Name: High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer nanomechanische metingen met een hoogfrequente magnetische pincet aan krachtgevoelige biomoleculen zoals DNA-hairpins en SNARE-complexen. Deze methode biedt inzicht in mechanobiologische processen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door de National Research Foundation of Korea (NRF) subsidie gefinancierd door de Koreaanse overheid (MSIT) (NRF-2022R1C1C1012176, NRF-2021R1A4A1031754 en NRF- 2021R1A6A1A10042944). S.-H.R. werd ondersteund door de NRF-subsidie (2021R1C1C2009717).

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

In dit werk introduceerden we een single-molecule krachtspectroscopie-opstelling die structurele veranderingen van biomoleculen met hoge spatiotemporale precisie kan waarnemen. De gebruikte high-speed CMOS-camera verkrijgt 1.200 frames s−1 met een resolutie van 1.280 x 1.024, waardoor 1,2 kHz kralentracking mogelijk is. De snelheid van metingen wordt momenteel echter beperkt door de kraalvolgsoftware, dus de ROI wordt meestal teruggebracht tot kleinere gebieden bij metingen met hoge snelheid. Het hoge vermogen...

Cellen voelen en reageren actief op mechanische prikkels. Daarbij vertonen veel biomoleculen krachtafhankelijke eigenschappen die dynamische structurele veranderingen mogelijk maken. Bekende voorbeelden zijn mechanosensitieve ionkanalen en cytoskeletelementen die de cellen voorzien van belangrijke mechanische informatie uit hun omgeving.
Daarnaast kunnen moleculen die een unieke krachtdragende aard vertonen ook in bredere zin als mechanosensitief worden beschouwd. Lokale vorming en smelten van nucleïnezuurduplexen, evenals hogere-ordestructuren zoals G-quadruplexen, spelen bijvoorbeeld een cruciale rol bij replicatie, transcriptie, recombinatie en meer recent genoombewerking. Bovendien voeren sommige neuronale eiwitten die betrokken zijn bij synaptische communicatie hun functies uit door fysieke krachten te genereren die de niveaus van typische intermoleculaire interacties overschrijden. Het maakt niet uit welk voorbeeld men bestudeert, het onderzoeken van nanomechanica van de betrokken biomoleculen met hoge spatiotemporale precisie zal zeer nuttig blijken te zijn bij het onthullen van moleculaire mechanismen van de bijbehorende mechanobiologische processen 1,2,3.
Single-molecule krachtspectroscopiemethoden hebben gediend als krachtige hulpmiddelen om de mechanische eigenschappen van biomoleculen 2,4,5,6 te onderzoeken. Ze kunnen structurele veranderingen in nucleïnezuren en eiwitten gelijktijdig met de toepassing van kracht volgen, waardoor krachtafhankelijke eigenschappen worden onderzocht. Twee bekende opstellingen zijn optische pincetten en magnetische pincetten (MT's), die kralen ter grootte van een micron gebruiken om moleculen 5,6,7,8 te manipuleren. In deze platforms worden polystyreen (voor optische pincetten) of magnetische kralen (voor MT's) vastgebonden aan doelmoleculen (bijv. Nucleïnezuren en eiwitten) via moleculaire "handvatten", meestal gemaakt van korte fragmenten van dubbelstrengs DNA (dsDNA). De kralen worden vervolgens verplaatst om kracht uit te oefenen en in beeld gebracht om hun locaties te volgen die rapporteren over structurele veranderingen in doelmoleculen. Optische en magnetische pincetten zijn grotendeels uitwisselbaar in hun toepassingen, maar er zijn belangrijke verschillen in hun benaderingen van het regelen van kracht. Optische pincetten zijn intrinsiek positiekleminstrumenten die kralen in positie vangen, waardoor de uitgeoefende kracht fluctueert wanneer een doelconstructie vormveranderingen ondergaat; Extensieverhoging, zoals door het uitvouwen, maakt de tether los en vermindert de spanning, en vice versa. Hoewel actieve feedback kan worden geïmplementeerd om de kracht in optische pincetten te regelen, werken MT's daarentegen van nature als een krachtklemapparaat, waarbij gebruik wordt gemaakt van stabiele, verafgelegen magnetische krachten door permanente magneten, die ook bestand zijn tegen omgevingsverstoring.
Ondanks hun lange geschiedenis en eenvoudige ontwerp zijn MT's achtergebleven bij optische pincetten in hun toepassingen voor zeer nauwkeurige metingen, grotendeels vanwege technische uitdagingen bij het volgen van snelle kralen. Onlangs hebben verschillende groepen echter gezamenlijk leiding gegeven aan een veelzijdige verbetering van zowel hardware als software voor MT-instrumenten 2,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . In dit werk introduceren we een voorbeeld van een dergelijke opstelling die op 1,2 kHz draait en beschrijven we hoe deze kan worden gebruikt om nanomechanische metingen uit te voeren op krachtgevoelige biomoleculen. Als modelsystemen gebruiken we DNA-haarspelden en neuronale SNARE-complexen en onderzoeken we hun snelle, structurele veranderingen in het piconewton-regime. DNA-haarspelden vertonen eenvoudige tweetoestandsovergangen in een goed gedefinieerd krachtbereik van20,21 en dienen daarom als speelgoedmodellen om de prestaties van een pincetopstelling te verifiëren. Terwijl de SNARE-eiwitten zich samenvoegen tot een krachtgevoelig complex dat membraanfusie22 aandrijft, zijn ze ook uitgebreid bestudeerd door krachtspectroscopie met één molecuul 14,23,24,25. Standaardbenaderingen voor het analyseren van gegevens en het extraheren van nuttige informatie over thermodynamica en kinetiek worden gepresenteerd. We hopen dat dit artikel de toepassing van zeer nauwkeurige MT's in mechanobiologische studies kan vergemakkelijken en lezers kan motiveren om hun eigen krachtgevoelige interessesystemen te verkennen.

