Isolatie, cultuur en karakterisering van primaire dermale fibroblasten uit menselijk keloïde weefsel
28 juli 2023
Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het vaststellen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels die effectief en gestaag zuivere en levensvatbare fibroblasten kunnen leveren.
De isolatie en kweek van primaire fibroblasten afgeleid van keloïde weefsel vormen de basis voor verdere studies van keloïden. Fibroblasten uit keloïde weefsel kunnen gemakkelijk worden verkregen via dit protocol, dat een overvloedige en stabiele bron van cellen in het laboratorium kan bieden voor keloïde onderzoek. Begin met het gebruik van een steriel pincet om het keloïde weefsel in een steriele centrifugebuis van 50 milliliter te plaatsen met 10 tot 25 milliliter PBS aangevuld met 1% PSA.
Voeg ondertussen vier milliliter PBS PSA-oplossing toe aan elke put van een plaat met zes putten. Haal nu het weefsel uit de buis en was twee keer met PBS PSA-oplossing. Breng met behulp van een steriele tang het weefsel sequentieel over van de ene put naar de volgende.
Verwijder vervolgens de vet- en epidermislagen met een chirurgische schaar en laat de dermis onaangeroerd. Gebruik een schaar om de bijgesneden dermis in stukken van drie tot vijf vierkante millimeter te ontleden en breng de stukken over naar de volgende put met een steriele tang. Was de stukken in PBS PSA-oplossing.
Plaats met behulp van een gesteriliseerde tang 10 tot 30 stukjes dermisweefsel op minder dan vijf millimeter afstand van elkaar in petrischalen. Leg de gerechten ondersteboven in een couveuse tot de stukjes droog zijn en aan de schaal blijven plakken. Voeg vervolgens zeven milliliter DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSA toe en incuber de gerechten zoals voorheen.
Vervang na drie dagen de helft van het supernatant door een compleet kweekmedium. Observeer de fibroblasten dagelijks onder 40x microscopische vergroting. Verwijder de weefselstukken in het kweekmedium wanneer de fibroblasten 90% samenvloeiing bereiken.
Was de fibroblasten in PBS en voeg twee milliliter steriele trypsine EDTA-oplossing toe. Nadat u de cellen in een bevochtigde incubator hebt geïncubeerd, tikt u voorzichtig op de kweekschaal en observeert u deze onder de microscoop. Voeg twee milliliter volledig medium toe om de spijsvertering te beëindigen zodra de meeste cellen zijn losgemaakt.
Breng nu de celsuspensie over naar een steriele centrifugebuis van 15 milliliter en centrifugeer de buis gedurende drie minuten bij kamertemperatuur op 300 G. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspensie van de celkorrel in volledig medium. Zaai de fibroblasten in een celkweekschaal van negen centimeter en incubeer in een bevochtigde incubator.
Om immunofluorescente analyse uit te voeren na het kweken van de fibroblasten op ronde coverslips en ze te incuberen in primaire en secundaire antilichamen, voegt u 50 microliter DAPI-oplossing toe aan de glasplaat om de celkernen te kleuren. Plaats de gewassen coverslips op glazen platen met behulp van een tang. Breng ten slotte de monsters over naar een natte donkere doos voor fluorescerende microscopie.
Fibroblastuitwassen van het weefsel werden waargenomen vijf dagen na verwerking. De fibroblasten vertoonden hoge proliferatiesnelheden en bereikten confluentie na 10 dagen. De fibroblasten hadden langwerpige en spindelachtige cellichamen, die in bundels bij hoge samenvloeiing waren uitgelijnd.
Immunofluorescente kleuring retourneerde positieve rode immunofluorescentie van de fibroblasten en blauwe immunofluorescentie van de cellulaire kern. Flowcytometrische assays toonden CD90-positiviteit in bijna alle fibroblasten. Deze studie heeft een geoptimaliseerde methode beschreven en duidelijke instructies gegeven om bestaande uitdagingen op te lossen en de kans op succes voor de isolatie en cultuur van keloïde fibroblasten te vergroten.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het verkrijgen van primaire fibroblasten uit keloïdweefsels, waarmee effectief en consistent pure en levensvatbare fibroblasten kunnen worden geleverd. De isolatie en kweek van deze fibroblasten zijn essentieel voor het bevorderen van onderzoek naar keloïden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Celkweek
- Isolatie van fibroblasten
- Keloidonderzoek
Achtergrond
- Keloïden zijn abnormale littekens die moeilijk te bestuderen kunnen zijn.
- Primaire fibroblasten zijn essentieel voor het begrijpen van de biologie van keloïden.
