Name: Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer hoe je menselijke iPSC's differentieert naar hersenmicrovasculaire endotheelcelachtige cellen met de EECM-methode. Deze techniek maakt onderzoek naar immuuncelinteracties en bloed-hersenbarrièrefunctie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

HN werd ondersteund door de Uehara Memorial Foundation, een ECTRIMS Postdoctoral Research Exchange Fellowship, JSPS onder het Joint Research Program geïmplementeerd in samenwerking met SNSF (JRPs) Grant No. JPJSJRP20221507 en KAKENHI Grant No. 22K15711, JST FOREST Program (Grant Number JPMJFR2269, Japan), YOKOYAMA Foundation for Clinical Pharmacology Grant No. YRY-2217, de ICHIRO KANEHARA FOUNDATION, de Narishige Neuroscience Research Foundation, de NOVARTIS Foundation (Japan) voor de bevordering van de wetenschap, en het YAMAGUCHI UNIVERSITY FUND. BE werd ondersteund door de Swiss MS Society en de Swiss National Science Foundation (subsidies 310030_189080 en ZLJZ3_214086) en het Strategic Japanese-Swiss Science and Technology Programme (SJSSTP) subsidie IZLJZ3_214086.

<ol><li>Castro Dias, M., Mapunda, J. A., Vladymyrov, M., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+junctional+complexes+of+endothelial%2C+epithelial+and+glial+brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Structure and junctional complexes of endothelial, epithelial and glial brain barriers.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (21), 5372(2019).</li>
<li>Engelhardt, B., Sorokin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+and+the+blood-cerebrospinal+fluid+barriers%3A+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunopathology%22%5BJournal%5D)">The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.</a> Seminars in Immunopathology. 31 (4), 497-511 (2009).</li>
<li>Marchetti, L., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+trafficking+across+the+blood-brain+barrier+in+the+absence+and+presence+of+neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immune cell trafficking across the blood-brain barrier in the absence and presence of neuroinflammation.</a> Vascular Biology. 2 (1), H1-H18 (2020).</li>
<li>Yang, C., Hawkins, K. E., Dore, S., Candelario-Jalil, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+mechanisms+of+blood-brain+barrier+damage+in+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory mechanisms of blood-brain barrier damage in ischemic stroke.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 316 (2), C135-C153 (2019).</li>
<li>Nishihara, H., Engelhardt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+barriers+and+multiple+sclerosis%3A+novel+treatment+approaches+from+a+brain+barriers+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain barriers and multiple sclerosis: novel treatment approaches from a brain barriers perspective.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 273, 295-329 (2020).</li>
<li>Pan, Y., Nicolazzo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+blood-brain+barrier+and+blood-spinal+cord+barrier+dynamics+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%3A+Impact+on+medication+efficacy+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Altered blood-brain barrier and blood-spinal cord barrier dynamics in amyotrophic lateral sclerosis: Impact on medication efficacy and safety.</a> British Journal of Pharmacology. 179 (11), 2577-2588 (2022).</li>
<li>Sweeney, M. D., Sagare, A. P., Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+in+Alzheimer+disease+and+other+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown in Alzheimer disease and other neurodegenerative disorders.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (3), 133-150 (2018).</li>
<li>Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+pathology+in+Alzheimer%27s+and+Parkinson%27s+disease%3A+implications+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier pathology in Alzheimer's and Parkinson's disease: implications for drug therapy.</a> Cell Transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).</li>
<li>Song, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+comparison+of+human+and+mouse+brain+microvessels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic comparison of human and mouse brain microvessels.</a> Scientific Reports. 10 (1), 12358(2020).</li>
<li>Lecuyer, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+ALCAM+in+neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dual role of ALCAM in neuroinflammation and blood-brain barrier homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (4), E524-E533 (2017).</li>
<li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> The FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li>
<li>DeStefano, J. G., Jamieson, J. J., Linville, R. M., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+in+vitro+tissue-engineered+blood-brain+barrier+models%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Benchmarking in vitro tissue-engineered blood-brain barrier models.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 32(2018).</li>
<li>Lyck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALCAM+%28CD166%29+is+involved+in+extravasation+of+monocytes+rather+than+T+cells+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">ALCAM (CD166) is involved in extravasation of monocytes rather than T cells across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (8), 2894-2909 (2017).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).</li>
<li>Cecchelli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+and+reproducible+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells.</a> PLoS One. 9 (6), e99733(2014).</li>
<li>Hollmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Accelerated differentiation of human induced pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 9(2017).</li>
<li>Stebbins, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells.</a> Methods. 101, 93-102 (2016).</li>
<li>Praca, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+brain+capillary-like+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Derivation of brain capillary-like endothelial cells from human pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells.</a> Stem Cell Reports. 13 (4), 599-611 (2019).</li>
<li>Al-Ahmad, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+expression+and+activity+of+glucose+transporters+between+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+and+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative study of expression and activity of glucose transporters between stem cell-derived brain microvascular endothelial cells and hCMEC/D3 cells.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 313 (4), C421-C429 (2017).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+neurovascular+unit+model+comprised+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+brain+microvascular+endothelial+cells%2C+pericytes%2C+astrocytes%2C+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">An isogenic neurovascular unit model comprised of human induced pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells, pericytes, astrocytes, and neurons.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 25(2019).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> The FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Lu, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cell-derived+epithelium+misidentified+as+brain+microvascular+endothelium+requires+ETS+factors+to+acquire+vascular+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cell-derived epithelium misidentified as brain microvascular endothelium requires ETS factors to acquire vascular fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (8), e2016950118(2021).</li>
<li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+WNT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li>
<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Puromycin-purified+rat+brain+microvascular+endothelial+cell+cultures+exhibit+improved+barrier+properties+in+response+to+glucocorticoid+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction.</a> Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).</li>
<li>Engelhardt, B., Capture Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((crawl%2C+cross%3A+the+T+cell+code+to+breach+the+blood-brain+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">crawl, cross: the T cell code to breach the blood-brain barriers.</a> Trends in Immunology. 33 (12), 579-589 (2012).</li>
<li>Duband, J. L., Gimona, M., Scatena, M., Sartore, S., Small, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calponin+and+SM+22+as+differentiation+markers+of+smooth+muscle%3A+spatiotemporal+distribution+during+avian+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Calponin and SM 22 as differentiation markers of smooth muscle: spatiotemporal distribution during avian embryonic development.</a> Differentiation. 55 (1), 1-11 (1993).</li>
<li>Gastfriend, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt+signaling+mediates+acquisition+of+blood-brain+barrier+properties+in+na%C3%AFve+endothelium+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Wnt signaling mediates acquisition of blood-brain barrier properties in naïve endothelium derived from human pluripotent stem cells.</a> eLife. 10, e70992(2021).</li>
<li>Eppihimer, M. J., Wolitzky, B., Anderson, D. C., Labow, M. A., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+expression+of+E-+and+P-selectins+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of expression of E- and P-selectins in vivo.</a> Circulation Research. 79 (3), 560-569 (1996).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
</ol>