<table><tbody><tr><td>Materials for construct synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose gel electrophoresis system</td><td>Advance</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>DNA ladder</td><td>Bioneer</td><td>D-1037</td><td></td></tr><tr><td>nTaq polymerase</td><td>Enzynomics</td><td>P050A</td><td></td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>LaboPass</td><td>CMR0112</td><td></td></tr><tr><td>PEGylated SMCC crosslinker / SM(PEG)2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22102</td><td>For SNARE&ndash;DNA coupling</td></tr><tr><td>Primer B</td><td>Bioneer</td><td>5'-Biotin/TCGCCACCATCATTTCCA-3'</td><td>For 5-kbp force calibration construct and DNA handles</td></tr><tr><td>Primer B_hp</td><td>IDT</td><td>5'-Biotin/TTTTTTTTTTGTTCTCTATTT TTTTAGAGAAC /AP site/ /AP site/ TCGCCACCATCATTTCCA-3'</td><td>For hairpin construct</td></tr><tr><td>Primer N</td><td>Bioneer</td><td>5'-C6Amine/CATGTGGGTGACGCGAAA-3'</td><td>For DNA handles</td></tr><tr><td>Primer Z</td><td>Bioneer</td><td>5'-Azide/TCGCCACCATCATTTCCA-3'</td><td>For DNA handles</td></tr><tr><td>Primer Z_5k</td><td>Bioneer</td><td>5'-Azide/TTAGAGAGTATGGGTATATGACA TCG-3'</td><td>For 5-kbp force calibration construct</td></tr><tr><td>Primer Z_hp</td><td>Bioneer</td><td>5'-Azide/GTGGCAGCATGACACC-3'</td><td>For hairpin construct</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>&lambda;-DNA</td><td>Bioneer</td><td>D-2510</td><td>Template strand for PCR</td></tr><tr><td>DNA sequences for SNARE proteins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6×His-tagged SNAP-25b (2-206; capitalized) in pET28a</td><td>homemade</td><td>tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgca ttaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgca gcgtgaccgctacacttgccagcgccctagc gcccgctcctttcgctttcttcccttccttt ctcgccacgttcgccggctttccccgtcaag ctctaaatcgggggctccctttagggttccg atttagtgctttacggcacctcgaccccaaa aaacttgattagggtgatggttcacgtagtg ggccatcgccctgatagacggtttttcgccc tttgacgttggagtccacgttctttaatagt ggactcttgttccaaactggaacaacactca accctatctcggtctattcttttgatttata agggattttgccgatttcggcctattggtta aaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacg cgaattttaacaaaatattaacgtttacaat ttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgc ggaacccctatttgtttatttttctaaatac attcaaatatgtatccgctcatgaattaatt cttagaaaaactcatcgagcatcaaatgaaa ctgcaatttattcatatcaggattatcaata ccatatttttgaaaaagccgtttctgtaatg aaggagaaaactcaccgaggcagttccatag gatggcaagatcctggtatcggtctgcgatt ccgactcgtccaacatcaatacaacctatta atttcccctcgtcaaaaataaggttatcaag tgagaaatcaccatgagtgacgactgaatcc ggtgagaatggcaaaagtttatgcatttctt tccagacttgttcaacaggccagccattacg ctcgtcatcaaaatcactcgcatcaaccaaa ccgttattcattcgtgattgcgcctgagcga gacgaaatacgcgatcgctgttaaaaggaca attacaaacaggaatcgaatgcaaccggcgc aggaacactgccagcgcatcaacaatatttt cacctgaatcaggatattcttctaatacctg gaatgctgttttcccggggatcgcagtggtg agtaaccatgcatcatcaggagtacggataa aatgcttgatggtcggaagaggcataaattc cgtcagccagtttagtctgaccatctcatct gtaacatcattggcaacgctacctttgccat gtttcagaaacaactctggcgcatcgggctt cccatacaatcgatagattgtcgcacctgat tgcccgacattatcgcgagcccatttatacc catataaatcagcatccatgttggaatttaa tcgcggcctagagcaagacgtttcccgttga atatggctcataacaccccttgtattactgt ttatgtaagcagacagttttattgttcatga ccaaaatcccttaacgtgagttttcgttcca ctgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaa ggatcttcttgagatcctttttttctgcgcg taatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccacc gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaa gagctaccaactctttttccgaaggtaactg gcttcagcagagcgcagataccaaatactgt ccttctagtgtagccgtagttaggccaccac ttcaagaactctgtagcaccgcctacatacc tcgctctgctaatcctgttaccagtggctgc tgccagtggcgataagtcgtgtcttaccggg ttggactcaagacgatagttaccggataagg cgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtg cacacagcccagcttggagcgaacgacctac accgaactgagatacctacagcgtgagctat gagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaa ggcggacaggtatccggtaagcggcagggtc ggaacaggagagcgcacgagggagcttcca gggggaaacgcctggtatctttatagtcctgt cgggtttcgccacctctgacttgagcgtcga tttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcc tatggaaaaacgccagcaacgcggccttttt acggttcctggccttttgctggccttttgct cacatgttctttcctgcgttatcccctgatt ctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg agctgataccgctcgccgcagccgaacgacc gagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcgg aagagcgcctgatgcggtattttctccttac gcatctgtgcggtatttcacaccgcatatat ggtgcactctcagtacaatctgctctgatgc cgcatagttaagccagtatacactccgctat cgctacgtgactgggtcatggctgcgccccg acacccgccaacacccgctga

