Name: Een efficiënt protocol voor CUT and RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Leer een efficiënt CUT&RUN-protocol voor FACS-geïsoleerde muissatellietcellen. Deze methode onderzoekt transcriptieregulatie en androgeenreceptorfunctie in skeletspierstamcellen in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Anastasia Bannwarth voor haar uitstekende technische assistentie. We danken de IGBMC-dierenstalfaciliteit, de celkweek, het Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrijk), de beeldvorming, de elektronenmicroscopie, de flowcytometrie en het GenomEast-platform, lid van het consortium 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).
Dit werk van het Interdisciplinair Thematisch Instituut IMCBio, als onderdeel van het ITI 2021-2028-programma van de Universiteit van Straatsburg, CNRS en Inserm, werd ondersteund door IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) en door het SFRI-STRAT'US-project (ANR 20-SFRI-0012) en EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) in het kader van het Franse Investments for the Future-programma. Aanvullende financiering werd verstrekt door INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisch programma 24376 (aan D.D.), INSERM young researcher grant (aan D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, en een Frans staatsfonds beheerd door de ANR in het kader van het kaderprogramma Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. werd gesteund door het programma CDFA-07-22 van de Université franco-allemande en Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, en K.G. door de Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Isolatie van satellietcellen uit de spieren van muizenledematen en flowcytometrieanalyse

<ol><li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle%3A+a+brief+review+of+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Calcified+Tissue+International%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle: a brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Buckingham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+progenitor+cells+and+the+role+of+Pax+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes.</a> Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).</li>
<li>Tosic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lsd1+regulates+skeletal+muscle+regeneration+and+directs+the+fate+of+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 366(2018).</li>
<li>Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche+regulation+of+muscle+satellite+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation.</a> Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).</li>
<li>Collins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Robinson, D. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+elongation+factor+regulates+muscle+progenitor+expansion+for+efficient+myofiber+repair+and+stem+cell+pool+repopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation.</a> Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Hainer, S. J., Fazzio, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+chromatin+profiling+using+CUT%26RUN%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).</li>
<li>Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+CUT%26RUN+chromatin+profiling+tools%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Improved CUT&RUN chromatin profiling tools.</a> eLife. 8, (2019).</li>
<li>Gunther, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myf5-positive+satellite+cells+contribute+to+Pax7-dependent+long-term+maintenance+of+adult+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells.</a> Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).</li>
<li>Donlin, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+high-dimensional+analysis+of+cells+dissociated+from+cryopreserved+synovial+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue.</a> Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).</li>
<li>Rico, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+cell+doublet+profiles%3A+Comparison+of+light+scattering+with+fluorescence+measurement+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques.</a> Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).</li>
<li>Schreiber, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+NEUROG3+occupancy+in+the+human+pancreatic+endocrine+gene+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network.</a> Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).</li>
<li>Rovito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myod1+and+GR+coordinate+myofiber-specific+transcriptional+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers.</a> Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peak+calling+by+Sparse+Enrichment+Analysis+for+CUT%26RUN+chromatin+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling.</a> Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).</li>
<li>Ramirez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools2%3A+a+next+generation+web+server+for+deep-sequencing+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis.</a> Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).</li>
<li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer+%28IGV%29%3A+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Atlas+2021+update%3A+a+data-mining+suite+for+exploring+epigenomic+landscapes+by+fully+integrating+ChIP-seq%2C+ATAC-seq+and+Bisulfite-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data.</a> Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Brandhorst, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+human+islet+isolation+utilizing+recombinant+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase.</a> Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).</li>
<li>Nikolic, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+collagenase+XI+and+liberase+H1+for+the+isolation+of+human+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatogastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets.</a> Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C2C12+myoblastoma+cell+differentiation+and+proliferation+is+stimulated+by+androgens+and+associated+with+a+modulation+of+myostatin+and+Pax7+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).</li>
<li>Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+modulation+of+the+nuclear+receptor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).</li>
<li>Billas, I., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+controls+of+nuclear+receptor+function+in+the+regulation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription.</a> Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).</li>
<li>Garcia-Prat, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxO+maintains+a+genuine+muscle+stem-cell+quiescent+state+until+geriatric+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age.</a> Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).</li>
<li>Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Established+cell+surface+markers+efficiently+isolate+highly+overlapping+populations+of+skeletal+muscle+satellite+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Skeletal Muscle. 6, 35(2016).</li>
<li>Schultz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+study+of+the+satellite+cell+population+in+postnatal+mouse+lumbrical+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle.</a> The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).</li>
<li>Hyder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+pancreatic+digestion+with+liberase+versus+collagenase+on+the+yield%2C+function+and+viability+of+neonatal+rat+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets.</a> Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).</li>
<li>Liang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+skeletal+muscle+for+flow+cytometric+characterization+of+immune+cells+in+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).</li>
<li>Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+tissue+residency+of+lymphocytes+in+the+murine+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).</li>
<li>Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+tissue+enzymatic+digestion+on+analysis+of+immune+cells+in+mouse+reproductive+mucosa+with+a+focus+on+gammadelta+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