BE ontving een subsidie van Biogen om de uitgebreide dosering van Natalizumab op T-celmigratie over de bloed-hersenbarrière te bestuderen en een subsidie van CSL Behring om de moleculaire onderbouwing van bloed-hersenbarrièredisfunctie bij neurologische aandoeningen te onderzoeken. HN en BE zijn uitvinders van de voorlopige Amerikaanse octrooiaanvragen met betrekking tot de EECM-BMEC-achtige cellen (63/084980 en 63/185815).

Kritieke punten en probleemoplossing Alvorens met EPC-differentiatie te beginnen, moeten onderzoekers ervoor zorgen dat er geen spontane celdifferentiatiegebeurtenissen zijn opgetreden in de hiPSC-culturen. De afwezigheid van spontaan gedifferentieerde cellen en het gebruik van zuivere hiPSC-kolonies is van cruciaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. De hiPSC-zaaidichtheid op dag -3 is belangrijk voor het verkrijgen van een hoge zuiverheid van CD31+ EPC's na MACS. De zaaidichtheid voor elke hiPSC-lijn en elke passage kan optimalisatie vereisen. Afhankelijk van de hiPSC-lijn en het doorgangsnummer kan de zaaidichtheid variëren van 75 x 10 3tot 400 x 10 3 hiPSC's per put van een 12-putplaat (20-100 x 103/cm2). Het minimale dichtheidscontrolepunt van hiPSC's is de celdichtheid op dag 2. De hiPSC's moeten uiterlijk op dag 2 100% confluentie bereiken. Als de hiPSC's op dag 2 niet samenvloeien, zal de zuiverheid van CD31+ EPC's na MACS meestal vrij laag zijn. In dit geval kan de hiPSC-zaaidichtheid worden verhoogd. Als grote aantallen differentiërende cellen rond dag 3 tot dag 5 van de plaat loskomen, kan de initiële hiPSC-zaaidichtheid worden verlaagd. De 7-8 μM CHIR99021 is in onze ervaring de optimale concentratie voor de hiPSC-lijnen die hier worden gebruikt, maar de concentratie moet mogelijk worden geoptimaliseerd voor andere hiPSC-lijnen die mogelijk anders reageren op de remmerbehandeling. De zuiverheid van CD31+ EPC's moet voor en na MACS worden bevestigd. Alvorens verder te gaan met MACS, moet het voorgesorteerde celmengsel >10% CD31+ cellen zijn. CD31+ celpercentages van <6% resulteren doorgaans in <80% EPC's na MACS. Optimalisatie van de initiële zaaidichtheid en/of de CHIR99021-concentratie is in deze situatie nodig.
Voor succesvolle selectieve passaging en generatie van zuivere EC-monolagen is de post-MACS-zuiverheid van CD31+ EPC's van cruciaal belang. Als de zuiverheid na MACS <90% is, worden een of twee extra wasbeurten aanbevolen (stappen 1.4.11-1.4.12). Idealiter zou de post-MACS-zuiverheid >95% moeten zijn. De EPC-zaaidichtheid op met collageen gecoate platen moet worden geoptimaliseerd volgens de hiPSC-lijn om binnen 3-7 dagen 100% confluentie te bereiken. Wachten tot de EC's 100% confluent zijn, zal meestal leiden tot een succesvolle selectieve passage. Maar zelfs voor 100% confluente EC's worden de SMLCs van sommige hiPSC-lijnen ook vroegtijdig losgekoppeld. In dit geval kan selectieve passaging bij lagere confluentie (bijv. ≤80%) effectief zijn. Als sommige SMLCs eerder loskomen dan EC's, kunnen de EC's vaak niet worden gered van de gemengde EC-SMLC-populatie. In dit geval kan het nuttig zijn om de activeringstijd voor het dissociatiereagens bij passerende EC's en repetitieve selectieve passaging te verkorten. Het gebruik van een commercieel dissociatiereagens in plaats van trypsine als dissociatiereagens is gunstig voor selectieve passaging, omdat trypsine de afzonderlijke loslating van EC's en SMLCs niet toestaat. Onze permeabiliteitstests met behulp van kleine molecuultracers en het testen van tight junction- en adhesiemolecuulexpressieniveaus geven aan dat EPC's, EECM-BMEC-achtige cellen en SMLCs gedurende ten minste 2 jaar in vloeibare stikstof kunnen worden opgeslagen.
Betekenis en beperkingen van de methode De methode onderscheidt CD31+ EPC's van hiPSC's door het gebruik van chemische GSK-3-remmers om Wnt/β-catenine signalering te activeren. Na positieve selectie van CD31+ EPC's door MACS, worden EPC's gekweekt in een gedefinieerd endotheelmedium dat differentiatie in gemengde endotheel- en SMLC-populaties bevordert. Selectieve passaging van deze gemengde populaties met verschillende kleefeigenschappen maakt de scheiding van EC's van SMLCs mogelijk. Na een of twee passages vertonen EECM-BMEC-achtige cellen barrière-eigenschappen en de expressie van endotheeladhesiemoleculen die die van primaire menselijke BMEC's recapituleren. Co-cultuur met SMLCs of hun supernatanten induceert de cytokine-geïnduceerde expressie van VCAM-1.
In vivo handhaaft de BBB de FOSS-homeostase door een lage paracellulaire en transcellulaire permeabiliteit van moleculen vast te stellen, door het transport van voedingsstoffen via specifieke transporters en de controle van de handel van immuuncellen naar het CZS. Voor studies van de BBB is een geschikt model dat de respectieve moleculen en functies van belang weergeeft essentieel. Productie van EECM-BMEC-achtige cellen met behulp van gedefinieerde reagentia en monsters van patiënten of gezonde proefpersonen biedt een schaalbaar menselijk BBB-model. De voordelen van een model met EECM-BMEC-achtige cellen ten opzichte van andere BBB-modellen zijn: 1) een morfologie en endotheeltranscriptoomprofiel30 dat lijkt op dat van primaire menselijke BMEC's; 2) de aanwezigheid van volwassen tight junctions; 3) wenselijke barrière-eigenschappen; en 4) de robuuste expressie van endotheeladhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- en P-selectine, CD99, melanoomceladhesiemolecuul (MCAM) en geactiveerd leukocytceladhesiemolecuul (ALCAM)22. Dit model is dus bijzonder nuttig voor het bestuderen van interacties tussen immuuncellen en BMEC's. Hoewel de permeabiliteit van kleine molecuul tracers hoger is voor EECM-BMEC-achtige cellen dan die eerder gerapporteerd voor iPSC-afgeleide BMEC-achtige cellen14,15, zijn de barrière-eigenschappen vrij goed te vergelijken met die beschreven voor primaire menselijke BMEC's. Deze gelijkenis geeft aan dat EECM-BMEC-achtige cellen waarschijnlijk een goed in vitro model van de BBB zijn. E-selectine-expressie op EECM-BMEC-achtige cellen onder fysiologische omstandigheden moet in aanmerking worden genomen bij het gebruik van dit model voor het bestuderen van niet-ontstoken BBB's die in vivo geen constitutieve E-selectine-expressie hebben 31. In onze vorige studie toonden we aan dat EECM-BMEC-achtige cellen de BBB konden fenocopie, zoals waargenomen in de hersenen van MS-patiënten met betrekking tot verstoorde tight junctions. Dit resulteert in een hogere permeabiliteit van kleine moleculen en een verhoogde expressie van functionele adhesiemoleculen, waardoor de verhoogde adhesie en transmigratie van immuuncellen over de BMEC-achtige cellen wordt bemiddeld32. Verder toonden we aan dat de activering van Wnt/β-catenine signalering de verstoring van tight junctions en verhoogde VCAM-1 expressie in MS-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellenkan verbeteren 32. Deze resultaten geven aan dat het model inderdaad nuttig is om de rol van de BBB bij neuro-immunologische ziekten, zoals MS, te bestuderen.
Alles bij elkaar genomen zijn EECM-BMEC-achtige cellen een veelbelovend hulpmiddel voor diepgaand begrip van pathofysiologische mechanismen op het niveau van de BBB en als een hulpmiddel om nieuwe therapeutische doelen voor BBB-stabilisatie te ontwikkelen. In de toekomst kan het model worden toegepast om BBB-disfunctie in een breder spectrum van ziekten te bestuderen en kan het wegen openen voor nieuwe therapeutische benaderingen.

