Name: Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T12:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Verken het MicroSiM barrièreweefselplatform voor modellering van de bloed-hersenbarrière met menselijke iPSC-cellen. Deze methode onderzoekt hoe systemische ontsteking de barrièreintegriteit beïnvloedt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.M., B.E., T.R.G., M.C.M., P.K., M.T., K.C. en L.W. werden gefinancierd door NIH-subsidie R33 HL154249. J.L.M. werd gefinancierd door R44 GM137651. M.M. werd gefinancierd door de Schmidt Program Award Del Monte Institute for Neuroscience, University of Rochester. MT werd gefinancierd door RF1 AG079138. K.C. werd gefinancierd door de International Foundation for Ethical Research.

Analyse van bloed-hersenbarrièremodellen via immunofluorescentiekleuring

<ol><li>Villabona-Rueda, A., Erice, C., Pardo, C. A., Stins, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolving+concept+of+the+blood+brain+barrier+%28BBB%29%3A+from+a+single+static+barrier+to+a+heterogeneous+and+dynamic+relay+center%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The evolving concept of the blood brain barrier (BBB): from a single static barrier to a heterogeneous and dynamic relay center.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 405(2019).</li>
<li>Nation, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+breakdown+is+an+early+biomarker+of+human+cognitive+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier breakdown is an early biomarker of human cognitive dysfunction.</a> Nature Medicine. 25 (2), 270-276 (2019).</li>
<li>Ferrari, C. C., Tarelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+and+systemic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Disease%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease and systemic inflammation.</a> Parkinsons Disease. 116 (3), 436813(2011).</li>
<li>Koch, E. V., Ledwig, V., Bendas, S., Reichl, S., Dietzel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+barrier-on-chip%3A+a+technology+for+reproducible+practice+in+drug+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Tissue barrier-on-chip: a technology for reproducible practice in drug testing.</a> Pharmaceutics. 14 (7), 1451(2022).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+blood-brain+barrier+dysfunction+contributes+to+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Intrinsic blood-brain barrier dysfunction contributes to multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 145 (12), 4334-4348 (2022).</li>
<li>Ortiz, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+blood-brain+barrier+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Role of the blood-brain barrier in multiple sclerosis.</a> Archives of Medical Research. 45 (8), 687-697 (2014).</li>
<li>Orhun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+inflammatory+markers+and+cognitive+outcome+in+patients+with+acute+brain+dysfunction+due+to+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Association between inflammatory markers and cognitive outcome in patients with acute brain dysfunction due to sepsis.</a> Archives of Neuropsychiatry. 56 (1), 63-70 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Yang, W., Chen, F., Cui, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+and+cognitive+impairment%3A+neuroinvasive+and+blood-brain+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">COVID-19 and cognitive impairment: neuroinvasive and blood-brain barrier dysfunction.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 222(2022).</li>
<li>Hughes, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+activation+and+blood-brain+barrier+injury+as+risk+factors+for+delirium+in+critically+ill+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial activation and blood-brain barrier injury as risk factors for delirium in critically ill patients.</a> Critical Care Medicine. 44 (9), e809-e817 (2016).</li>
<li>Saraiva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+brain+drug+delivery%3A+Overcoming+blood-brain+barrier+to+treat+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated brain drug delivery: Overcoming blood-brain barrier to treat neurodegenerative diseases.</a> Journal of Control Release. 235 (10), 34-47 (2016).</li>
<li>Jolliet-Riant, P., Tillement, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transfer+across+the+blood-brain+barrier+and+improvement+of+brain+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Fundamental+%26+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Drug transfer across the blood-brain barrier and improvement of brain delivery.</a> Fundamental & Clinical Pharmacology. 13 (1), 16-26 (1999).</li>
<li>Abbott, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2009).</li>
<li>Siflinger-Birnboim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+sieving+characteristics+of+the+cultured+endothelial+monolayer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer.</a> Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).</li>
<li>Bischoff, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+assessing+microvascular+endothelial+barrier+function%3A+impedance-based+devices+versus+the+classic+macromolecular+tracer+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in assessing microvascular endothelial barrier function: impedance-based devices versus the classic macromolecular tracer assay.</a> Scientific Reports. 6, 23671(2016).</li>
<li>van der Helm, M. W., van der Meer, A. D., Eijkel, J. C., van den Berg, A., Segerink, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-chip+technology+for+blood-brain+barrier+research%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-chip technology for blood-brain barrier research.</a> Tissue Barriers. 4 (1), e1142493(2016).</li>
