Name: Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Leer de dissectie van de stria vascularis bij volwassen muizen voor single-nucleus sequencing en immunostaining. Deze methode helpt onderzoekers het transcriptielandschap te onderzoeken en gehoorinstabiliteit te begrijpen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd mede ondersteund door het Intramuraal Onderzoeksprogramma van de NIH, NIDCD tot M.H. (DC000088)

Alle dierproeven en procedures werden uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health. Alle methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen en voorschriften van het Animal Care and Use Committee van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke en het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health.
1. Euthanasie bij dieren
<ol><li>Gebruik C57BL/6J of Kcnj10-ZsGreen transgene muizen, postnatale dag 30+ (P30+), die tussen de 15-20 g wegen.</li>
	<li>Euthanaseer een volwassen muis (leeftijd P30 of ouder) met behulp van een goedgekeurd protocol (hier CO 2-verstikking). Voer onthoofding uit als een secundaire stap. OPMERKING: Bij immunostaining kunnen sommige antilichamen een achtergrondsignaal hebben als gevolg van niet-specifieke binding aan bloed in de haarvaten van de SV. Hartperfusie met fixatief kan dit probleem aanpakken door bloed uit de haarvaten van de SV te verwijderen. De meeste antilichamen kunnen echter goede resultaten bereiken zonder deze methode en het zal niet in dit protocol worden behandeld.</li>
</ol>2. Benig labyrint blootleggen
<ol><li>Reinig de muis door te spuiten met 70% ethanol en af te vegen met keukenpapier. Besteed bijzondere aandacht aan het hoofdgebied om het risico op besmetting te verminderen. Verwijder de huid van de schedel door de huid naar de neus te trekken.</li>
	<li>Gebruik een scherpe schaar en splits de schedel langs het midsagittale vlak om het linker- en rechtergedeelte te scheiden.</li>
	<li>Verwijder de hersenen uit de schedel om het benige labyrint bloot te leggen.</li>
</ol>3. Binnenoorextractie
<ol><li>Identificeer het binnenoor in het temporale bot (figuur 2A) en schraap de hersenzenuwen weg met een # 55-tang. OPMERKING: De gebruiker moet het monster stabiliseren met zijn niet-dominante hand met behulp van een tweede set # 55-tangen. Verschillende delen van het specimen kunnen tijdens de dissectie met de stabiliserende tang worden vastgepakt als kritieke delen van het specimen worden vermeden (bijv. het slakkenhuis niet verpletteren).</li>
	<li>Gebruik # 55 tang, ontleed de bulla en capsule en maak ze los van het omliggende bot. Verwijder alle resterende weke delen van het oppervlak van het binnenoor.</li>
	<li>Breng het monster over in een heldere weefselkweekschaal met 1x koude PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing), pH 7,4, en plaats onder een dissectiescoop (figuur 2B).</li>
</ol>4. SV-dissectie
OPMERKING: Met oefening is het mogelijk om de SV te ontleden als één lang stuk dat op een lint lijkt. De SV is fragiel, dus als hij in stukken breekt, kunnen deze samen worden opgeslagen. Als alternatief kunnen deze worden opgeslagen in afzonderlijk gelabelde putten op basis van hun draai (bijv. Basale, middelste, apicale).
<ol><li>Als de lichtbronnen van de dissectiekijker kunnen worden verplaatst, plaatst u één licht boven de schotel en de tweede lichtbron vanaf de zijkant, parallel aan het ontleedoppervlak. Dit zorgt voor een beter contrast van het weefsel onder het cochleaire bot.</li>
	<li>Houd met een tang # 55 het monster bij het vestibulaire gedeelte met het slakkenhuis naar boven gericht.</li>
	<li>Gebruik # 55 tang en prik door het cochleaire bot aan de top. OPMERKING: # 5 tang is dikker dan # 55 en kan worden gebruikt voor het breken van bot, maar de toename in grootte / kracht offert de fijnheid van de tang en het vermogen om kleine weefsels te manipuleren. Overweeg het gebruik van een tang gemaakt met een materiaal zoals inox of dumostar om schade te voorkomen die kan optreden bij een meer delicate tang. Vermijd het duwen van de tang te diep onder het bot om beschadiging van de SV te voorkomen.</li>
	<li>Schraap met een # 55-tang langs de apicale draai (figuur 2C) en oefen zachte kracht uit om kleine stukjes van de buitenste botlaag weg te breken. Til het bot voorzichtig op en maak het los van de zijwand. OPMERKING: Het kan nuttig zijn om over deze dissectie na te denken als "alles weghalen van de SV", in plaats van "de SV uit het slakkenhuis te ontleden".</li>
	<li>Ga door met het gebruik van #55 tang om cochleaire botstukken uit de apicale en middelste bochten te verwijderen (Figuur 2D, E). Duw zachtjes de zijwand naar beneden, wrik en verwijder botwandstukken naar de middelste draai om de zijwand van de apicale en middelste bochten bloot te leggen.</li>
	<li>Ga verder met het gebruik van # 55 tang en duw voorzichtig de apicale draaizijwand opzij om het spiraalvormige ganglion bloot te leggen. Maak de laterale wand van apicale en middelste bochten los van het spiraalvormige ganglion langs de buitenste haarcellaag. Verwijder stukjes spiraalvormig ganglion uit het slakkenhuis. OPMERKING: # 55 tangen zijn kleiner en bieden een voordeel bij het manipuleren van kleine en delicate weefsels. Extra zorg moet worden genomen om te voorkomen dat ze buigen of beschadigen.</li>
	<li>Om betere toegang te hebben tot de laterale wand van de basale bocht, maakt u het slakkenhuis los van het vestibulaire deel van het temporale bot met behulp van # 55 tang. Plaats de # 55-tang in het ronde en ovale venster en duw naar beneden in de richting van de vestibule. Het slakkenhuis zal loskomen. Verwijder het vestibulaire deel van het binnenoor.</li>