De huidige studie rapporteert een gestandaardiseerde, betrouwbare en eenvoudig uit te voeren methode voor de isolatie en kweek van muissatellietcellen, evenals de beoordeling van transcriptionele regulatie door de CUT&RUN-methode.
Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste is spierverstoring en vezelvertering om een groot aantal verzamelde cellen te garanderen. Ondanks de verhoogde enzymconcentratie werden er meer levende cellen verkregen dan bij gebruik van Protocol 1. Satel...

Dwarsgestreepte skeletspieren vertegenwoordigen gemiddeld 40% van het gewicht van het totale menselijk lichaam1. Spiervezels vertonen een opmerkelijk vermogen tot regeneratie bij letsel, wat wordt beschreven door de fusie van nieuw gevormde myocyten en de aanmaak van nieuwe myovezels die de beschadigde vervangen2. In 1961 rapporteerde Alexander Mauro een populatie van mononucleaire cellen die hij satellietcellen3 noemde. Deze stamcellen brengen de transcriptiefactor gepaarde box 7 (PAX7) tot expressie en bevinden zich tussen de basale lamina en het sarcolemma van spiervezels4. Er werd gemeld dat ze het cluster van differentiatie 34 (CD34; een hematopoëtische, endotheliale voorloper en mesenchymale stamcelmarker), integrine alfa 7 (ITGA7; een gladde, hart- en skeletspiermarker) tot expressie brachten, evenals de C-X-C chemokinereceptor type 4 (CXCR4; een lymfocyt-, hematopoëtische en satellietcelmarker)5. In basale omstandigheden bevinden satellietcellen zich in een bepaalde micro-omgeving die ze in een rusttoestand houdt6. Bij spierbeschadiging worden ze geactiveerd, vermenigvuldigen ze zich en ondergaan ze myogenese7. Omdat ze echter slechts een klein deel van het totale aantal spiercellen uitmaken, zijn hun genoombrede analyses bijzonder uitdagend, vooral onder fysiologische omstandigheden (<1% van het totale aantal cellen).
Er zijn verschillende methoden beschreven voor chromatine-isolatie uit satellietcellen, waarbij chromatine-immunoprecipitatie wordt gevolgd door massale parallelle sequencing (ChIP-seq) of splitsing onder doelen en tagmentatie-experimenten (CUT&Tag). Desalniettemin hebben deze twee technieken enkele belangrijke beperkingen die onbetwist blijven. ChIP-seq vereist inderdaad een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal om voldoende chromatine te genereren, waarvan een groot deel verloren gaat tijdens de sonicatiestap. CUT&Tag is meer geschikt voor een laag celaantal, maar genereert meer off-target splitsingsplaatsen dan ChIP-seq vanwege de Tn5-transposase-activiteit. Bovendien, aangezien dit enzym een hoge affiniteit heeft voor open-chromatineregio's, kan de CUT&Tag-benadering bij voorkeur worden gebruikt voor het analyseren van histonmodificaties of transcriptiefactoren die verband houden met actief getranscribeerde regio's van het genoom, in plaats van tot zwijgen gebracht heterochromatine 8,9.
Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen door FACS mogelijk maakt voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN)10,11-analyse. De verschillende stappen omvatten de mechanische verstoring van weefsel, celsortering en kernisolatie. De efficiëntie van de methode, met betrekking tot de bereiding van een levensvatbare celsuspensie, werd aangetoond door het uitvoeren van CUT&RUN-analyse voor covalente histonmodificaties en transcriptiefactoren. De kwaliteit van geïsoleerde cellen maakt de beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine dat de oorspronkelijke genomische bezettingstoestand getrouw vastlegt, en is waarschijnlijk geschikt voor het vastleggen van de chromosoomconformatie in combinatie met high-throughput sequencing op specifieke loci (4C-seq) of op genoombrede niveaus (Hi-C).

