Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Dit is het eerste protocol dat het mogelijk maakt om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen te differentiëren in microvasculaire endotheelcellen in de hersenen met goede barrière-eigenschappen, volwassen tight junctions en expressie van endotheelceladhesiemoleculen die immuuncelmigratie naar het centrale beginnerssysteem bemiddelen. EECM-BMEC-achtige cellen maken het mogelijk om immuuncelmigratie over de bloed-hersenbarrière te bestuderen met bloed-hersenbarrièremodellen afgeleid van de patiënten op een volledig autologe manier. Het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van MS-patiënten in EECM-BMEC-achtige cellen heeft ons in staat gesteld om intrinsieke barrièredefecten te identificeren in deze in vitro modellen van de MS-patiënten.

Deze culturele methode zal ons daarom in staat stellen om in de toekomst de moleculaire paden te identificeren die ten grondslag liggen aan deze aangetaste barrière-eigenschappen. Deze methoden kunnen worden toegepast op een breder spectrum van ziekten waarbij in serum morfologie en immuuncelinfiltratie in het CZS van cruciaal belang zijn voor deze pathogenese, bijvoorbeeld beroerte of neuro-infectie. Wanneer u deze techniek voor de eerste keer probeert, gebruik dan dezelfde hoeveelheid celmaterialen.

De zaaidichtheid is de sleutel tot succes van dit protocol en moet worden aangepast afhankelijk van de gebruikte klonen. Kinya Matsuo, universitair docent van mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Op dag vijf van de endotheelvoorlopercel kweekt u het medium uit de putten en voegt u aan elke put een milliliter dissociatiereagens toe.

Incubeer de plaat gedurende zes tot acht minuten op 37 graden. Met behulp van een micropipette dissociëren en singulariseren van de cellen. Laat vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer filteren om in een buis van 50 milliliter te filteren met 10 milliliter DMEM / F-12 10-medium.

Om de verteringsreactie te stoppen, voegt u DM DMEM/F-12 10 medium toe tot de 50 milliliter. Pipet grondig en reserveer 10 microliter voor het tellen van de cellen. Centrifugeer de buis van 50 milliliter op 200 g gedurende vijf minuten op 20 tot 25 graden Celsius om de cellen te pelleteren.

Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspensie van de celkorrel met 10 milliliter DMEM/F-12 10 medium. Breng de celsuspensie over in een verse buis van 15 milliliter. Centrifugeer op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 tot 25 graden celsius om de cellen opnieuw te pelleteren.

Suspensie vervolgens de celpellet in stroombuffer één. Voeg vervolgens het FCR-blokkerende reagens toe in een verhouding van één op 100 en incubeer gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens de één tot 200 verhouding verdund fluoresceïne-isothiocyanaat of FITC-gelabeld CD31-antilichaam toe.

Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten in het donker bij een temperatuur tussen de 20 en 25 graden. Voeg aan het einde van de incubatie 10 milliliter stroombuffer één toe aan het monster en reserveer 10 microliter van de suspensie voor flowcytometrie-analyse om de fractie CD31-positieve cellen te bepalen. Centrifugeer de cellen op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 tot 25 graden.

Na centrifugatie resuspendien de cellen met stroombuffer één oplossing. Voeg vervolgens vijf microliter van de FITC-selectiecocktail toe per 100 microliter van de celsuspensie. Meng de oplossing grondig door pipetteren en incubeer in het donker gedurende 15 minuten bij een temperatuur tussen 20 en 25 graden Celsius.

Voeg vervolgens vijf microliter magnetische nanodeeltjes toe per 100 microliter celsuspensie. Pipetteer het mengsel goed en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 20 tot 25 graden. Breng de celsuspensie over naar een vijf milliliter flowcytometriebuis en voeg stroombuffer één toe om een totaal volume van 2,5 milliliter te krijgen.

Plaats vervolgens de flowcytometriebuis gedurende vijf minuten in de magneet. In een continue beweging keert u de magneet om en decanteert u de celsuspensie die FITC CD31-antilichaam ongelabelde cellen bevat. Houd de magneet en buis twee tot drie seconden in de omgekeerde positie en verwijder vervolgens de resterende vloeistof.