De neurovasculaire eenheid (NVU) in het centrale zenuwstelsel (CZS) bestaat uit de zeer gespecialiseerde microvasculaire endotheelcellen (EC's), pericyten ingebed in het endotheelkeldermembraan en het parenchymale keldermembraan en astrocyteneindvoeten1. Binnen de NVU zijn microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC's) de belangrijkste componenten die de bloed-hersenbarrière (BBB) vormen. BMEC's vormen complexe en continue tight junctions en hebben een extreem lage pinocytotische activiteit in vergelijking met microvasculaire EC's in perifere organen, waardoor de BBB de vrije paracellulaire diffusie van in water oplosbare moleculen in het CZS kan remmen. De expressie van specifieke instroomtransporters en effluxpompen door BMEC's zorgt voor de opname en export van respectievelijk voedingsstoffen en schadelijke moleculen uit hetCZS 2. Bovendien controleert de BBB strikt de toegang van immuuncellen tot het CZS door lage niveaus van endotheeladhesiemoleculen tot expressie te brengen die cruciaal zijn voor de handel van immuuncellen in het CZS3. Onder fysiologische omstandigheden zijn de expressieniveaus van adhesiemoleculen op het oppervlak van BMEC's, zoals intercellulair adhesiemolecuul-1 (ICAM-1) en vasculaire celadhesiemolecuul-1 (VCAM-1), laag, maar deze niveaus nemen toe bij sommige neurologische aandoeningen2. Morfologische en functionele afbraak van de BBB wordt gemeld bij veel neurologische aandoeningen, zoals beroerte4, multiple sclerose (MS)5 en verschillende neurodegeneratieve ziekten 6,7,8. Gedetailleerd onderzoek van de cellulaire en moleculaire kenmerken van BMEC's onder zowel fysiologische als pathologische omstandigheden is een benadering voor het identificeren van nieuwe therapeutische strategieën die gericht zijn op de BBB.
Tot voor kort werden primaire of vereeuwigde BMEC's voor mensen en knaagdieren gebruikt om de BBB te bestuderen. Of conclusies op basis van diermodellen van de BBB gemakkelijk toepasbaar zijn op de menselijke BBB is echter onduidelijk, omdat de expressie van verschillende belangrijke moleculen, waaronder adhesiemoleculen en opgeloste dragereiwitten, verschilt tussen mensen en knaagdieren 9,10. Hoewel menselijke BMEC-lijnen zoals hCMEC/D3 de juiste niveaus van adhesiemoleculen11 uitdrukken, hebben deze vereeuwigde BMEC's over het algemeen geen complexe tight junctions en robuuste barrière-eigenschappen12. Primaire menselijke BMEC's zijn nuttig om barrièrefuncties te bestuderen13, maar ze zijn niet direct beschikbaar voor alle onderzoekers. Verder kunnen primaire BMEC's van patiënten moeilijk te verkrijgen zijn, omdat ze moeten worden verzameld via een hersenbiopsie of een operatie die alleen onder specifieke klinische omstandigheden wordt uitgevoerd.
Recente ontwikkelingen in stamceltechnologie hebben de differentiatie van verschillende menselijke celtypen mogelijk gemaakt, voortkomend uit stamcelbronnen zoals door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). De hiPSC-afgeleide modellen stellen ons in staat om pathofysiologische modellen op te stellen met behulp van patiënt-afgeleide monsters. Verschillende hiPSC-afgeleide celtypen kunnen worden gecombineerd om autologe coculturen of organoïden te vestigen die fysiologische omstandigheden beter nabootsen. Verschillende veelgebruikte protocollen 14,15,16,17,18,19 kunnen worden gebruikt om hiPSC-afgeleide BMEC-achtige cellen te differentiëren die robuuste diffusiebarrière-eigenschappen hebben met de expressie van BBB-specifieke transporters en effluxpompen, en zijn nuttig om de paracellulaire diffusie van kleine moleculen, moleculaire transportmechanismen en medicijnafgifte aan de hersenen te bestuderen 20,21. Eerdere studies hebben echter aangetoond dat veel gebruikte hiPSC-afgeleide BMEC-achtige cellen de expressie van belangrijke endotheeladhesiemoleculen missen, waaronder VCAM-1, selectines en ICAM-2, die verantwoordelijk zijn voor het bemiddelen van interacties tussen immuuncellen en de BBB22. Bovendien is gemeld dat eerdere van hiPSC afgeleide BMEC's gemengde endotheel- en epitheelkenmerken vertonen op transcriptioneel niveau23. Daarom ontwikkelden we de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), een nieuw protocol dat de differentiatie van hiPSC's in BMEC-achtige cellen mogelijk maakt die lijken op primaire menselijke BMEC's met betrekking tot morfologie, barrièrekenmerken en endotheeladhesiemolecuulexpressie. Dit protocol beschrijft de gedetailleerde methodologische procedures om hiPSC's te onderscheiden van BMEC-achtige cellen die een volwassen immuunfenotype vertonen.