	<li>Ga verder met het gebruik van # 55-tang en verwijder nu stukjes basaal cochleair bot, beginnend bij het middelste draaigebied. Duw de laterale wandlaag voorzichtig onder het bot om deze los te maken.</li>
	<li>Verwijder het verste basale deel van de zijwand door te wrikken en voorzichtig aan het weefsel te trekken. Het bot in dit gebied kan te dik zijn om te worden verwijderd zonder het zachte weefsel eronder te beschadigen.</li>
	<li>Nu, met het basale deel van de zijwand losgemaakt, scheidt u zoveel mogelijk van de zijwand van het slakkenhuis. Dit kan door de #55 tang langs de zijwand te volgen. Borstel voorzichtig de tang tussen het bot en de resterende zijwand. Dit kan helemaal tot aan de apex in één stuk worden gedaan als de gebruiker ervaren is. Verplaats de zijwand naar verse PBS. OPMERKING: Hoewel grotere stukken SV gemakkelijker in beeld kunnen worden gebracht, gezien de delicate aard van de weefsels, kunnen kleinere stukken worden genomen (figuur 2F, G) en afhankelijk van de grootte kunnen ze ook werken voor beeldvorming.</li>
	<li>Gebruik #55 tang om de zijwand plat te leggen. De SV moet zichtbaar zijn als een donkerdere laag weefsel aan de binnenkant van de zijwand. OPMERKING: Gebruikers kunnen merken, met name dichter bij het apicale uiteinde, dat een deel van het SV-weefsel incidenteel loskomt van de laterale wand tijdens de dissectie.</li>
	<li>Wrik de SV-laag voorzichtig los om deze los te maken van de zijwand aan het basale uiteinde (figuur 2H). Duw de losgemaakte SV voorzichtig opzij en beweeg de tang verder naar het apicale uiteinde van de zijwand, waarbij de SV indien mogelijk als één lang lint wordt losgemaakt (figuur 2I). Knijp niet in de SV met een tang om eraan te trekken. Als het weefsel te kwetsbaar is om te worden gepakt, kan het ook worden verzameld met behulp van een weefselschep, zoals een chalazioncurette. OPMERKING: Het verplaatsen van de SV moet altijd worden gedaan onder lichtmicroscopie om ervoor te zorgen dat deze niet verloren gaat. Wees altijd voorzichtig bij het grijpen met een tang vanwege het risico op schade. Gebruikers kunnen merken dat het gebruik van chalazion curette het risico op schade aan SV-weefsel vermindert. Voor single-nucleus sequencing gaat u verder met rubriek 5. Ga voor SV-immunostaining verder met rubriek 7.</li>
</ol>5. SV single-nucleus suspensie
OPMERKING: Dit protocol is specifiek aangepast voor SV-weefsel op basis van het single-nucleus suspensieprotocol van een gepubliceerde fabrikant. Platforms van verschillende fabrikanten kunnen worden gebruikt31. Gezien de platformspecifieke variatie wordt aanbevolen om het fabrikantspecifieke protocol dat bij de apparatuur wordt geleverd, te herzien. Om optimale resultaten voor sNuc-Seq te bereiken en RNA-afbraak te minimaliseren, hoe sneller de weefseldissectie hoe beter (aanbevolen binnen 15-20 minuten na euthanasie). Het kan nuttig zijn om één dier tegelijk te euthanaseren en alleen als het klaar is om te ontleden. Door meerdere mensen tegelijkertijd aan de dissecties te laten werken, kan ook de degradatietijd worden geëlimineerd (bijvoorbeeld een laboratoriumpersoneel dat aan het linkeroor werkt terwijl een ander aan het rechteroor werkt).
<ol><li>Als het SV-weefsel wordt gebruikt voor sNuc-Seq, plaats het weefsel dan in gekoelde lysisbuffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,005% nonidet P40 in nucleasevrij water). OPMERKING: Als de volgorde onmiddellijk na de dissectie moet worden uitgevoerd, gaat u verder met het protocol. Als het gewenst is om het protocol te pauzeren, is SV-conservering mogelijk door de SV in RNAlater te plaatsen. Een nacht bewaren bij 4 °C, vervolgens flashbevriezen in vloeibare stikstof en bewaren bij -80 °C tot het klaar is voor gebruik. Wanneer u klaar bent voor gebruik, ontdooit en wast u twee keer in PBS gedurende elk 5 minuten en gaat u verder met homogenisatie (stap 5.2).</li>
	<li>Homogeniseer het weefsel in een homogenisator van 2 ml met 10-20 slagen op ijs. OPMERKING: De glazen cilinder maakt handmatig contact met de onderkant van de glazen buis, waardoor de SV wordt gefragmenteerd. De SV is delicaat, dus 20 slagen bereikt meestal een succesvolle homogenisatie.</li>
	<li>Lyseer het weefsel gedurende 25 minuten op ijs. OPMERKING: De lysistijd varieert afhankelijk van het weefseltype. Een lysis van 25 minuten in SV-weefsel kan een lage levensvatbaarheid van de cel bereiken (minder dan 4%), maar de tijd kan worden aangepast als de levensvatbaarheid van de cel te hoog is (stap 5.8).</li>
	<li>Filtreer door een filter van 30 μm en draai het filtraat gedurende 5 minuten op 500 x g bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie van de celkorrel in 1 ml was- en resuspensiebuffer (1x PBS, 1% runderserumalbumine [BSA], 0,2U/μL RNaseremmer).</li>
	<li>Filtreer de cellen door een filter van 10 μm en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C op 500 x g .</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspensie in 50 μL was- en resuspensiebuffer van de kernen.</li>
	<li>Tel de kernen met behulp van een celteller en trypan blauwe kleuring. Verdun 5 μL van de celsuspensie tot 50 μL 1x PBS voor celtelling; De levensvatbaarheid moet op dit moment minimaal zijn (3%-4%). Als de levensvatbaarheid hoger blijkt te zijn, pas dan het protocol voor stap 5.3 (lysis) aan en standaardiseer de lysistijd om voldoende lysis van de cellen te garanderen. OPMERKING: Een hoge levensvatbaarheid van cellen in een enkel kernpreparaat betekent dat er meer intacte cellen zijn dan gewenst en dat extra vertering nodig kan zijn.</li>
	<li>Laad het monster met de gewenste nucleaire dichtheid op het apparaat/de chip van de fabrikant (zie de handleiding van de fabrikant). Single-nuclei captures zijn nu klaar. OPMERKING: Van één volwassen muis SV wordt gewoonlijk 50 μL van de suspensie in een concentratie van 150.000 kernen / ml bereikt.</li>
