveer 250 nanometer dik te verkrijgen. Snijd vervolgens de zijkanten van het blok af door 50 tot 100 micrometer in de zijkant van het oppervlak van het monsterblok te snijden met de meshoek. Door vier zijden van het oppervlak van het monsterblok bij te snijden, ontstaat een uitstekende rechthoek van ongeveer 250 bij 375 micrometer.

Doorsnijd een lint van de uitstekende rechthoek en zorg ervoor dat de secties tussen de 70 en 90 nanometer dik zijn en een zilverachtige gouden glans hebben. Leid de secties weg van de rand van het diamantmes met een haar op een stok om een lang lint te maken. Pak het lint op door de drie millimeter lange opneemlus in een één-op-één mengsel van 2,3 molaire sucrose en 2% methylcellulose te dopen.

Steek de lus in de cryokamer van de microtoom en zodra de druppel begint te bevriezen, pakt u de secties onmiddellijk op door de druppel er voorzichtig tegenaan te drukken. Verwijder de lus uit de cryokamer. Wacht tot de druppel volledig ontdooid is en druk de druppel op een voorbereid rooster.

Leg de roosters met secties op ongeveer een milliliter PBS in een schaaltje of bord met meerdere putjes en incubeer ze 30 minuten bij 37 graden Celsius. Verwerk de roosters op ongeveer 75 microliter druppels op Parafilm en begin met PBS glycine wasbeurten op kamertemperatuur. Incubeer de roosters met een blokkeerbuffer van 0,1% runderserumalbumine C en 0,5% vishuidgelatine in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur als blokkeerstap.

Verdun primaire antilichamen in de blokkeerbuffer in PBS en incubeer de roosters op ongeveer 10 microliter druppeltjes van deze oplossing gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de roosters in 0,1% runderserumalbumine in PBS vijf keer op kamertemperatuur. Verdun de secundaire antilichamen en DAPI in de blokkerende buffer bij PBS.

Incubeer de roosters vervolgens op ongeveer 10 microliter druppeltjes van deze oplossing gedurende 30 minuten of langer bij kamertemperatuur voordat u de roosters vijf keer in PBS wast, zoals eerder weergegeven. Om de monsters voor lichtmicroscopie te monteren, dompelt u de roosters twee keer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur onder in 50% glycerol in gedestilleerd water. Plaats één rooster per dekglaasje tussen een glasglaasje en een dekglaasje in 50% glycerol en zorg ervoor dat de secties naar het dekglaasje wijzen.

Voor lichtmicroscopie brengt u een glasplaatje met de ingeklemde roosters naar een breedveldmicroscoop met een geautomatiseerde tafel. Selecteer een olie-objectief met een hoge vergrotingsfactor en maak een afbeeldingstegelset van het lint met secties. Voeg vervolgens, voor demontage en elektronenmicroscopie of EM-contrast, 10 microliter gedestilleerd water toe aan de zijkant van de slipsandwich van het glazen glaasje en wacht tot de capillaire werking de sandwichinterface van de glazen afdekplaat vult.

Verwijder voorzichtig het afdekglaasje zonder immersieolie in de glycerol te mengen. Haal de roosters eruit met een pincet en dompel ze drie keer onder in gedestilleerd water op kamertemperatuur om de 50% glycerol af te wassen. Droog de achterkant van het rooster voorzichtig af met pluisvrij vloeipapier en leg de roosters met de snijkant naar beneden op gedestilleerde waterdruppels.

Om de secties te kleuren voor contrast in elektronenmicroscopie, incubeert u ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met uranylacetaat. Koel de uranylacetaatmethylcellulose-oplossing af door de druppeltjes op Parafilm op een metalen plaat op ijs te plaatsen. Was de roosters vervolgens twee keer met deze ijskoude oplossing en broed ze 10 minuten in de oplossing.

Maak een lus van de roosters door een drooglus van het rooster in de druppel uranylacetaatmethylcellulose onder elk rooster te steken en deze voorzichtig op te tillen totdat het rooster van de druppel is getrokken. Om de overtollige oplossing te deppen, raakt u de lus in een hoek van ongeveer 60 graden aan op het pluisvrije filterpapier en sleept u deze langzaam langs het papier totdat er geen oplossing meer wordt geabsorbeerd. Plaats de lus met het rooster in een geschikt rooster en laat het langer dan 10 minuten op kamertemperatuur drogen.

Gebruik het overzicht verkregen door lichtmicroscopie om een gebied te lokaliseren dat van belang is voor beeldvorming in de transmissie-elektronenmicroscoop of TEM, en annoteer de ROI op de lichtmicroscopiedataset. Zodra een gebied is geselecteerd, verkrijgt u een afbeeldingstegel die is ingesteld op een vergroting van 20.000x tot 50.000x in de TEM. Reconstrueer de afbeeldingstegelset in nabewerkingssoftware.

Voer de correlatie uit op basis van DAPI-signaal en fluorescentie- en nucleaire contouren in elektronenmicroscopie. Verschuif de afbeeldingen om ze precies over elkaar heen te leggen en voer de handmatige correlatie nauwkeurig uit. Hepatoblastoom-afgeleide HEPG2-cellen werden gedurende twee uur uitgehongerd in EBSS voorafgaand aan fixatie met 4%paraldehyde gedurende twee uur.

IF-beeldvorming van LC3 en LAMP1 op secties toont relatief weinig LC3-puncta en weinig colokalisatie met LAMP1. Moleculaire informatie van IF werd gekoppeld aan de ultrastructurele informatie verkregen in elektronenmicroscopie door de twee beeldvormingsmodaliteiten op basis van DAPI en nucleaire contouren over elkaar heen te leggen. De correlatie van de LC3-positieve organellen met de EM-ultrastructuur onthulde dat de verschillende puncta verschillende stadia van autofagie vertegenwoordigden.

De ultrastructuur van de afzonderlijke compartimenten met LC3-label, zoals geïllustreerd door box één, wordt hier getoond. De gecorreleerde lichtelektronenmicroscopiebeelden worden aan de linkerkant getoond en de pseudo-gekleurde elektronenmicroscopiebeelden worden aan de rechterkant getoond. Binnenste en buitenste autofagosomale membranen worden aangegeven met witte en zwarte pijlpunten.

Interessant is dat EM relatief zwakke fluorescerende vlekken identificeerde als LC3-positieve autolysosomen, die worden gekenmerkt door dichte inhoud en intraluminale blaasjes. Dit onthult een minimale LC3-zichtbaarheid in IF van ultradunne cryosecties, wat wijst op detecteerbare LC3 in steady-state autolysosomen ondanks de afbrekende omgeving. LC3-positieve puncta vertegenwoordigen echter voornamelijk autofagosomen en enkele autolysosomen.

Voor onderzoekers die immunogold labeling willen doen in plaats van on-section CLEM, zijn de hier beschreven protocollen en tips ook volledig toepasbaar voor immunogold labeling. We pasten aanvankelijk CLEM toe op endosomale regulerende eiwitten met een lage abundantie en toonden voor het eerst hun endogene ultrastructurele lokalisatie aan.