<table><tbody><tr><td>0.22 mm Syringe filter</td><td>TPP</td><td>99722</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m Falcon cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Round-bottom tube</td><td>SPL</td><td>40005</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifuge tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plate, round bottom</td><td>SPL</td><td>34096</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>All-in-One Fluorescence Microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (503), serum free</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA), 7.5% in dPBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td></td></tr><tr><td>CellAdhere Dilution Buffer</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-07183</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>Chamber slides</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>178599</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1263</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV from human placenta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue culture plates (12-well)</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue culture plates (6-well)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Cryo tube innercap 2.0 mL</td><td>Watson</td><td>1396-201S</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO), sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucose, [-] L-glutamine, [-] pyruvate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s (d) PBS (without calcium, magnesium)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s modified Eagle&rsquo;s medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11320074</td><td></td></tr><tr><td>EasySepFITC Positive Selection Kit II</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18558</td><td></td></tr><tr><td>EasySepMagnet</td><td>Stemcell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Solution0.02% in DPBS</td><td>Sigma</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17144002</td><td></td></tr><tr><td>FIJI software (Version 2.0.0)</td><td>Image J, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version10</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F6377</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Human Endothelial Serum Free Medium (hESFM)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11111-044</td><td></td></tr><tr><td>Human fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>Tocris</td><td>233-FB-500</td><td></td></tr><tr><td>iPS human induced pluripotent stem cells</td><td>Riken RBC</td><td>HPS1006</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate (100x)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15160-047</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM (1003)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, growth factor reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (1003)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32213</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus-cGMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>ST-100-0276</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 complete kit (basal medium plus 53 supplement)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Millipore</td><td>104005</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IFN-gamma Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human IL-2</td><td>BD Biosciences</td><td>554603</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-alpha Protein</td><td>R&amp;D Systems</td><td>210-TA-020</td><td></td></tr><tr><td>ROCK inhibitor Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21875-034</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>FEATHER</td><td>2975-11</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk</td><td>BD Biosciences</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Transwells, PC Membrane, 0.4 mm, 12 mm, TC-Treated</td><td>Corning</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>078180</td><td></td></tr><tr><td>Water, sterile, cell culture</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells to Brain Microvascular Endothelial Cell-Like Cells with a Mature Immune Phenotype