high-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Magnetisch pincet met één molecuul (MT's) heeft gediend als krachtig hulpmiddel om biomoleculen, zoals nucleïnezuren en eiwitten, krachtig te ondervragen en is daarom klaar om nuttig te zijn op het gebied van mechanobiologie. Omdat de methode vaak afhankelijk is van beeldgebaseerde tracking van magnetische kralen, heeft de snelheidslimiet bij het opnemen en analyseren van afbeeldingen, evenals de thermische fluctuaties van de kralen, de toepassing ervan lang belemmerd bij het observeren van kleine en snelle structurele veranderingen in doelmoleculen. Dit artikel beschrijft gedetailleerde methoden voor de constructie en werking van een MT-opstelling met hoge resolutie die nanoschaal, millisecondedynamiek van biomoleculen en hun complexen kan oplossen. Als toepassingsvoorbeelden worden experimenten met DNA-haarspelden en SNARE-complexen (membraanfusiemachines) gedemonstreerd, waarbij de nadruk ligt op hoe hun voorbijgaande toestanden en overgangen kunnen worden gedetecteerd in de aanwezigheid van piconewton-schaalkrachten. We verwachten dat snelle MT's zeer nauwkeurige nanomechanische metingen mogelijk zullen blijven maken op moleculen die krachten in cellen waarnemen, overbrengen en genereren, en daardoor ons begrip van mechanobiologie op moleculair niveau verdiepen.