</ol>6. SV single-nucleus sequencing
<ol><li>Stuur de monsters naar de kernfaciliteit voor sequencing. OPMERKING: Dit deel van het protocol volgt de algemene stappen van (1) gel beads-in emulsie (GEM) generatie en barcodering, (2) post-GEM-RT opschoning en cDNA amplificatie, en (3) 3' genexpressie bibliotheek constructie. De rest van het sNuc-Seq-protocol is relatief lang en het wordt aanbevolen dat lezers hun fabrikantspecifieke protocol gebruiken. De handleiding van de fabrikant beschrijft waarschijnlijk stappen met specifieke details en bijbehorende afbeeldingen. Er kunnen ook 'how-to'-video's op de website van de fabrikant staan. Gegenereerde datasets kunnen op een dimensionale gereduceerde manier worden weergegeven, zoals een uniforme variëteitbenadering en projectie (UMAP; Figuur 3). Veel labs gebruiken een sequencingkern die dit protocol voor gebruikers kan uitvoeren.</li>
</ol>7. SV immunostaining en weefselmontage
<ol><li>Als het weefsel wordt gebruikt voor immunostaining, breng het dan over naar een 24-well plaat, ondergedompeld in 200 μL van 4% paraformaldehyde (PFA) in 1x PBS, en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. OPMERKING: Het is nuttig om alle vloeistofverwijdering, wassen en immunostaining onder een microscoop uit te voeren. Visualisatie tijdens het pipetteren van het weefsel zorgt ervoor dat het niet per ongeluk verloren gaat tijdens het verwijderen van vloeistof. De volumes van de antilichamen en wasbeurten kunnen worden aangepast zolang het volume groot genoeg is om het SV-weefsel in de oplossing onder te dompelen.</li>
	<li>Verwijder na de fixatiestap de PFA door twee korte wasbeurten uit te voeren in 1x PBS (ongeveer 500 μL) bij 4 °C gedurende 5 minuten elk op een orbitale shaker bij lage (30-50) RPM. Bij opslag kan het weefsel worden opgeslagen in 1x PBS bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de PBS en permeabiliseer en blokkeer gedurende minimaal 1 uur bij kamertemperatuur in ongeveer 300 μL PBS-T-oplossing (0,05 Tween20 in 1x PBS met 10% foetaal runderserum). OPMERKING: Primaire en secundaire antilichamen moeten in deze blokkerende oplossing worden verdund.</li>
	<li>Kleuring van het weefsel met primair antilichaam volgens de specificaties van het gebruikte specifieke antilichaam, meestal 's nachts bij 4 °C . Verwijder de resterende PBS en voeg het verdunde primaire antilichaam toe. OPMERKING: De verdunning moet worden gekozen op basis van de suggesties van de fabrikant, gepubliceerde gegevens, eerdere ervaring, enz. Meestal is de eerste concentratie om te testen een verdunning van 1:100-200. Voor het voorbeeld dat in dit artikel wordt gepresenteerd, werden de GS-IB4- en DAPI-antilichamen elk verdund bij 1:200. Als kleuring voor meer dan één eiwit, kunnen meerdere primaire antilichamen worden gecombineerd tot dezelfde oplossing, zolang elk primair antilichaam een andere gastheer heeft om kruisreactiviteit van secundaire antilichamen te voorkomen.</li>
	<li>Was het primaire antilichaam van het weefsel met ongeveer 500 μL 1x PBS tweemaal gedurende 10 minuten elk op een orbitale shaker bij lage RPM. OPMERKING: Blijf ervoor zorgen dat het SV-weefsel is ondergedompeld in de oplossing en niet vastzit aan de zijkant van de put.</li>
	<li>Kleuring met een secundair antilichaam volgens de specificaties van het gebruikte specifieke antilichaam, meestal gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij laag toerental. Bedek de 24-putplaat zodat het fluorescerend gelabelde secundaire antilichaam wordt beschermd tegen licht. OPMERKING: Als er meer dan één secundair antilichaam nodig is, combineer dan de secundaire antilichamen in dezelfde oplossing. Zorg ervoor dat u cross-labeling vermijdt.</li>
	<li>Was het secundaire antilichaam van het weefsel met ongeveer 500 μL 1x PBS vier keer gedurende 5 minuten elk op een orbitale shaker bij lage RPM. Houd de 24-putplaat afgedekt om deze te beschermen tegen licht.</li>
	<li>Bereid de grotere microslide (75 mm x 25 mm) voor door twee kleine strepen lijm langs de 25 mm-as te plaatsen, net kleiner dan de 18 mm x 18 mm kleinere glazen afdekplaat. Plaats één druppel montagereagens (ongeveer 50 μL) tussen de lijmstrepen. OPMERKING: De lijm creëert een kleine hoeveelheid verticale ruimte, zodat wanneer de tweede coverslip bovenop wordt geplaatst, het SV-weefselmonster veilig kan bestaan, maar op zijn plaats kan blijven. Hoewel de striadikte 30-40 micron is, moet het knijpen van het weefsel tussen de glasoppervlakken worden vermeden om de morfologie te behouden. Als alternatief kan ook doorzichtige tape worden gebruikt.</li>
	<li>Pak met behulp van een #55-tang zo min mogelijk weefsel aan het ene uiteinde van de SV en breng het over van de PBS naar de druppel montagereagens op de grotere microslide (75 mm x 25 mm). Plaats het ene uiteinde van een kleinere glazen afdekplaat (18 mm x 18 mm) op de dia waar een streep lijm is geplaatst en laat voorzichtig los om te voorkomen dat er luchtbellen ontstaan. De coverslip valt op de andere lijmstreep en bedekt het SV-weefsel.</li>
	<li>Sluit de houder af door op elke hoek van de houder een druppel transparante nagellak te deppen. Label het monster dienovereenkomstig op de glazen afdekkingslip weg van het visualisatieveld. Het is nu klaar voor confocale microscopie (figuur 4).</li>
	<li>Visualiseer het SV-weefsel met behulp van een dissectiemicroscoop om ervoor te zorgen dat het plat ligt en niet in de buurt van luchtbellen. Als het SV-weefsel niet correct is georiënteerd, kan de gebruiker proberen luchtbellen naar buiten te duwen of voorzichtig de kleinere glazen afdekplaat verwijderen en de SV verplaatsen. Dit moet voorzichtig worden gedaan om te voorkomen dat de glazen afdekplaten breken.</li>
</ol>