<li>Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+microfluidic+models+for+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">In vitro microfluidic models for neurodegenerative disorders.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).</li>
<li>Girard, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+and+low+permeability+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+depend+on+epithelial+or+endothelial+features%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">High and low permeability of human pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models depend on epithelial or endothelial features.</a> FASEB Journal. 37 (2), e22770(2023).</li>
<li>Vigh, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transendothelial+electrical+resistance+measurement+across+the+blood-brain+barrier%3A+a+critical+review+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Transendothelial electrical resistance measurement across the blood-brain barrier: a critical review of methods.</a> Micromachines. 12 (6), 685(2021).</li>
<li>Lea, T., et al. Caco-2 cell line. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLea%2C+T+%22The+Impact+of+Food+Bioactives+on+Health%3A+in+vitro+and+ex+vivo+models%22">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. Verhoeckx, K., et al. , Cham (CH): Springer. (2015).</li>
<li>Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+are+affected+by+junctional+length+in+immature+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers.</a> Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).</li>
<li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Laboratory+Automation%22%5BJournal%5D)">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li>
<li>Mossu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicon+nanomembrane+platform+for+the+visualization+of+immune+cell+trafficking+across+the+human+blood-brain+barrier+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A silicon nanomembrane platform for the visualization of immune cell trafficking across the human blood-brain barrier under flow.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (3), 395-410 (2019).</li>
<li>Castro Dias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+endothelial+tricellular+junctions+as+novel+sites+for+T-cell+diapedesis+across+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Brain endothelial tricellular junctions as novel sites for T-cell diapedesis across the blood-brain barrier.</a> Journal of Cell Science. 134 (8), jcs253880(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Khire, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+mimetics+for+the+study+of+lukocyte-endothelial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Microvascular mimetics for the study of lukocyte-endothelial interactions.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (2), 125-139 (2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+apicobasal+polarity+coordinates+distinct+responses+to+luminally+versus+abluminally+delivered+TNF-alpha+in+a+microvascular+mimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%3A+Quantitative+Biosciences+from+Nano+to+Macro%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell apicobasal polarity coordinates distinct responses to luminally versus abluminally delivered TNF-alpha in a microvascular mimetic.</a> Integrative Biology: Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 12 (11), 275-289 (2020).</li>
<li>DesOrmeaux, J. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoporous+silicon+nitride+membranes+fabricated+from+porous+nanocrystalline+silicon+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoporous silicon nitride membranes fabricated from porous nanocrystalline silicon templates.</a> Nanoscale. 6 (18), 10798-10805 (2014).</li>
<li>Hill, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+generation+nanoporous+silicon+nitride+membranes+for+high+toxin+clearance+and+small+format+hemodialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Second generation nanoporous silicon nitride membranes for high toxin clearance and small format hemodialysis.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (4), e1900750(2020).</li>
<li>Salminen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+dual-scale+nano-+and+microporous+membranes+for+vascular+transmigration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Ultrathin dual-scale nano- and microporous membranes for vascular transmigration models.</a> Small. 15 (6), e1804111(2019).</li>
<li>Gillmer, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+the+failure+of+ultrathin+porous+membranes+in+bulge+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Thin+Solid+Films%22%5BJournal%5D)">Predicting the failure of ultrathin porous membranes in bulge tests.</a> Thin Solid Films. 631, 152-160 (2017).</li>
<li>Ishimatsu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+permeability+of+ultrathin+nanopore+silicon+membrane+as+studied+using+nanofabricated+micropipet+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion-selective permeability of ultrathin nanopore silicon membrane as studied using nanofabricated micropipet probes.</a> Analytical Chemistry. 82 (17), 7127-7134 (2010).</li>
<li>Kim, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structure-permeability+relationship+of+ultrathin+nanoporous+silicon+membrane%3A+a+comparison+with+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A structure-permeability relationship of ultrathin nanoporous silicon membrane: a comparison with the nuclear envelope.</a> Journal of American Chemical Society. 130 (13), 4230-4231 (2008).</li>
