Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren

Virale infecties zijn zeer dynamisch en traditionele eindpunttests in de virologie hebben een beperking dat een gekozen eindpunt kan leiden tot gemiste informatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het met celgebaseerde elektrische impedantie mogelijk is om een virale infectie en de activiteit van antivirale verbindingen in realtime te volgen. Eef Meyen, een laborant van ons laboratorium, demonstreert deze procedure.

Om te beginnen bereidt u de CEI-plaat voor door een interdigitated elektrode-gebaseerde 96-putplaat te nemen. Voeg 100 microliter groeicultuurmedium toe aan elke put en vul de ruimtes tussen de putten met DPBS. Incubeer vervolgens de plaat bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende vier uur.

Om de A549-cellen te zaaien, maakt u ze los van de kweekkolf zoals beschreven in het manuscript en resuspensie ze in vers groeimedium. Breng de celsuspensie over in een buis van 50 milliliter. Tel de levensvatbare cellen en verdun ze in vers groeimedium om de gewenste celdichtheid te verkrijgen.

Verwijder na incubatie het groeikweekmedium met een meerkanaalspipet uit de 96-putplaat. Doseer 100 microliter celsuspensie per put. Zodra de cellen in evenwicht zijn, plaatst u de plaat in het CEI-apparaat om de CEI-test in te stellen en uit te voeren.

Open de software van het apparaat en klik in het deelvenster Gegevens verzamelen op Instellen om een nieuw experiment in te stellen. Sluit een laptop aan op het ECIS-apparaat. Configureer de plaat door de impedanties van de putten te controleren zoals aangegeven door een groene kleur.

Selecteer in het deelvenster Putconfiguratie het arraytype op basis van de gebruikte cultureware en klik op Tijdmodus meerdere frequenties. Start vervolgens de meting door op Start te drukken. Houd de compound op ijs.

Maak de 10-maal geconcentreerde verdunning met een uitgebalanceerd testmedium in een polypropyleenbuis van vijf milliliter en voeg vervolgens de verbinding toe. Klik in het deelvenster Instellingen voor gegevensverzameling op Onderbreken en haal na het voltooien van het huidige tijdstip de 96-putplaat eruit. Observeer de hechting en monolaagvorming van de cellen onder een lichtmicroscoop.

Zuig vervolgens 20 microliter medium uit elke put met behulp van een meerkanaalspipet en voeg 20 microliter samengestelde oplossing of voertuig toe in de gewenste putten. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 15 minuten. Om de virusoplossing te bereiden, ontdooit u een injectieflacon met virusvoorraad.

Na het maken van verdunningen op de gewenste MOI met testmedium in een polypropyleenbuis van 15 milliliter, voegt u virusvoorraad toe. Zodra virusverdunning is toegevoegd in de toegewezen putten, voegt u 100 microliter testmedium toe aan de celcontroleputten. Ontsmet vervolgens de gebruikte viruscontainers.

Plaats de plaat terug in het CEI-apparaat en klik op Hervatten om de metingen gedurende zes opeenvolgende dagen voort te zetten. Als u de gegevens wilt analyseren, klikt u op Voltooien om het experiment te beëindigen en Experimentoverzicht invoeren toe te voegen. Zodra het verzamelen van gegevens is voltooid, selecteert u OK. Selecteer de gewenste frequentie in het deelvenster Grafiek.

Zorg ervoor dat alle putten zijn geselecteerd in het deelvenster Putconfiguratie en klik op Bestand, vervolgens op Gegevens exporteren, gevolgd door Grafiekgegevens om de gegevens in een spreadsheetindeling te exporteren. De CEI-test toonde aan dat de infectiekinetiek sterk afhankelijk was van het celtype en dat U87-cellen alleen vatbaar waren voor Zika-virusinfectie bij hoge MOI's. De CEI-testen toonden ook een volgroeide celmonolaag bij hoge celzaaiing en kunnen zich niet verder verspreiden over de CEI-elektroden, wat leidt tot een klein verschil tussen de celcontrole en viruscontrole.

Voor U87, een groter celtype, kan het te dicht zaaien van cellen hebben geleid tot de volledige loslating van de celmonolaag. Een representatieve Zika-virusstam van de Afrikaanse MR766 in de Aziatische afstamming PRVABC59 vertoonde vergelijkbare CEI-patronen. PRVABC59 heeft echter iets langzamere cytopathische-effect-inducerende eigenschappen, ook weerspiegeld door de CIT50-waarden.

De impedantieprofielen van drie verschillende MOI's van beide Zika-virusstammen toonden aan dat de specifieke concentratie van de verbinding de impedantiedaling vertraagde die werd veroorzaakt door een Zika-virusinfectie. De CEI-test toonde aan dat de antivirale activiteit afhankelijk was van de MOI en AUCN-berekeningen bepaalden IC50-waarden. De geëvalueerde CIT50-waarden toonden samengestelde potenties in de kinetiek van celgroei en infectie.

CEI is een krachtige technologie om verbindingen tegen Zika-virusreplicatie op een realtime, labelvrije en niet-invasieve manier te evalueren en te karakteriseren.