Bloed-hersenbarrière (BBB) disfunctie is een pathologisch kenmerk van veel neurodegeneratieve en neuro-inflammatoire ziekten die het centrale zenuwstelsel (CZS) beïnvloeden. Vanwege de beperkte toegang tot ziektegerelateerde BBB-monsters is het nog steeds niet goed begrepen of BBB-storing oorzakelijk is voor de ontwikkeling van de ziekte of eerder een gevolg is van het neuro-inflammatoire of neurodegeneratieve proces. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) bieden daarom een nieuwe mogelijkheid om in vitro BBB-modellen van gezonde donoren en patiënten op te stellen en zo ziektespecifieke BBB-kenmerken van individuele patiënten te bestuderen. Er zijn verschillende differentiatieprotocollen vastgesteld voor het afleiden van microvasculaire endotheelcellen (BMEC)-achtige cellen uit hiPSC's. Overweging van de specifieke onderzoeksvraag is verplicht voor de juiste keuze van het respectieve BMEC-differentiatieprotocol. Hier beschrijven we de uitgebreide endotheelcelcultuurmethode (EECM), die is geoptimaliseerd om hiPSC's te differentiëren in BMEC-achtige cellen met een volwassen immuunfenotype, waardoor de studie van immuuncel-BBB-interacties mogelijk is. In dit protocol worden hiPSC's eerst gedifferentieerd in endotheelvoorlopercellen (EPC's) door Wnt/β-catenine signalering te activeren. De resulterende cultuur, die gladde spierachtige cellen (SMLCs) bevat, wordt vervolgens sequentieel gepasseerd om de zuiverheid van endotheelcellen (EC's) te verhogen en BBB-specifieke eigenschappen te induceren. Co-cultuur van EECM-BMEC's met deze SMLCs of geconditioneerd medium van SMLCs maakt de reproduceerbare, constitutieve en cytokine-gereguleerde expressie van EC-adhesiemoleculen mogelijk. Belangrijk is dat EECM-BMEC-achtige cellen barrière-eigenschappen vaststellen die vergelijkbaar zijn met primaire menselijke BMEC's, en vanwege hun expressie van alle EC-adhesiemoleculen verschillen EECM-BMEC-achtige cellen van andere hiPSC-afgeleide in vitro BBB-modellen. EECM-BMEC-achtige cellen zijn dus het model bij uitstek voor het onderzoeken van de potentiële impact van ziekteprocessen op het niveau van de BBB, met een impact op immuuncelinteractie op een gepersonaliseerde manier.