Stria vascularis-microdissectie voor sequencing met één kern of immunokleuring

<ol><li>Bosher, S. K., Warren, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+electrochemistry+of+the+cochlear+endolymph+of+the+rat%3A+a+quantitative+study+of+its+electrical+potential+and+ionic+composition+as+determined+by+means+of+flame+spectrophotometry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B.+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Observations on the electrochemistry of the cochlear endolymph of the rat: a quantitative study of its electrical potential and ionic composition as determined by means of flame spectrophotometry.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series B. Biological Sciences. 171 (1023), 227-247 (1968).</li>
<li>Patuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+flow+in+stria+vascularis+and+the+production+and+regulation+of+cochlear+endolymph+and+the+endolymphatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Ion flow in stria vascularis and the production and regulation of cochlear endolymph and the endolymphatic potential.</a> Hearing Research. 277 (1-2), 4-19 (2011).</li>
<li>Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K%2B+cycling+and+the+endocochlear+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">K+ cycling and the endocochlear potential.</a> Hearing Research. 165 (1-2), 1-9 (2002).</li>
<li>Adachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+underlying+maintenance+of+the+endocochlear+potential+by+the+K%2B+transport+system+in+fibrocytes+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The mechanism underlying maintenance of the endocochlear potential by the K+ transport system in fibrocytes of the inner ear.</a> The Journal of Physiology. 591 (18), 4459-4472 (2013).</li>
<li>Hibino, H., Nin, F., Tsuzuki, C., Kurachi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+is+the+highly+positive+endocochlear+potential+formed%3F+The+specific+architecture+of+the+stria+vascularis+and+the+roles+of+the+ion-transport+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">How is the highly positive endocochlear potential formed? The specific architecture of the stria vascularis and the roles of the ion-transport apparatus.</a> Pflugers Archiv. 459 (4), 521-533 (2010).</li>
<li>Lang, F., Vallon, V., Knipper, M., Wangemann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+significance+of+channels+and+transporters+expressed+in+the+inner+ear+and+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional significance of channels and transporters expressed in the inner ear and kidney.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 293 (4), C1187-C1208 (2007).</li>
<li>Liu, W., Schrott-Fischer, A., Glueckert, R., Benav, H., Rask-Andersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+%26%2334%3Bcochlear+battery%26%2334%3B-claudin-11+barrier+and+ion+transport+proteins+in+the+lateral+wall+of+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The human &#34;cochlear battery&#34;-claudin-11 barrier and ion transport proteins in the lateral wall of the cochlea.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 239(2017).</li>
<li>Marcus, D. C., Wu, T., Wangemann, P., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNJ10+%28Kir4.1%29+potassium+channel+knockout+abolishes+endocochlear+potential%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">KCNJ10 (Kir4.1) potassium channel knockout abolishes endocochlear potential.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 282 (2), C403-C407 (2002).</li>
<li>Spicer, S. S., Schulte, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+inner+ear+fibrocytes+according+to+their+ion+transport+related+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of inner ear fibrocytes according to their ion transport related activity.</a> Hearing Research. 56 (1-2), 53-64 (1991).</li>
<li>Wangemann, P., Liu, J., Marcus, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+transport+mechanisms+responsible+for+K%2B+secretion+and+the+transepithelial+voltage+across+marginal+cells+of+stria+vascularis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Ion transport mechanisms responsible for K+ secretion and the transepithelial voltage across marginal cells of stria vascularis in vitro.</a> Hearing Research. 84 (1-2), 19-29 (1995).</li>
<li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+unique+ion+permeability+profile+of+cochlear+fibrocytes+and+its+contribution+to+establishing+their+positive+resting+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%22%5BJournal%5D)">The unique ion permeability profile of cochlear fibrocytes and its contribution to establishing their positive resting membrane potential.</a> Pflugers Archiv. 468 (9), 1609-1619 (2016).</li>
<li>Johns, J. D., Adadey, S. M., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+stria+vascularis+in+neglected+otologic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The role of the stria vascularis in neglected otologic disease.</a> Hearing Research. 428, 108682(2023).</li>
<li>Kim, J., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+real-time+imaging+reveals+megalin+as+the+aminoglycoside+gentamicin+transporter+into+cochlea+whose+inhibition+is+otoprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo real-time imaging reveals megalin as the aminoglycoside gentamicin transporter into cochlea whose inhibition is otoprotective.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 119 (9), e2117846119(2022).</li>
<li>Zdebik, A. A., Wangemann, P., Jentsch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+ion+movement+in+the+inner+ear%3A+insights+from+genetic+disease+and+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Potassium ion movement in the inner ear: insights from genetic disease and mouse models.</a> Physiology. 24, 307-316 (2009).</li>
<li>Chen, J., Zhao, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+an+inwardly+rectifying+K%2B+channel+%28Kir4.1%29+in+the+inner+ear+and+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of an inwardly rectifying K+ channel (Kir4.1) in the inner ear and hearing loss.</a> Neuroscience. 265, 137-146 (2014).</li>
<li>Steel, K. P., Barkway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Another+role+for+melanocytes%3A+their+importance+for+normal+stria+vascularis+development+in+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Another role for melanocytes: their importance for normal stria vascularis development in the mammalian inner ear.</a> Development. 107 (3), 453-463 (1989).</li>
<li>Ito, T., Nishio, A., Wangemann, P., Griffith, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+irreversible+hearing+loss+is+caused+by+stria+vascularis+degeneration+in+an+Slc26a4-insufficient+mouse+model+of+large+vestibular+aqueduct+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progressive irreversible hearing loss is caused by stria vascularis degeneration in an Slc26a4-insufficient mouse model of large vestibular aqueduct syndrome.</a> Neuroscience. 310, 188-197 (2015).</li>