Krachtkalibratie De resultaten van de twee krachtmeetmethoden (laterale verplaatsingsvariantie van kralen en vermogensspectrumanalyse) verschilden met 0-2 pN (figuur 2G). Volgens de resultaten in figuur 2F kunnen we betrouwbaar tot 30 pN bereiken met gewone neodymiummagneten.
Twee-toestandsovergangen van een 8 bp DNA-haarspeld We onderzochten eerst de nanomechanica van een korte DNA-haarspeld (<...

Hier beschrijven we een snelle magnetische pincetopstelling die nanomechanische metingen uitvoert op krachtgevoelige biomoleculen met de maximale snelheid van 1,2 kHz. We introduceren de toepassing ervan op DNA-haarspelden en SNARE-complexen als modelsystemen, maar het zal ook van toepassing zijn op andere moleculen die betrokken zijn bij mechanobiologische gebeurtenissen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

Biomoleculen ondergaan kleine en snelle structurele veranderingen, vaak als reactie op geweld. Hoge resolutie magnetische pincetten kunnen deze dynamiek onderzoeken onder fysiologisch relevante krachten. Omdat de methode metingen op nanoschaal doet met milliseconde precisie, is het mogelijk om subtiele veranderingen in nucleïnezuren en eiwitten in realtime te volgen.Storingen in eerste dragende en mechanosensitieve eiwitten kunnen mogelijk leiden tot cardiovasculaire en musculoskeletale aandoeningen. Een magnetisch pincet kan inzicht geven in de werkingsmechanismen van deze eiwitten. De set moet goed worden uitgelijnd en gekalibreerd om goede resoluties te verkrijgen.Ook moet voorzichtigheid worden betracht tijdens de voorbereiding en identificatie van moleculaire constructies voor metingen. Begin met het opzetten van een omgekeerde microscoop op een optische antitrillingstafel. Installeer vervolgens een snelle CMOS-camera en een framegrijper.Monteer verticaal een gemotoriseerde lineaire trap met een veerweglengte van meer dan 20 millimeter op een handmatige XY-trap om een vertaaltrap voor magneetmanipulatie in 3D te bouwen. Installeer vervolgens een roterende stappenmotor en een r

high-speed-magnetic-tweezers-for-nanomechanical-measurements-on-force

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In dit artikel beschrijven we het gebruik van magnetische pincet om het effect van geweld op enzymatische proteolyse studeren aan de enkel molecuul niveau in een zeer parallelizable manier.

Multiplexed Single-molecule force Proteolyse metingen met behulp van magnetisch pincet

Wij meten de spanning release in een axon die gedeeltelijk was gelaedeerde met een laser dissector door gelijktijdige krachtspectroscopie meting uitgevoerd op een optisch gevangen probe gehecht aan het membraan van de axon. De ontwikkelde experimentele protocol evalueert de axon hechting aan de cultuur substraat.

