Generatie van bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en Adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem
24 maart 2023
In dit protocol beschrijven we de technische procedures om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knock-out muizen te genereren met behulp van een gecombineerd Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus (AAV) single-guide RNA (sgRNA) systeem. De beschreven stappen omvatten het ontwerp van de sgRNA's, de bereiding van de AAV-sgRNA-deeltjes en de micro-injectie van AAV in de BBT-lobben.
Dit protocol genereert bruine vet-specifieke knock-out muizen met behulp van een Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerd virus single-guide RNA-systeem. Het omvat een chirurgische techniek om AAV veilig toe te dienen in het bruine vet. Het grote voordeel van deze techniek is dat het snel weefselspecifieke knock-outs kan genereren zonder selectief muizen te hoeven fokken.
De aanpak voor het maken van weefselspecifieke knock-out of knockdowns kan worden aangepast aan andere weefsels als de chirurgische procedure voor het injecteren van AAV wordt gewijzigd op basis van het doelorgaan. Dien om te beginnen het analgeticum subcutaan toe aan de verdoofde UCP1 Cre Cas9-muis om postoperatieve pijn en angst te minimaliseren en te voorkomen. Scheer vervolgens de vacht op het interscapulaire gebied met behulp van een scheerapparaat en steriliseer het chirurgische gebied met ten minste drie afwisselende rondes van een scrub op basis van jodium of chloorhexidine, gevolgd door 70% ethanol.
Maak met behulp van een scalpel een incisie van twee centimeter in de huid boven het bruine vetweefsel tussen de schouderbladen om het interscapulaire vet bloot te leggen. Na het maken van een enkele incisie, snijdt u de vetweefsels op de grens tussen het distale gebied van de vetweefsels en spieren. Gebruik vervolgens de chirurgische schaar in de dominante hand en pel de vetweefsels bot en verticaal af om het bruine vetweefsel bloot te leggen terwijl u de vetweefsels, inclusief het bruine vetweefsel, met de niet-dominante hand knijpt.
Gebruik de ader van Sulzer als oriëntatiepunt om de precieze locatie van bruin vetweefsel aan te geven. Injecteer vervolgens voor elke muis 20 microliter adeno-geassocieerd virus of AAV langzaam in elke lob van de twee bruine vetweefsels met behulp van een scherpe naald van 32 gauge die is aangesloten op een Hamilton-spuit van 100 microliter. Bevestig een succesvolle injectie aangegeven door geen lekkages van de geïnjecteerde plaats tijdens de toediening van AAV.
Na het verzekeren van homeostase, plaatst u de blootgestelde vetweefsels terug in hun normale positie om de rand van de vetweefsels en spieren te hechten met behulp van een 5-0 absorbeerbare monofilamentdraad. Hecht ten slotte de open huid met 5-0 gecoate VICRYL ongeverfde gevlochten draden. De precieze locatie van het bruine vetweefsel kan niet worden geïdentificeerd zonder het bloot te stellen, maar overmatige blootstellingsschade aan het weefsel.
De mogelijke gebreken die mogelijk tot mislukte injecties hebben geleid, omvatten het injecteren van de AAV-oplossing in het verkeerde gebied, naaldpenetratie door het weefsel en weefselballonvorming als gevolg van een overmatig volume van de AAV-oplossing. De precieze afgifte van AAV single guide RNA aan het bruine vetweefsel was cruciaal voor het succes van het protocol. De sleutel tot succes bij het blootleggen van het bruine vetweefsel is de chirurgische schaartechniek, inclusief de richting en diepte van de schaar en de locatie van Hamilton-spuit.
Deze techniek heeft een belastinggenererende weefselspecifieke knock-out dieren om de moleculaire regulatoren van bruin vet gerelateerd energiemetabolisme te begrijpen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode om bruin vetweefsel (BAT)-specifieke knockout-muizen te genereren met behulp van een combinatie van Cre-LoxP, CRISPR-Cas9 en adeno-geassocieerde virus (AAV) single-guide RNA-technieken. Door deze methoden te gebruiken, kunnen onderzoekers snel weefselspecifieke knockouts creëren zonder dat selectieve fokkerij noodzakelijk is.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Genetica
- Celbiologie
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Bruin vetweefsel is cruciaal voor de energiestofwisseling.