Permeabiliteitstest De permeabiliteit van natriumfluoresceïne werd berekend door de fluorescentie-intensiteit van het medium verzameld uit de onderste kamer te meten na 15, 30, 45 en 60 minuten. Op elk tijdstip wordt in totaal 150 μl medium bemonsterd en het ontbrekende volume van 150 μl wordt vervangen door hECSR-medium. de fluorescentie-intensiteit wordt afgelezen met behulp van een fluorescerende plaatlezer (485 nm excitatie/530 nm emissie) en de juiste signalen, klaringsvolumes en permeabiliteiten worden berekend met behulp van een eerder beschreven formule18 (tabel 2). Het wordt aanbevolen om te bevestigen of de fluorescentie-intensiteit van natriumfluoresceïne in de loop van de tijd toeneemt. Meerdere filters - ten minste drievoudige - moeten worden gebruikt voor één test om de reproduceerbaarheid te garanderen. Voor gezonde controle-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen moet de natriumfluoresceïne (376 Da) permeabiliteit lager zijn dan 0,3 x 10-3 cm / min. Om de vorming van een confluente EECM-BMEC-achtige celmonolaag te bevestigen, moet immunofluorescentiekleuring voor junctionele eiwitten van de EECM-BMEC-achtige cellen van elk filter dat in de permeabiliteitstests wordt gebruikt, na deze test worden uitgevoerd.
Immunofluorescentiekleuring Immunofluorescentiekleuring van EECM-BMEC-achtige cel junctionele moleculen, waaronder claudin-5, occludin en VE-cadherine1, werd gebruikt om celmorfologie en de aanwezigheid van continue en volwassen juncties te beoordelen (figuur 4). De monolagen van EECM-BMEC-achtige cellen op de membranen van de filterinzetstukken werden gedurende 20 s gefixeerd met koude methanol (-20 °C), geblokkeerd met blokkeringsbuffer (tabel 1) en vervolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen. De EECM-BMEC-achtige cellen vertoonden spindelachtige vormen en zigzagvormige juncties, die beide karakteristieke morfologische kenmerken zijn van BMEC's27. Stimulatie van de EECM-BMEC-achtige cellen gezaaid op kamerglaasjes met pro-inflammatoire cytokines, zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interferon-γ (INF-γ) (0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ) verdund in SMLC-afgeleid geconditioneerd medium, upreguleerde de expressie van adhesiemoleculen, zoals ICAM-1 en VCAM-128 (figuur 5). Representatieve beelden van gladde spiercelmarkers, waaronder α-gladde spieractine (SMA), calponine en gladde spiereiwit 22-Alpha (SM22a)29, worden weergegeven in figuur 6. SMLCs gezaaid op de kamerschuif werden gedurende 10 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde, geblokkeerd met blokkeringsbuffer en vervolgens geïncubeerd met primaire en secundaire antilichamen.
Flowcytometrie-analyse van celoppervlakadhesiemolecuulexpressie door EECM-BMEC-achtige cellen Representatieve resultaten voor celoppervlakexpressie van endotheeladhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen worden weergegeven in figuur 7. Stimulatie met pro-inflammatoire cytokines, zoals TNF-α en INF-γ, upreguleerde de celoppervlakexpressie van verschillende adhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, VCAM-1 en P-selectine. Het kweken van EECM-BMEC-achtige cellen met SMLC-geconditioneerde medium verbeterde endotheliale VCAM-1 celoppervlakexpressie. Het effect van de inductie van VCAM-1 celoppervlakexpressie kan variëren tussen batches SMLC-geconditioneerd medium. Het wordt aanbevolen om bij het onderscheiden van SMLCs verschillende partijen geconditioneerd medium geoogst uit SMLCs, afgeleid van dezelfde hiPSC-bron, op te slaan om na te gaan welke partij de juiste expressie van VCAM-1 induceert.
Immuunceladhesietest onder statische omstandigheden Het aantal aangehechte immuuncellen correleerde met het expressieniveau van functionele adhesiemoleculen op het oppervlak van EECM-BMEC-achtige cellen. Stimulatie met inflammatoire cytokines upreguleerde de expressie van endotheeladhesiemoleculen en bevorderde het verhoogde aantal immuuncellen dat zich hechtte aan EECM-BMEC-achtige celmonolagen (figuur 8). Het huidige experiment demonstreerde de functionaliteit van adhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen, waardoor dit model geschikt is voor het bestuderen van immuuncel-EC-interacties.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig02.jpg"> Figuur 2: Zuivering van CD31+ EC's. Dot plots van representatieve flowcytometriegegevens van scatter gating van EC's en FITC-gelabelde CD31-kleuring van celpopulaties vóór (stap 1.4.7) en na (stap 1.4.14) MACS. MACS verbetert de zuiverheid van CD31+ EPC's in de populatie. Afkortingen: SSC = side scatter; FSC = voorwaartse verstrooiing; FITC = fluoresceïne-isothiocyanaat; MACS = magnetische geactiveerde celsortering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig03.jpg"> Figuur 3: EECM-BMEC-monolayer permeabiliteit (10-3 cm/min) berekend op basis van de ruwe fluorescentie-intensiteit van natriumfluoresceïne. De lineaire helling van het klaringsvolume wordt berekend met behulp van lineaire regressie voor elk filter (figuur 3A). De permeabiliteit van natriumfluoresceïne wordt berekend met behulp van twee formules (figuur 3B). (A) De lineaire helling van het klaringsvolume ten opzichte van de tijd werd berekend met behulp van lineaire regressie voor filter 1 (mc1) en het blancofilter (mf). De m c1 en m f zijn coëfficiënten van respectievelijk Xc1 en Xf. (B) Formule voor het berekenen van de fluoresceïnepermeabiliteit (Pe) met behulp van mc en mf (formule 1). Pe-eenheden werden omgebouwd met behulp van het oppervlak van een filter (Formule 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig04.jpg"> Figuur 4: EECM-BMEC-achtige cellen vertonen volwassen cellulaire juncties. Immunofluorescentiekleuring voor claudin-5, occludine of VE-cadherine (rood) in EECM-BMEC-achtige cellen gekweekt op membranen van insertfilters. Kernen werden gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (blauw). Kleuring werd uitgevoerd op exact dezelfde filterinzetstukken die werden gebruikt voor de permeabiliteitstests. Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig05.jpg"> Figuur 5: Expressie van endotheeladhesiemoleculen door EECM-BMEC-achtige cellen. Immunofluorescentiekleuring werd uitgevoerd op EECM-BMEC-achtige cellen gekweekt op membranen van filterinzetstukken in aanwezigheid van SMLC-afgeleide CM. Immunostaining voor ICAM-1 of VCAM-1 (rood) wordt getoond voor niet-gestimuleerde en 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN- γ gestimuleerde EECM-BMEC-achtige cellen. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig06.jpg"> Figuur 6: Karakterisering van SMLCs. Immunocytochemie van α-gladde spieractine (SMA), calponine of gladde spiereiwit 22-Alpha (SM22a) (rood) voor SMLCs gekweekt op kamerglaasjes wordt weergegeven. Kernen waren gekleurd met DAPI (blauw). Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig07.jpg"> Figuur 7: Endotheliale celoppervlakexpressie van adhesiemoleculen op EECM-BMEC-achtige cellen. Resultaten van flowcytometrie-analyse van EC surface adhesion molecule expression op EECM-BMEC-achtige cellen worden getoond. EECM-BMEC-achtige cellen werden gekweekt met behulp van SMLC-afgeleid geconditioneerd medium. Blauwe, rode en grijze lijnen van de histogramoverlays tonen respectievelijk de niet-gestimuleerde (NS) conditie, 1 ng / ml TNF-α + 20 IE / ml IFN-γ-gestimuleerde toestand en isotypecontrole. De celoppervlakexpressie van endotheeladhesiemoleculen, waaronder intercellulair adhesiemolecuul 1 (ICAM-1), ICAM-2, vasculaire celadhesiemolecuul 1 (VCAM-1), P-selectine, E-selectine, CD99 en bloedplaatjes-endotheelceladhesiemolecuul-1 (PECAM-1) werden beoordeeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65134/65134fig08.jpg"> Figuur 8: Hechting van immuuncellen op EECM-BMEC-achtige cellen. (A) Afbeeldingen van fluorescerend gelabelde adherente immuuncellen op niet-gestimuleerde (NS) en 0,1 ng / ml TNF-α + 2 IE / ml IFN-γ-gestimuleerde (TNF-α + IFN-γ) EECM-BMEC-achtige celmonolagen. De afbeeldingen komen overeen met de centra van de putten. Schaalbalk = 50 μm. (B) Het aantal fluorescerend gelabelde immuuncellen op monolagen van NS- en TNF-α + IFN-γ-gestimuleerde EECM-BMEC-achtige cellen. Aanhangende immuuncellen/gezichtsvelden (FOV's) werden automatisch geteld met behulp van FIJI-software. Punten staan voor het aantal gekoppelde T-cellen. Balken tonen de gemiddelde waarde en foutbalken tonen de standaarddeviatie (SD) van acht onderzoeken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/65134fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Bijzonderheden over specifieke reagentia voor de tests. De naam en de exacte hoeveelheid ingrediënten voor elk specifiek reagens worden beschreven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table1_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Voorbeeld van ruwe gegevens van de fluorescentieplaatlezer voor Pe-berekening. Getallen in vetgedrukte letters zijn de ruwe fluorescentie-intensiteit van natriumfluoresceïne gemeten door een plaatlezer. Om de gegevens nauwkeurig te analyseren, is het noodzakelijk om het achtergrondsignaal uit de onbewerkte waarden te verwijderen en rekening te houden met enig signaalverlies als gevolg van het bemonsteren van de onderste kamer en vervolgens het signaal te corrigeren. Na aftrek van de achtergrond vertoont het monster van 15 minuten bijvoorbeeld een signaal van 100 relatieve fluorescentie-eenheden (RFU) en vertoont het monster van 30 minuten een signaal van 150 RFU. Het gecorrigeerde signaal op 30 min is (150 RFU + de ontbrekende waarden op 15 min [100 RFU x 150 μL/1.500 μL]), wat 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU is. Het klaringsvolume = (1.500 x [S B,t])/(S T,60 min), waarbij 1.500 het volume van de onderste kamer is (1.500 μL), S B,t het gecorrigeerde signaal op tijdstip t, en ST,60 min het signaal van de bovenste kamer op 60 min. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65134/Table2_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Blood-brain barrier (BBB) dysfunction is a pathological hallmark of many neurodegenerative and neuroinflammatory diseases affecting the central nervous ...