<li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rare+spindle+and+root+cell+transcriptional+profiles+in+the+stria+vascularis+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of rare spindle and root cell transcriptional profiles in the stria vascularis of the adult mouse cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18100(2020).</li>
<li>Gow, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deafness+in+claudin+11-null+mice+reveals+the+critical+contribution+of+basal+cell+tight+junctions+to+stria+vascularis+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Deafness in claudin 11-null mice reveals the critical contribution of basal cell tight junctions to stria vascularis function.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (32), 7051-7062 (2004).</li>
<li>Chang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virally+mediated+Kcnq1+gene+replacement+therapy+in+the+immature+scala+media+restores+hearing+in+a+mouse+model+of+human+Jervell+and+Lange-Nielsen+deafness+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Virally mediated Kcnq1 gene replacement therapy in the immature scala media restores hearing in a mouse model of human Jervell and Lange-Nielsen deafness syndrome.</a> EMBO Molecular Medicine. 7 (8), 1077-1086 (2015).</li>
<li>Faridi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+and+phenotypic+spectra+of+KCNE1+deficiency+in+Jervell+and+Lange-Nielsen+Syndrome+and+Romano-Ward+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Mutation%22%5BJournal%5D)">Mutational and phenotypic spectra of KCNE1 deficiency in Jervell and Lange-Nielsen Syndrome and Romano-Ward Syndrome.</a> Human Mutation. 40 (2), 162-176 (2019).</li>
<li>Wangemann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+KCNJ10+protein+expression+abolishes+endocochlear+potential+and+causes+deafness+in+Pendred+syndrome+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medicine%22%5BJournal%5D)">Loss of KCNJ10 protein expression abolishes endocochlear potential and causes deafness in Pendred syndrome mouse model.</a> BMC Medicine. 2, 30(2004).</li>
<li>Kitajiri, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+patterns+of+claudins%2C+tight+junction+adhesion+molecules%2C+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Expression patterns of claudins, tight junction adhesion molecules, in the inner ear.</a> Hearing Research. 187 (1-2), 25-34 (2004).</li>
<li>Jagger, D. J., Nevill, G., Forge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+properties+of+cochlear+root+cells+are+consistent+with+roles+in+potassium+recirculation+and+spatial+buffering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">The membrane properties of cochlear root cells are consistent with roles in potassium recirculation and spatial buffering.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 11 (3), 435-448 (2010).</li>
<li>Ito, T., Kurata, N., Fukunaga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages+in+the+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages in the stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 13, 818395(2022).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFA165+gene+therapy+ameliorates+blood-labyrinth+barrier+breakdown+and+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">VEGFA165 gene therapy ameliorates blood-labyrinth barrier breakdown and hearing loss.</a> JCI Insight. 6 (8), e143285(2021).</li>
<li>Shi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiology+of+the+cochlear+intrastrial+fluid-blood+barrier+%28review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Pathophysiology of the cochlear intrastrial fluid-blood barrier (review).</a> Hearing Research. 338, 52-63 (2016).</li>
<li>Gu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+potential+Meniere%27s+disease+targets+in+the+adult+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Identification of potential Meniere's disease targets in the adult stria vascularis.</a> Frontiers in Neurology. 12, 630561(2021).</li>
<li>Fischer, J., Ayers, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+nucleus+RNA-sequencing%3A+how+it%27s+done%2C+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Topics+in+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single nucleus RNA-sequencing: how it's done, applications and limitations.</a> Emerging Topics in Life Sciences. 5 (5), 687-690 (2021).</li>
<li>Korrapati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+and+single+nucleus+RNA-Seq+reveal+cellular+heterogeneity+and+homeostatic+regulatory+networks+in+adult+mouse+stria+vascularis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single cell and single nucleus RNA-Seq reveal cellular heterogeneity and homeostatic regulatory networks in adult mouse stria vascularis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 316(2019).</li>
<li>Pyle, M. P., Hoa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+single-cell+sequencing+for+the+field+of+otolaryngology%3A+A+contemporary+review%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope+Investigative+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Applications of single-cell sequencing for the field of otolaryngology: A contemporary review.</a> Laryngoscope Investigative Otolaryngology. 5 (3), 404-431 (2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Shafer, M. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+analysis+of+single-cell+transcriptomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cross-species analysis of single-cell transcriptomic data.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 175(2019).</li>
<li>Chen, G., Ning, B., Shi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-Seq+technologies+and+related+computational+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-Seq technologies and related computational data analysis.</a> Frontiers in Genetics. 10, 317(2019).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nature Reviews Genetics. 22 (10), 627-644 (2021).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. A., Lee, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> Journal of Pathology and Translational Medicine. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Grindberg, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-sequencing+from+single+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA-sequencing from single nuclei.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).</li>
<li>Montgomery, S. C., Cox, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+dissection+and+immunofluorescence+of+the+adult+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visuazlied+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea.</a> Journal of Visuazlied Experiments. (107), e53561(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vóór de komst van single-cell sequencing gebruikten veel onderzoekers bulkweefselanalyse, die het alleen mogelijk maakte om transcriptomen gemiddeld over cellen te analyseren. In het bijzonder maakten single-cell en sNuc-Seq het mogelijk om het transcriptoom van een enkele cel of enkele kern te isoleren, respectievelijk32. In dit geval kunnen transcriptomen met één kern worden geïdentificeerd voor marginale, intermediaire en basale cellen, evenals spindelcellen30. Dit maakt...