<table><tbody><tr><td>1.5 mL microtube</td><td>Eppendorf</td><td>2080422</td><td></td></tr><tr><td>2 mL microtube</td><td>Star Lab</td><td>S1620-2700</td><td></td></tr><tr><td>5 mL tubes</td><td>CORNING-FALCON</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubes</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>anti-AR</td><td>abcam</td><td>ab108341</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD11b</td><td>eBioscience</td><td>25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>12-0311-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34</td><td>eBioscience</td><td>48-0341-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45</td><td>eBioscience</td><td>12-0451-83</td><td></td></tr><tr><td>anti-CXCR4</td><td>eBioscience</td><td>17-9991-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-DMD</td><td>abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K27ac</td><td>Active Motif</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>anti-H3K4me2</td><td>Active Motif</td><td>39141</td><td></td></tr><tr><td>anti-ITGA7</td><td>MBL</td><td>k0046-4</td><td></td></tr><tr><td>anti-PAX7</td><td>DSHB</td><td>AB_528428</td><td></td></tr><tr><td>anti-TER119</td><td>BD Pharmingen TM</td><td>553673</td><td></td></tr><tr><td>Beads</td><td>Polysciences</td><td>86057-3</td><td>BioMag&reg;Plus Concanavalin A</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100 &micro;m</td><td>Corning&reg;&nbsp;</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &micro;m</td><td>Corning&reg;&nbsp;</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &micro;m</td><td>Corning&reg;&nbsp;</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 1</td><td>Eppendorf</td><td>521-0011</td><td>Centrifuge 5415 R</td></tr><tr><td>Centrifuge 2</td><td>Eppendorf</td><td>5805000010</td><td>Centrifuge 5804 R</td></tr><tr><td>Chamber Slide System&nbsp;</td><td>ThermoFischer</td><td>171080</td><td>Syst&egrave;me Nunc&trade; Lab-Tek&trade; Chamber Slide</td></tr><tr><td>Cleaning agent</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>SLBQ7780V</td><td>RNaseZAPTM</td></tr><tr><td>Collagenase, type I&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17100017</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>STEMCELL technologies</td><td>7913</td><td>5 U/mL</td></tr><tr><td>DynaMag&trade;-2 Aimant</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Fixable Viability Stain</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD FACSAria&trade; Fusion Flow Cytometer</td><td>23-14816-01</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G with DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>Genome browser&nbsp;</td><td>IGV</td><td></td><td>http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td></tr><tr><td>Glycerol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>Corning&reg;&nbsp;</td><td>354277</td><td>Matrigel hESC qualified matrix</td></tr><tr><td>Image processing software</td><td>Image J&reg;</td><td></td><td>V 1.8.0</td></tr><tr><td>Laboratory film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793-1EA</td><td>PARAFILM&reg; M</td></tr><tr><td>Liberase LT</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Propyl gallate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2370</td><td></td></tr><tr><td>Sequencer&nbsp;</td><td>Illumina Hiseq 4000</td><td>SY-401-4001</td><td></td></tr><tr><td>Shaking water bath</td><td>Bioblock Scientific polytest 20</td><td>18724</td><td></td></tr></tbody></table>

een efficiënt protocol voor cut&amp;run-analyse van facs-geïsoleerde muissatellietcellen

An Efficient Protocol for CUT&amp;RUN Analysis of FACS-Isolated Mouse Satellite Cells