Dit is het eerste protocol dat het mogelijk maakt om door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen te differentiëren in microvasculaire endotheelcellen in de hersenen met goede barrière-eigenschappen, volwassen tight junctions en expressie van endotheelceladhesiemoleculen die immuuncelmigratie naar het centrale beginnerssysteem bemiddelen. EECM-BMEC-achtige cellen maken het mogelijk om immuuncelmigratie over de bloed-hersenbarrière te bestuderen met bloed-hersenbarrièremodellen afgeleid van de patiënten op een volledig autologe manier. Het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen van MS-patiënten in EECM-BMEC-achtige cellen heeft ons in staat gesteld om intrinsieke barrièredefecten te identificeren in deze in vitro modellen van de MS-patiënten.Deze culturele methode zal ons daarom in staat stellen om in de toekomst de moleculaire paden te identificeren die ten grondslag liggen aan deze aangetaste barrière-eigenschappen. Deze methoden kunnen worden toegepast op een breder spectrum van ziekten waarbij in serum morfologie en immuuncelinfiltratie in het CZS van cruciaal belang zijn voor deze pathogenese, bijvoorbeeld beroerte of neuro-infectie. Wanneer u deze techniek voor de eerste keer probeert, gebruik dan dezelfde hoeveelheid celmaterialen.De zaaidichtheid is de sleutel tot succes van dit protocol en moet worden aangepast afhankelijk van de gebruikte klonen. Kinya Matsuo, universitair docent van mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Op dag vijf van de endotheelvoorlopercel kweekt u het medium uit de putten en voegt u aan elke put een milliliter dissociatiereagens toe.Incubeer de plaat gedurende zes tot acht minuten op 37 graden. Met behulp van een micropipette dissociëren en singulariseren van de cellen. Laat vervolgens de celsuspensie door een celzeef van 40 micrometer filteren om in een buis van 50 milliliter te filteren met 10 milliliter DMEM / F-12 10-medium.Om de verteringsreactie te stoppen, voegt u DM DMEM/F-12 10 medium toe tot de 50 milliliter. Pipet grondig en reserveer 10 microliter voor het tellen van de cellen. Centrifugeer de buis van 50 milliliter op 200 g gedurende vijf minuten op 20 tot 25 graden Celsius om de cellen te pelleteren.Verwijder na het centrifugeren het supernatant en resuspensie van de celkorrel met 10 milliliter DMEM/F-12 10 medium. Breng de celsuspensie over in een verse buis van 15 milliliter. Centrifugeer op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 tot 25 graden celsius om de cellen opnieuw te pelleteren.Suspensie vervolgens de celpellet in stroombuffer één. Voeg vervolgens het FCR-blokkerende reagens toe in een verhouding van één op 100 en incubeer gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens de één tot 200 verhouding verdund fluoresceïne-isothiocyanaat of FITC-gelabeld CD31-antilichaam toe.Incubeer de suspensie gedurende 30 minuten in het donker bij een temperatuur tussen de 20 en 25 graden. Voeg aan het einde van de incubatie 10 milliliter stroombuffer één toe aan het monster en reserveer 10 microliter van de suspensie voor flowcytometrie-analyse om de fractie CD31-positieve cellen te bepalen. Centrifugeer de cellen op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 tot 25 graden.Na centrifugatie resuspendien de cellen met stroombuffer één oplossing. Voeg vervolgens vijf microliter van de FITC-selectiecocktail toe per 100 microliter van de celsuspensie. Meng de oplossing grondig door pipetteren en incubeer in het donker gedurende 15 minuten bij een temperatuur tussen 20 en 25 graden Celsius.Voeg vervolgens vijf microliter magnetische nanodeeltjes toe per 100 microliter celsuspensie. Pipetteer het mengsel goed en incubeer in het donker gedurende 10 minuten bij 20 tot 25 graden. Breng de celsuspensie over naar een vijf milliliter flowcytometriebuis en voeg stroombuffer één toe om een totaal volume van 2,5 milliliter te krijgen.Plaats vervolgens de flowcytometriebuis gedurende vijf minuten in de magneet. In een continue beweging keert u de magneet om en decanteert u de celsuspensie die FITC CD31-antilichaam ongelabelde cellen bevat. Houd de magneet en buis twee tot drie seconden in de omgekeerde positie en verwijder vervolgens de resterende vloeistof.Zuig eventuele druppels op de rand van de buis op voordat u de buis terugbrengt naar een rechtopstaande positie. Haal de flowcytometriebuis uit de magneet en voeg 2,5 milliliter flowbuffer één toe om de resterende CD31-positieve cellen te wassen. Pietteer de cellen voorzichtig twee of drie keer op en neer om ze opnieuw te suspenderen.Plaats vervolgens de stroombuis gedurende vijf minuten in de magneet. Herhaal het wassen minstens vier keer om de FITC CD31 ongelabelde cellen uit de buis te verwijderen. Verwijder de stroombuis van de magneet en resuspendien de gezuiverde CD31-positieve cellen met de gewenste hoeveelheid van een geschikt medium.Reserveer twee aliquots van 10 microliter van de suspensie, één voor celtelling en de tweede om flowcytometrie-analyse uit te voeren om de zuiverheid van CD31-positieve cellen in post-magnetische geactiveerde celsorteermonsters te beoordelen. Verwijder het HECSR-medium uit de zes putplaten met endotheel- en niet-endotheelcelpopulaties. Voeg vervolgens een milliliter dissociatiereagens toe aan elk putje.Observeer de celmorfologie zorgvuldig onder een microscoop. Wanneer de endotheelcellen helder en rond lijken, meestal binnen twee tot vijf minuten, maak ze dan los door op de rand van de plaat te tikken. De niet-endotheelcellen blijven aan de plaat vastzitten.Verzamel met behulp van een micropipet zorgvuldig de losgemaakte endotheelcellen zonder de niet-endotheelcellen te verstoren en breng ze over naar een centrifugebuis van 15 milliliter of 50 milliliter met vier milliliter DMEM / F-12 10 per milliliter dissociatiereagens. Voeg vervolgens twee milliliter HECSR-medium toe aan de putten met de resterende aangehechte niet-endotheelcellen om de gladde spierachtige cellen of SMLCs te vestigen en plaats de plaat in de incubator. Breng de endotheelcelsuspensie over in een centrifugebuis.Meng grondig en reserveer 10 microliter van de suspensie voor celtelling. Centrifugeer de resterende cellen op 200 g gedurende vijf minuten bij 20 tot 25 graden Celsius. Voeg vervolgens twee milliliter HECSR-medium toe.Verwijder vervolgens het collageen voor oplossing uit een eerder bereide collageengecodeerde zesputplaat en voeg twee milliliter van de endotheelcelsuspensie toe aan elke put. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden celsius in 5% koolstofdioxide. Immunofluorescente kleuring van EECM-BMEC-achtige cel junctionele moleculen in waaronder claudin-5, occludin en VE-cadherine werd gebruikt om de celmorfologie en de aanwezigheid van continue en volwassen juncties te beoordelen.Stimulatie van de EECM-BMEC-achtige cellen gezaaid op kamerglaasjes met pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrosefactor alfa en interferon gamma verdund in SMLC afgeleid geconditioneerd medium upreguleerde de expressie van adhesiemoleculen zoals ICAM-1 en VCAM-1. Representatieve afbeeldingen van gladde spiercelmarkers, waaronder alfa-gladde spieractine, calponine en gladde spiereiwit 22 alfa, worden hier getoond. Stimulatie van de EECM-BMEC-achtige cellen met pro-inflammatoire cytokines zoals tumornecrosefactor alfa en interferon gamma upreguleerde de celoppervlakexpressie van verschillende adhesiemoleculen, waaronder ICAM-1, VCAM-1 en P-selectine.Verder heeft stimulatie met inflammatoire cytokines ook de expressie van endotheeladhesiemoleculen verhoogd en het verhoogde aantal immuuncellen bevorderd dat zich hechtte aan EECM-BMEC-achtige celmonolagen EECM-BMEC-achtige cellen zijn ook veelbelovend voor diepgaand begrip van pathofysiologische mechanismen op het niveau van de bloed-hersenbarrière, en als een waardevol hulpmiddel om een nieuw therapeutisch doelwit te ontwikkelen voor stabilisatie van de bloed-hersenbarrière.

differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells-to-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video demonstrates a protocol to induce the differentiation of induced pluripotent stem cells into brain endothelial cells.

Generating Brain Endothelial Cells from Induced Pluripotent Stem Cells

This video demonstrates the procedure of the differentiation of human pluripotent cells into microglia-like cells. The process involves forming embryoid bodies, transferring them to coated wells, and using specific growth factors to guide differentiation into primitive macrophage precursors, which finally differentiate into microglia-like cells.

Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Microglia-Like Cells

This video demonstrates a multi-step process for differentiating human iPSCs into brain microvascular endothelial cells. The resulting differentiated cells closely mimic brain microvascular endothelial cells, characterized by tight junctions, making them ideal for research on brain diseases.

Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells into Brain Microvascular Endothelial Cells

Targeting hersen-ingezeten cellen voor directe afstamming-herprogrammering biedt nieuwe perspectieven voor de hersenen reparatie. Hier beschrijven we een protocol hoe culturen verrijkt voor hersen-ingezeten pericytes van de menselijke hersenschors volwassen opstellen en deze om te zetten naar geïnduceerde neuronen door-retrovirus gemedieerde expressie van de transcriptiefactoren Sox2 en Ascl1.

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) worden beschouwd als een krachtig instrument voor drugs- en chemische screening en voor de ontwikkeling van nieuwe in vitro modellen voor toxiciteitsonderzoek, inclusief neurotoxiciteit. Hier wordt een gedetailleerd protocol voor de differentiatie van hiPSCs in neuronen en glia beschreven.

Protocol voor de differentiatie van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen in gemengde culturen van neuronen en glia voor het testen van neurotoxiciteit

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een meercellige neurovasculaire eenheid die hersenhomeostase strak regugugaat. Door menselijke iPSCs en organ-on-chip technologieën te combineren, hebben we een gepersonaliseerde BBB-chip gegenereerd, geschikt voor ziektemodellering en CNS-voorspellingen voor medicijndoordring. Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de productie en werking van de BBB-chip.

Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip

Dit protocol beschrijft een aangepaste methode om microvasculaire endotheelcellen van de hersenen af te leiden, uit te breiden en cryopreserveren, verkregen door het differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen, en om de eigenschappen van de bloed-hersenbarrière in een ex vivo model te bestuderen.

Afleiding, expansie, cryopreservatie en karakterisering van hersenmicrovasculaire endotheelcellen uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Dit protocol beschrijft het differentiatieproces van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) in microglia-achtige cellen voor in vitro experimenten. We nemen ook een gedetailleerde procedure op voor het genereren van menselijke synaptosomen uit iPSC-afgeleide lagere motorneuronen die kunnen worden gebruikt als substraat voor in vitro fagocytosetests met behulp van live-cell imaging-systemen.

Humane microglia-achtige cellen: differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen en in vitro live-cel fagocytosetest met behulp van humane synaptosomen

We presenteren een protocol om een menselijke hersenorganoïde met residente microglia te genereren door geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide hematopoëtische voorlopercellen (HPC's) op te nemen in de ontwikkeling van organoïden.

Afleiding van een organoïde van het menselijk brein met microglia-ontwikkeling

Leer hoe je menselijke iPSC's differentieert naar hersenmicrovasculaire endotheelcelachtige cellen met de EECM-methode. Deze techniek maakt onderzoek naar immuuncelinteracties en bloed-hersenbarrièrefunctie mogelijk.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype (Video) | JoVE Journal

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Meer video's verkennen