Het slakkenhuis bestaat uit drie met vloeistof gevulde kamers, de scala vestibuli, scala media en scala tympani. De scala vestibuli en scala tympani bevatten elk perilymfe, dat een hoge concentratie natrium (138 mM) en een lage concentratie kalium (6,8 mM)1 heeft. Het scala media bevat endolymfe, dat een hoge concentratie kalium (154 mM) en een lage concentratie natrium (0,91 mM)1,2,3 heeft. Dit verschil in ionenconcentratie kan worden aangeduid als de endocochleaire potentiaal (EP) en wordt voornamelijk gegenereerd door de beweging van kaliumionen door verschillende ionkanalen en gap junctions in de stria vascularis (SV) langs de zijwand van het slakkenhuis 4,5,6,7,8,9,10,11 . De SV is een heterogeen, sterk gevasculariseerd weefsel dat het mediale aspect van de laterale wand van het slakkenhuis bekleedt en drie hoofdceltypen bevat: marginale, intermediaire en basale cellen12 (figuur 1).
Marginale cellen zijn verbonden door tight junctions om het meest mediale oppervlak van de SV te vormen. Het apicale membraan staat tegenover de endolymfe van de scala-media en draagt bij aan het transport van kaliumionen naar de endolymfe met behulp van verschillende kanalen, waaronder KCNE1 / KCNQ1, SLC12A2 en Na + -K + -ATPase (NKA) 5,10,13,14. Tussenliggende cellen zijn gepigmenteerde cellen die zich tussen marginale en basale cellen bevinden en kaliumtransport door de SV vergemakkelijken met behulp van KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basale cellen liggen in de nabijheid van de laterale wand van het slakkenhuis en zijn nauw verbonden met fibrocyten van het spiraalligament om kaliumrecycling van de perilymfe12 te bevorderen. Pathologie van de SV is betrokken bij tal van otologische aandoeningen17,18. Mutaties in genen die tot expressie komen in de belangrijkste SV-celtypen, zoals Kcnq1, Kcne1, Kcnj10 en Cldn11, kunnen doofheid en SV-disfunctie veroorzaken, waaronder het verlies van EP 19,20,21,22,23. Naast de drie belangrijkste celtypen zijn er andere minder bestudeerde celtypen in de SV, zoals spindelcellen 22, wortelcellen12,24, macrofagen 25, pericyten 26 en endotheelcellen 27, die onvolledig gedefinieerde rollen hebben met ionische homeostase en het genereren van EP 28.
In vergelijking met bulk RNA-sequencing biedt single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) informatie over celheterogeniteit, in plaats van een gemiddelde van mRNA over een groep cellen29, en kan bijzonder nuttig zijn bij het bestuderen van de heterogene SV30. SNuc-Seq heeft bijvoorbeeld transcriptionele analyse geproduceerd die suggereert dat er een rol kan zijn voor spindel- en wortelcellen bij het genereren van EP's, gehoorverlies en de ziekte van Ménière18. Verdere transcriptionele karakterisering van de verschillende SV-celtypen kan ons waardevolle informatie verschaffen over de pathofysiologie die ten grondslag ligt aan verschillende mechanismen en subtypen van SV-gerelateerde gehoorfluctuatie en gehoorverlies. De oogst van deze delicate binnenoorstructuren is van het grootste belang voor een optimale weefselanalyse.
In deze studie wordt de microdissectiebenadering beschreven om toegang te krijgen tot en de stria vascularis te isoleren van het volwassen muizenslakkenhuis voor sNuc-Seq of immunostaining. Dissectie van de volwassen muis SV is nodig om verschillende SV-celtypen te begrijpen en hun rol in het gehoor verder te karakteriseren.