Genoomwijde analyses met kleincellige populaties zijn een belangrijke beperking voor studies, met name op het gebied van stamcellen. Dit werk beschrijft een efficiënt protocol voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van satellietcellen uit de ledemaatspier, een weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. Ontlede ledemaatspieren van volwassen muizen werden mechanisch verstoord door fijnhakken in medium aangevuld met dispase en type I collagenase. Na de spijsvertering werd het homogenaat gefilterd door celzeven en werden de cellen gesuspendeerd in de FACS-buffer. De levensvatbaarheid werd bepaald met een fixeerbare levensvatbaarheidskleuring en immunogekleurde satellietcellen werden geïsoleerd door FACS. Cellen werden gelyseerd met Triton X-100 en vrijgekomen kernen werden gebonden aan concanavalin A magnetische kralen. Kern/kraalcomplexen werden geïncubeerd met antilichamen tegen de transcriptiefactor of histonmodificaties van belang. Na wasbeurten werden kern/kraalcomplexen geïncubeerd met proteïne A-microkokkennuclease en werd chromatinesplitsing geïnitieerd met CaCl2. Na DNA-extractie werden bibliotheken gegenereerd en gesequenced, en de profielen voor genoombrede transcriptiefactorbinding en covalente histonmodificaties werden verkregen door bio-informatica-analyse. De pieken die voor de verschillende histonmarkeringen werden verkregen, toonden aan dat de bindingsgebeurtenissen specifiek waren voor satellietcellen. Bovendien onthulde bekende motiefanalyse dat de transcriptiefactor gebonden was aan chromatine via het verwante responselement. Dit protocol is daarom aangepast om genregulatie te bestuderen in spiercellen van volwassen muizen.

Satellietcellen uit skeletspieren van muizen werden geïsoleerd door de protocollen van Gunther et al. (hierna Protocol 1)12 en van Liu et al.23 (hierna Protocol 2) te combineren. Aangezien na de spijsvertering niet-verteerde spiervezels werden waargenomen bij gebruik van de concentratie collagenase en dispase zoals voorgesteld in Protocol 1, werd de hoeveelheid enzymen verhoogd om de dissociatie van spiervezels te verbeteren, zoals beschreven in de stappen 1.2.1 en 1.2.3. Z...

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN).

Een efficiënt protocol voor CUT&amp;RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Genome-wide analyses with small cell populations are a major constraint for studies, particularly in the stem cell field. This work describes an efficient ...

Al meer dan 20 jaar is ons labo geïnteresseerd in de pathofysiologische rol van nucleaire receptoren. Om hun in vivo functie te ontcijferen, hebben we een muismodel ontwikkeld dat de ruimtelijke en temporele controle van hun expressie mogelijk maakt. Tegelijkertijd ontwikkelden we geavanceerde technieken om hun moleculaire functie in de muizenweefsels te onderzoeken.Onze wetenschappelijke interesse heeft ons er onlangs toe gebracht om de signalering van secosteroïden en steroïdereceptoren in verschillende weefsels, waaronder skeletspieren, te bepalen. We hebben onlangs aangetoond dat de androgeenreceptor in myovezels die cellen van de skeletspier differentiëren, een belangrijke rol speelt bij hun contractiele en metabolische functies. Onze recente bevindingen leveren een dieper begrip op van de pathofysiologische dynamiek van skeletspieren, wat cruciaal is voor het ontwikkelen van effectieve behandelingen voor spiergerelateerde aandoeningen.We hebben dit protocol ontwikkeld om in vivo een cistrome-analyse uit te kunnen voeren op spierstamcellen. Alle eerdere protocollen gebruikten in-vitromodaliteiten, wat het onderzoek volledig loskoppelt van de context van een heel organisme. Dit protocol is niet alleen goedkoop en tijdbesparend, maar biedt ook een effectieve experimentele setting om transcriptiefactorrekrutering en chromatinelandschap in voorlopercellen van skeletspieren te bestuderen.Chromatine bereid door dit protocol heeft de eerste genoombrede analyse van AR cistrome in satellietcellen opgeleverd en zal toekomstige studies naar genregulatie vergemakkelijken. Ons toekomstige doel zou zijn om dit onderzoek uit te breiden naar andere oxosteroïdereceptoren en hun specifieke co-regulatoren te onderzoeken in de verschillende celtypen die betrokken zijn bij het regeneratieproces in skeletspieren.

an-efficient-protocol-for-cut-run-analysis-facs-isolated-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.

Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Fibroblastgedrag ligt ten grondslag aan een spectrum van klinische entiteiten, maar ze blijven slecht gekarakteriseerd, grotendeels vanwege hun inherente heterogeniteit. Traditioneel fibroblastenonderzoek is afhankelijk van in vitro manipulatie, waardoor in vivo fibroblastgedrag wordt gemaskeerd. We beschrijven een FACS-gebaseerd protocol voor de isolatie van muishuidfisbroblasten dat geen celcultuur vereist.