Meting van spanningspennen Tijdens Laser Induced Axon Letsel aan Axonale Hechting Evalueer aan de ondergrond bij piconewton en Milliseconde Resolutie

Magnetische pincet, een krachtige single-molecule manipulatie techniek kan worden aangepast voor de directe metingen van de twist (met een configuratie genoemd vrij-baan magnetische pincet) en koppel (met een configuratie genoemd magnetisch koppelpincet) in biologische macromoleculen. Richtlijnen voor het uitvoeren van dergelijke metingen worden gegeven, met inbegrip van toepassingen aan de studie van DNA en bijbehorende nucleo-eiwit filamenten.

Magnetische pincet voor het meten van Twist en Torque

Een single-molecuul magnetische pincet platform te manipuleren van de G-quadruplexes is gemeld, waardoor voor de studie van G4 stabiliteit en verordening door verschillende eiwitten.

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Magnetische krachtmicroscopie (MFM) maakt gebruik van een verticaal gemagnetiseerde atomaire krachtmicroscopiesonde om monstertopografie en lokale magnetische veldsterkte met nanoschaalresolutie te meten. Het optimaliseren van de ruimtelijke resolutie en gevoeligheid van MFM vereist het balanceren van de afnemende hefhoogte tegen toenemende amplitude van de aandrijving (oscillatie) en profiteert van het werken in een dashboardkastje met inerte atmosfeer.

Magnetische krachtmicroscopieresolutie en -gevoeligheid optimaliseren om magnetische domeinen op nanoschaal te visualiseren

Dit protocol demonstreert het gebruik van een magnetisch pincet met één molecuul om interacties te bestuderen tussen telomere DNA-bindende eiwitten (Telomere Repeat-binding Factor 1 [TRF1] en TRF2) en lange telomeren die uit menselijke cellen worden geëxtraheerd. Het beschrijft de voorbereidende stappen voor telomeren en telomere repeat-bindingsfactoren, de uitvoering van experimenten met één molecuul en de methoden voor gegevensverzameling en -analyse.

Analyse van telomere eiwit-DNA-interacties met behulp van een magnetisch pincet met één molecuul

Conformationele flexibiliteit speelt een cruciale rol in de eiwit-functie. Hierin beschrijven we het gebruik van tijdsopgeloste electrospray ionisatie massaspectrometrie gekoppeld met waterstof deuterium ruil voor het sonderen van de snelle structurele veranderingen die functie rijden besteld en ontvouwen eiwitten.

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Hier beschrijven we een eenvoudig protocol voor het snel produceren van honderden nematode groei media agar, 96-Wells cultuur platen met een consistent aantal Caenorhhabditis elegans per putje. Deze culturen zijn nuttig voor de fenotypische screening van hele organismen. Hier richten we ons op met behulp van deze culturen op scherm chemicaliën voor Pro-levensduur effecten.

Een eenvoudige methode voor High Throughput chemische Screening in Caenorhabditis Elegans

Hier presenteren we een protocol van geheel-cel elektrochemische experimenten te bestuderen van de bijdrage van proton vervoer aan het tarief van extracellulaire elektronentransport via de buitenmembraan cytochromes complex in Shewanella oneidensis heer-1.

Elektrochemische detectie van Deuterium kinetisch-isotoopeffect op extracellulaire elektronentransport in Shewanella oneidensis heer-1

Leer nanomechanische metingen met een hoogfrequente magnetische pincet aan krachtgevoelige biomoleculen zoals DNA-hairpins en SNARE-complexen. Deze methode biedt inzicht in mechanobiologische processen.

High-speed magnetisch pincet voor nanomechanische metingen aan krachtgevoelige elementen

Meer video's verkennen