<table><tbody><tr><td>10-&micro;m filter (Polyethylenterephthalat)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50010-01</td><td>Filterweefsel tijdens sNuc-Seq</td></tr><tr><td>18 x 18 mm dekglaas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541A</td><td>Dekglaas om SV te plaatsen</td></tr><tr><td>30-&micro;m filter (Polyethylenterephthalat)</td><td>PluriSelect</td><td>#43-50030-03</td><td>Filterweefsel tijdens sNuc-Seq</td></tr><tr><td>75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide</td><td>Daigger</td><td>EF15978Z</td><td>Microslide om SV op te plaatsen</td></tr><tr><td>C57BL/6J Muizen</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID: IMSR_JAX:000664</td><td>Algemene muisstam met pigment dat gemakkelijker zichtbaar is in de intermediaire cellen van de SV.</td></tr><tr><td>Celteller</td><td>Logos Biosystems</td><td>L20001</td><td>Gebruikt voor celtelling</td></tr><tr><td>Chalizon curette 5'', maat 3 2,5 mm</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>15-1020</td><td>Gebruikt om SV over te brengen</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1</td><td>Chromium</td><td>PN-1000141</td><td>Genereert single cel 3' genexpressiebibliotheken</td></tr><tr><td>Klaar nagellak</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1849418</td><td>Gebruikt voor het verzegelen van SV-montage</td></tr><tr><td>Corning Falcon Standaard Tissue Cultuur Schaaltjes, 24 putjes</td><td>Corning</td><td>08-772B</td><td>Cultuurschaal gebruikt om specimen vast te houden tijdens dissectie</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306, RRID: AB_2629482</td><td>Kleurstof gebruikt voor kernlabeling</td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8938</td><td>Gebruikt om weefsel te homogeniseren voor sNuc-seq</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td>Algemeen pincet voor dissectie</td></tr><tr><td>Dumont #55 Pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>Pincet met fijne punt die SV manipulatie gemakkelijker maakt</td></tr><tr><td>Fetaal Rundserum</td><td>ThermoFisher</td><td>16000044</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Lijmstick</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0691392</td><td>Gebruikt voor het plaatsen van SV</td></tr><tr><td>GS-IB4 Antilichaam</td><td>Molecular Probes</td><td>I21411, RRID: AB-2314662</td><td>Antilichaam gebruikt voor capillaire labeling</td></tr><tr><td>KCNJ10-ZsGreen Muizen</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Transgene muis die KCNJ10-ZsGreen uitdrukt, met name in de intermediaire cellen van de SV.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9530G</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Montagereagens</td><td>ThermoFisher</td><td>#S36940</td><td>Montagereagens voor SV</td></tr><tr><td>Multiwell 24 putjes plaat</td><td>Corning</td><td>#353047</td><td>Plaat gebruikt voor immunokleuring</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ216183</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9-16-45-9</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Nuclease vrij water</td><td>ThermoFisher</td><td>4387936</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Orbitale shaker</td><td>Silent Shake</td><td>SYC-2102A</td><td>Gebruikt voor stappen van immunokleuring</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher</td><td>J61196.AP</td><td>Gebruikt voor stappen van immunokleuring en dissectie</td></tr><tr><td>RNA Later</td><td>Invitrogen</td><td>AM7021</td><td>Gebruikt voor conservering van SV voor sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Scizzors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Gebruikt voor het splitsen van muizenschedel</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15506017</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Trypanblauw kleurstof</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>Gebruikt voor celtelling</td></tr><tr><td>Tween20</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ20605AP&nbsp;</td><td>Gebruikt voor stappen van sNuc-Seq</td></tr><tr><td>Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>Microscoop gebruikt voor dissecties</td></tr></tbody></table>

dissectie van volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Dissection of Adult Mouse Stria Vascularis for Single-Nucleus Sequencing or Immunostaining

Endocochleair potentieel, dat wordt gegenereerd door de stria vascularis, is essentieel om een omgeving te behouden die bevorderlijk is voor geschikte haarcelmechanotransductie en uiteindelijk gehoor. Pathologieën van de stria vascularis kunnen leiden tot een verminderd gehoor. Dissectie van de volwassen stria vascularis maakt gerichte single-nucleus capture en daaropvolgende single-nucleus sequencing en immunostaining mogelijk. Deze technieken worden gebruikt om stria vascularis pathofysiologie op eencellig niveau te bestuderen. 
Single-nucleus sequencing kan worden gebruikt in de setting van transcriptionele analyse van de stria vascularis. Ondertussen blijft immunostaining nuttig bij het identificeren van specifieke populaties van cellen. Beide methoden vereisen een goede stria vascularis-dissectie als voorwaarde, wat technisch uitdagend kan blijken te zijn.

We presenteren een methode om de SV te isoleren voor gebruik voor sNuc-Seq of immunostaining. De relevante anatomie (figuur 1) van het slakkenhuis ten opzichte van de SV kan gebruikers helpen de organisatie van de SV en de stappen van het dissectieprotocol beter te begrijpen.
Elke stap van deze microdissectie van SV van een P30-muis wordt gedetailleerd beschreven in de bijbehorende video en snapshots van de belangrijkste stappen van deze dissectie en isolatie van ...