- Bestaande protocollen bieden mogelijk onvoldoende celviabiliteit.
- Deze studie heeft tot doel het isolatieproces te verbeteren.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode vast te stellen voor het isoleren van fibroblasten uit keloïdwegen.
- Om een stabiele bron van fibroblasten te bieden voor laboratoriumonderzoek.
- Om het begrip van keloïdvorming en de behandeling ervan te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Gebruik van steriele pincetten en centrifugebuizen voor de behandeling van weefsel.
- Wassen van keloïdweefsel met PBS aangevuld met 1% PSA.
- Sequentiële overdracht van weefsel tussen wells in een six-well plate.
- Vaststellen van kweekcondities voor fibroblastgroei.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van levensvatbare fibroblasten uit keloïdweefsels.
- Het protocol biedt een overvloedige bron van cellen voor onderzoek.
- Fibroblasten behielden hun stabiliteit en levensvatbaarheid over een langere periode.
- Vergemakkelijkte verdere studies naar de biologie van keloïden.
Conclusies
- Het geoptimaliseerde protocol is effectief voor de isolatie van fibroblasten.
- Biedt een basis voor toekomstig onderzoek naar keloïden.
- Vergroot het potentieel voor therapeutische vooruitgang in de behandeling van keloïden.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Betrouwbare isolatie en kweek van primaire dermale fibroblasten uit keloidweefsel vervullen een kritische behoefte aan ziekterelevante cellulaire modellen in de vroege fase van geneesmiddelenontwikkeling. Dit protocol maakt consistente toegang mogelijk tot pure, gevalideerde fibroblastpopulaties, wat mechanistische studies en targetvalidatie voor fibrotische huidaandoeningen ondersteunt. Deze aanpak verbetert het voorspellende vertrouwen en de translationele continuïteit voor het testen van therapeutische hypothesen in keloidonderzoeksportefeuilles.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek mogelijk naar fibroblast-gestuurde pathways die betrokken zijn bij de pathogenese van keloïden.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het leveren van functioneel gevalideerde primaire cellen.
- Faciliteert mechanistische studies om de relevantie van targets bij fibrotische ziekten te verduidelijken.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor beslissingen bij vroege portfolio-triage.
Screening & assayontwikkeling
- Biedt een reproduceerbare bron van primaire fibroblasten voor de standaardisatie van assays.
- Maakt de ontwikkeling van kwantitatieve, celgebaseerde assays mogelijk voor de evaluatie van verbindingen.
- Ondersteunt de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in screeningworkflows.
- Vermindert variabiliteit door contaminatie en de vermenging met niet-fibroblastcellen te minimaliseren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt in vitro-modellen uit met ziekterelevante menselijke celtypen voor translationele studies.
- Maakt continuïteit mogelijk van ontdekking tot preklinische validatie in keloidonderzoek.
- Ondersteunt de risico-gecorrigeerde voortgang van anti-fibrotische kandidaten.
- Biedt een platform voor de ontdekking en validatie van biomarkers wanneer dit wordt ondersteund door downstream-studies.
Integratie van Pipeline en Workflow
Dit protocol plaatst de isolatie van primaire keloïde fibroblasten op het snijvlak van vroege ontdekking en preklinisch onderzoek, waardoor robuuste targetvalidatie en assayontwikkeling voor pijplijnen voor fibrotische huidaandoeningen mogelijk worden gemaakt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en het verduidelijken van signaalpaden in de pathogenese van keloïden.
- Screening: Levert gevalideerde, reproduceerbare cellsystemen voor de ontwikkeling van kwantitatieve assays.
- Analytics: Maakt karakterisering via immunofluorescentie en flowcytometrie mogelijk voor de bevestiging van de celidentiteit.
- Translational Research: Biedt ziekterellevante cellulaire modellen voor preklinische evaluatie van kandidaat-therapeutica.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd protocol dat aanpasbaar is voor verschillende onderzoeksteams en projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt de voorspellende betrouwbaarheid en vermindert mechanistische ambiguïteit in keloïdonderzoek.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van workflows met primaire cellen.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie in programma's in een vroeg stadium.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van antifibrotische activa mogelijk.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in steriele weefselverwerking en technieken voor primaire celkweek.
- Vereist toegang tot celkweekfaciliteiten, immunofluorescentie en flowcytometrie-instrumentatie.
- Vraagt om standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare celisolatie en karakterisering.
- Kan aanpassing vereisen voor andere fibrotische of dermale weefselbronnen.
- Potentiële beperkingen omvatten donorvariabiliteit en de beschikbaarheid van weefsel.