Zuig eventuele druppels op de rand van de buis op voordat u de buis terugbrengt naar een rechtopstaande positie. Haal de flowcytometriebuis uit de magneet en voeg 2,5 milliliter flowbuffer één toe om de resterende CD31-positieve cellen te wassen. Pietteer de cellen voorzichtig twee of drie keer op en neer om ze opnieuw te suspenderen.

Plaats vervolgens de stroombuis gedurende vijf minuten in de magneet. Herhaal het wassen minstens vier keer om de FITC CD31 ongelabelde cellen uit de buis te verwijderen. Verwijder de stroombuis van de magneet en resuspendien de gezuiverde CD31-positieve cellen met de gewenste hoeveelheid van een geschikt medium.

Reserveer twee aliquots van 10 microliter van de suspensie, één voor celtelling en de tweede om flowcytometrie-analyse uit te voeren om de zuiverheid van CD31-positieve cellen in post-magnetische geactiveerde celsorteermonsters te beoordelen. Verwijder het HECSR-medium uit de zes putplaten met endotheel- en niet-endotheelcelpopulaties. Voeg vervolgens een milliliter dissociatiereagens toe aan elk putje.

Observeer de celmorfologie zorgvuldig onder een microscoop. Wanneer de endotheelcellen helder en rond lijken, meestal binnen twee tot vijf minuten, maak ze dan los door op de rand van de plaat te tikken. De niet-endotheelcellen blijven aan de plaat vastzitten.

Verzamel met behulp van een micropipet zorgvuldig de losgemaakte endotheelcellen zonder de niet-endotheelcellen te verstoren en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 milliliter of 50 milliliter met vier milliliter DMEM / F-12 10 per milliliter dissociatiereagens. Voeg vervolgens twee milliliter HECSR-medium toe aan de putten met de resterende aangehechte niet-endotheelcellen om de gladde spierachtige cellen of SMLCs te vestigen en plaats de plaat in de incubator. Breng de endotheelcelsuspensie over in een centrifugebuis.

Meng grondig en reserveer 10 microliter van de suspensie voor celtelling. Centrifugeer de resterende cellen op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 tot 25 graden Celsius. Voeg vervolgens twee milliliter HECSR-medium toe.

Verwijder vervolgens het collageen voor oplossing uit een eerder bereide collageengecodeerde zesputplaat en voeg twee milliliter van de endotheelcelsuspensie toe aan elke put. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden celsius in 5% koolstofdioxide. Immunofluorescente kleuring van EECM-BMEC-achtige cel junctionele moleculen in waaronder claudin-5, occludin en VE-cadherine werd gebruikt om de celmorfologie en de aanwezigheid van continue en volwassen juncties te beoordelen.

Stimulatie van de EECM-BMEC-achtige cellen gezaaid op kamerglaasjes met pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrosefactor alfa en interferon gamma verdund in SMLC afgeleid geconditioneerd medium upreguleerde de expressie van adhesiemoleculen zoals ICAM-1 en VCAM-1. Representatieve afbeeldingen van gladde spiercelmarkers, waaronder alfa-gladde spieractine, calponine en gladde spiereiwit 22 alfa, worden hier getoond. Stimulatie van de EECM-BMEC-achtige cellen met pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrosefactor alfa en interferon gamma upreguleerde de celoppervlakexpressie van verschillende adhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, VCAM-1 en P-selectine.

Verder heeft stimulatie met inflammatoire cytokines ook de expressie van endotheeladhesiemoleculen verhoogd en het verhoogde aantal immuuncellen bevorderd dat zich hechtte aan EECM-BMEC-achtige celmonolagen EECM-BMEC-achtige cellen zijn ook veelbelovend voor diepgaand begrip van pathofysiologische mechanismen op het niveau van de bloed-hersenbarrière, en als een waardevol hulpmiddel om een nieuw therapeutisch doelwit te ontwikkelen voor stabilisatie van de bloed-hersenbarrière.