De stria vascularis is van vitaal belang voor het genereren van endocochleair potentieel. Hier presenteren we de dissectie van de volwassen muis stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Endocochlear potential, which is generated by the stria vascularis, is essential to maintain an environment conducive to appropriate hair cell ...

De stria vascularis functioneert om de endocochleaire potentiaal te genereren en de ionhomeostase in het slakkenhuis te reguleren. Het auditieve ontwikkelings- en herstelprogramma probeert de onderliggende mechanismen te begrijpen die disfunctionele ionhomeostase verbinden met gehoor- en stabiliteitsstoornissen, ziekten waarbij fluctuatie in of plotseling gehoorverlies optreedt. Werk in mijn lab heeft het transcriptionele landschap van de stria vascularis vastgesteld en heeft bijgedragen aan ons begrip van het belang ervan voor het gehoor.We hebben deze gegevens gebruikt om parallellen te trekken met slecht begrepen gehoor- en stabiliteitsstoornissen, waaronder de ziekte van Ménière. Dit protocol maakt de dissectie en isolatie van stria vascularis met hele mount mogelijk voor verdere moleculaire studies, waaronder immunohistochemie. Gezien het feit dat stria vascularis-celtypen ingewikkeld met elkaar verweven zijn, heeft het gebruik van nucleaire isolatie en single-nucleus RNA-sequencing ons begrip van de verschillende transcriptionele machinerie vergemakkelijkt.

dissection-adult-mouse-stria-vascularis-for-single-nucleus-sequencing

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Source: Daynac, M., et. al. Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates time-lapse imaging of neural stem cells (NSCs) from a transgenic mouse brain using a confocal laser scanning microscope. NSCs fluoresce red during the G1 phase and are non-fluorescent in other cell-cycle phases. An adhered NSC culture is placed in the imaging chamber, imaging parameters are...

Time-Lapse Imaging of Mouse Neural Stem Cell Division Using Confocal Microscopy

Hier beschrijven we een procedure gebaseerd op het gebruik van lentivirale deeltjes voor de langetermijn genetische modificatie van neurale stamcellen en/of hun aangrenzende ependymale cellen in de volwassen ventriculair-subventriculaire neurogene niche, wat de aparte analyse mogelijk maakt van cel-autonome en niet-autonome, niche-afhankelijke effecten op neurale stamcellen.

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Hier presenteren we een protocol om snel isoleren kwalitatief hoogwaardige kernen uit de verse of bevroren weefsel voor downstream massaal parallelle RNA sequencing. Wij omvatten wasmiddel-mechanische en hypotone-mechanische weefsel verstoring en cel lysis van de opties, die beide kunnen worden gebruikt voor isolatie van kernen.

Isolatie van volwassen ruggenmerg kernen voor Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

We bieden een protocol voor isolatie van Microglia uit verschillende ontleed gebieden van een volwassen muis hersen halfrond, gevolgd door semi-geautomatiseerde bibliotheek voorbereiding voor diepe eencellige RNA-sequencing van volledige lengte transcriptomes. Deze methode zal helpen om functionele heterogeniteit van Microglia in gezondheid en ziekte te verhelmaken.

Isolatie van regiospecifieke Microglia van één volwassen muis hersen halfrond voor diepe eencellige RNA-sequencing

Dit protocol beschrijft transillumination-ondersteunde microdissectie van segmenten van volwassen muis seminifereuze tubuli die specifieke stadia van seminifereuze epitheelcyclus vertegenwoordigen, en celtypen daarin, en daaropvolgende immunostaining van squashpreparaten en intacte tubulussegmenten.

Transillumination-Assisted Dissectie van specifieke stadia van de muis seminifereuze epitheelcyclus voor downstream immunostaininganalyses

Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.

Nuclei-isolatie van volwassen muizennier voor single-nucleus RNA-sequencing

Dit protocol beschrijft de gedetailleerde, low-input monstervoorbereiding voor single-nucleus sequencing, inclusief de dissectie van muis superieure cervicale en stellate ganglia, celdissociatie, cryopreservatie, nucleus isolatie en hashtag barcoding.

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Het vermogen om stamcellen en hun nakomelingen permanent te markeren met een fluorofoor met behulp van een induceerbare transgene lineage tracing muislijn maakt ruimtelijke en temporele analyse van activering, proliferatie, migratie en / of differentiatie in vivo mogelijk. Lineage tracing kan nieuwe informatie onthullen over lineage commitment, reactie op interventie(s) en multipotentie.

Afstamming Tracering van induceerbare fluorescerend gelabelde stamcellen in het volwassen muizenbrein

Hier wordt een methode gepresenteerd om enkele kernen geïsoleerd uit de gyrus van de muis te sequencen die de meeste neuronen uitsluit door fluorescentie-geactiveerde kernen (FAN) -sortering. Deze aanpak genereert hoogwaardige expressieprofielen en vergemakkelijkt de studie van de meeste andere celtypen die in de niche zijn vertegenwoordigd, inclusief schaarse populaties zoals neurale stamcellen.

Fluorescentie-geactiveerde kernen negatieve sortering van neuronen gecombineerd met single nuclei RNA-sequencing om de hippocampale neurogene niche te bestuderen

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

Leer de dissectie van de stria vascularis bij volwassen muizen voor single-nucleus sequencing en immunostaining. Deze methode helpt onderzoekers het transcriptielandschap te onderzoeken en gehoorinstabiliteit te begrijpen.

Dissectie van volwassen muis Stria vascularis voor single-nucleus sequencing of immunostaining

Meer video's verkennen