- Het creëren van weefselspecifieke knock-outs helpt bij het begrijpen van biologische processen.
- Deze methode kan potentieel worden aangepast voor andere weefsels.
Gebruikte methoden
- Toepassing van Cre-LoxP- en CRISPR-Cas9-benaderingen.
- Gebruikt muismodel: UCP1 Cre Cas9-muizen.
- Toediening van AAV-sgRNA via chirurgische micro-injectie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle targeting en knockout van bruin vetweefsel.
- Aangetoonde effectiviteit van AAV bij weefselspecifieke genbewerking.
- Belangrijke chirurgische technieken gevalideerd voor nauwkeurige toediening.
Conclusies
- De studie presenteert een snelle techniek voor het genereren van knockout-modellen die relevant zijn voor het bruine vetmetabolisme.
- Het vergroot het inzicht in moleculaire regulatoren in de energiestofwisseling.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
De snelle generatie van knockout-muizen die specifiek zijn voor bruin vetweefsel (BAT) met behulp van gecombineerde Cre-LoxP-, CRISPR-Cas9- en AAV-sgRNA-technologieën maakt versnelde functionele genomics in metabolisch onderzoek mogelijk. Deze aanpak stroomlijnt de validatie van targets en het mechanistisch minimaliseren van risico's voor genen die betrokken zijn bij energieregulatie, waardoor de cyclustijden worden verkort in vergelijking met traditionele fokkerij. De methode ondersteunt portfoliobeslissingen door weefselspecifieke inzichten te verschaffen die cruciaal zijn voor vroege ontdekking en translationele continuïteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe ondervraging van genfuncties in BAT mogelijk voor mechanistische helderheid.
- Ondersteunt biologische risicovermindering door geneffecten te isoleren in een weefsel dat relevant is voor de ziekte.
- Faciliteert voorspellend vertrouwen bij de selectie van targets voor metabole stoornissen.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gevalideerde knockout-modellen voor downstream fenotypische screening.
- Standaardiseert genetische achtergronden voor reproduceerbare kwantitatieve resultaten.
- Versnelt de ontwikkeling van assays door langdurige fokcycli te omzeilen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt preklinische modellen uit met humane mechanismen van metabole ziekten via BAT-specifieke genbewerking.
- Maakt risico-gecorrigeerde voortgang mogelijk door de bijdrage van genen aan het energiemetabolisme te verduidelijken.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie in metabool onderzoek.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode wordt geïntegreerd in de vroege fasen van ontdekking en targetvalidatie en vormt een brug naar de ontwikkeling van preklinische modellen voor onderzoeksportefeuilles op het gebied van metabole en endocriene aandoeningen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden bij BAT-gemedieerde energieregulatie.
- Screening: Levert reproduceerbare knockout-modellen voor kwantitatieve fenotypische assays.
- Analytiek: Maakt meting mogelijk van genspecifieke effecten op metabole output in vivo.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de afstemming van preklinische modellen op de menselijke BAT-biologie.
- Hergebruik op bedrijfsniveau: Aanpasbaar protocol voor andere weefsels door modificatie van de AAV-toediening, wat een bredere R&D-utiliteit ondersteunt.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Stroomlijnt modelgeneratie met gestandaardiseerde, reproduceerbare procedures.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte toewijzing van middelen mogelijk.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van metabole en endocriene targets.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in chirurgische micro-injectie en anatomische lokalisatie van BAT.
- Toegang tot AAV-productie en CRISPR-Cas9 genetische engineering-infrastructuur is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbaarheid.
- Aanpassing van het protocol is noodzakelijk voor het targeten van andere weefsels of organen.
- Succes hangt af van nauwkeurige AAV-toediening en minimalisering van weefselschade.