Muizen Dermaal Fibroblast Isolation door FACS

Muismodellen maken het mogelijk om belangrijke mechanismen van aritmogenese te bestuderen. Voor dit doel zijn cardiomyocyten van hoge kwaliteit nodig om patchklemmetingen uit te voeren. Hier wordt een methode beschreven om murine atriale en ventriculaire myocyten te isoleren via retrograde enzymgebaseerde Langendorff-perfusie, die gelijktijdige metingen van calciumtransiënten en L-type calciumstroom mogelijk maakt.

Isolatie van hoogwaardige murine atriale en ventriculaire myocyten voor gelijktijdige metingen van Ca2+ transiënten en L-type calciumstroom

De hier gepresenteerde methode vat geoptimaliseerde protocollen samen voor het beoordelen van cellulaire bio-energetica in niet-adherente muishematopoietische stam en primitieve voorlopercellen (HSPC's) met behulp van de extracellulaire fluxanalysator om de extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) en zuurstofverbruikssnelheid (OCR) van HSPC's in realtime te meten.

Beoordeling van cellulaire bio-energetica in hematopoietische stamcellen van muizen en primitieve voorlopercellen met behulp van de extracellulaire fluxanalysator

CUT&amp;RUN en zijn varianten kunnen worden gebruikt om de eiwitbezetting op chromatine te bepalen. Dit protocol beschrijft hoe de eiwitlokalisatie op chromatine kan worden bepaald met behulp van eencellige uliCUT &amp; RUN.

Single-Cell Factor Lokalisatie op Chromatine met behulp van Ultra-Low Input Cleavage Under Targets en Release met Nuclease

De precieze identificatie van fibro-adipogene voorlopercellen (FAPs) en spierstamcellen (MuSC's) is van cruciaal belang voor het bestuderen van hun biologische functie in fysiologische en pathologische omstandigheden. Dit protocol biedt richtlijnen voor de isolatie, zuivering en cultuur van FAPs en MuSC's van volwassen muisspieren.

FACS-isolatie en kweek van fibro-adipogene voorlopers en spierstamcellen van onverstoorbare en gewonde muizenskeletspieren

Onderzoekers die nieuw zijn in het epigenetische veld zullen CUT&amp;Tag een aanzienlijk eenvoudiger alternatief vinden voor ChIP-tests. CUT&amp;Tag heeft enorm geprofiteerd van de epigenetische studies op zeldzame en primaire celpopulaties, door hoogwaardige gegevens te genereren uit zeer weinig cellen. Dit protocol beschrijft het uitvoeren van H3K4me1 CUT&amp;Tag-assays op muizenmyoblasten geïsoleerd uit de achterpotspieren van muizen.

Met behulp van splitsing onder doelen en tagmentatie (CUT&#38;tag) assay in muizenmyoblastonderzoek

Dit protocol beschrijft een extrachromosomale niet-homologe eindverbindingstest (NHEJ) en een homologe recombinatietest (HR) om de efficiëntie van NHEJ en HR in HEK-293T-cellen te kwantificeren.

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen

Om muishersencorticale pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen van scRNA-seq, presenteren we een kritisch geoptimaliseerd FACS-protocol gebaseerd op CD13/CD31⁻-selectie. Onze belangrijke verfijningen verbeteren de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van RNA aanzienlijk, waardoor betrouwbare transcriptomische profilering mogelijk wordt.

Isolatie van pericyten uit muiscorticaal weefsel met FACS voor single-cell sequencing

Dit protocol biedt een gestandaardiseerde methode voor het isoleren en verrijken van primaire myoblasten uit volwassen en neonatale muisskeletspieren via weefseldissociatie, sequentiële filtratie, preplating en gedefinieerde kweekcondities, waardoor de opbouw en het onderhoud van satellietcel-afgeleide myoblastkweken mogelijk is voor latere experimentele toepassingen.

Isolatie van skeletspiersatellietcellen voor in vitro myogenesestudies

Leer een efficiënt CUT&RUN-protocol voor FACS-geïsoleerde muissatellietcellen. Deze methode onderzoekt transcriptieregulatie en androgeenreceptorfunctie in skeletspierstamcellen in vivo.

Een efficiënt protocol voor CUT&RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

Meer video's verkennen