<li>Snyder, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+molecular+separations+by+diffusion+through+ultrathin+nanoporous+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Science%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of molecular separations by diffusion through ultrathin nanoporous membranes.</a> Journal of Membrane Science. 369 (1-2), 119-129 (2011).</li>
<li>McCloskey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+%C2%B5SiM%3A+a+mass+produced%2C+rapidly+assembled%2C+and+reconfigurable+platform+for+the+study+of+barrier+tissue+models+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular µSiM: a mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (18), e2200804(2022).</li>
<li>Mansouri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+modular+microSiM+reconfigured%3A+integration+of+microfluidic+capabilities+to+study+in+vitro+barrier+tissue+models+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">The modular microSiM reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow.</a> Advanced Healthcare Materials. 11 (21), e2200802(2022).</li>
<li>Su, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tissue+chip+with+integrated+digital+immunosensors%3A+In+situ+brain+endothelial+barrier+cytokine+secretion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A tissue chip with integrated digital immunosensors: In situ brain endothelial barrier cytokine secretion monitoring.</a> Biosensors and Bioelectronics. 224, 115030(2023).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+brain+microvascular+endothelial+cell-like+cells+suitable+to+study+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human pluripotent stem cells to brain microvascular endothelial cell-like cells suitable to study immune cell interactions.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100563(2021).</li>
<li>Hudecz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+silicon+membranes+for+in+situ+optical+analysis+of+nanoparticle+translocation+across+a+human+blood-brain+barrier+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Ultrathin silicon membranes for in situ optical analysis of nanoparticle translocation across a human blood-brain barrier model.</a> ACS Nano. 14 (1), 1111-1122 (2020).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Stebbins, M. J., Du, F., Shusta, E. V., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+pericyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain pericyte-like cells from human pluripotent stem cell-derived neural crest.</a> Current Protocols. 1 (1), e21(2021).</li>
<li>Nishihara, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advancing+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+blood-brain+barrier+models+for+studying+immune+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Advancing human induced pluripotent stem cell-derived blood-brain barrier models for studying immune cell interactions.</a> FASEB Journal. 34 (12), 16693-16715 (2020).</li>
<li>Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+movers+and+shapers+in+immune+privilege+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The movers and shapers in immune privilege of the CNS.</a> Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).</li>
<li>Bechmann, I., Galea, I., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+blood-brain+barrier+%28not%29%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">What is the blood-brain barrier (not).</a> Trends in Immunology. 28 (1), 5-11 (2007).</li>
</ol>

J.L.M. is mede-oprichter van SiMPore en heeft een aandelenbelang in het bedrijf. SiMPore commercialiseert ultradunne technologieën op basis van silicium, waaronder de membranen die in deze studie worden gebruikt.

Hoewel membraanchips zijn ontworpen voor stabiliteit, kunnen ze barsten of breken als ze tijdens de montage verkeerd worden behandeld. Het is dus van cruciaal belang om de chip in de inkepingen van het chippincet vast te pakken en voorzichtig in de armatuur te plaatsen. Bij het hanteren van de apparaten in het algemeen moet extra voorzorgsmaatregelen worden genomen om de apparaten niet te stoten of te laten vallen. Tijdens het verlijmen van de membraanchip op armatuur A1 moet de chip plat en gecentreerd op de pilaar van armatuur A1 worden gelegd om te voorkomen dat het membraan scheurt tijdens de verlijming aan component 1. Verder moet elk contact met de blootgestelde PSA-lagen worden vermeden na het verwijderen van beschermende maskers. Bij het hanteren van component 2 na het verwijderen van de beschermende maskers, is het raadzaam om het langs de rand van het onderdeel te houden en een pincet te gebruiken om de driehoekige hoek vast te pakken die PSA-vrij is.
Hoewel celkweekprotocollen werden beschreven voor mogelijke BBB-modellen, kan het BMEC/pericyte co-cultuurmodel van de BBB dat hier wordt beschreven voldoende of onvoldoende zijn, afhankelijk van de fysiologische context en interessante vragen. Het transport van immuuncellen vindt bijvoorbeeld grotendeels plaats in de postcapillaire venulen van de hersenen41,42. In deze regio's scheidt een perivasculaire ruimte de BMEC/perocytenbarrière van de gliale limieten die door astrocyten zijn vastgesteld. In postcapillaire venulen bestaat de neurovasculaire eenheid (NVU) dus uit twee fysiek gescheiden barrières in serie, en astrocytaire eindvoeten maken geen rechtstreeks contact met de BMEC/pericyte bloedbarrière, die goed wordt weergegeven door het huidige model. Als het doel een NVU-model is dat rekening houdt met de impact van door astrocyten uitgescheiden factoren op de bloedbarrière, kan een astrocytencompartiment aan het apparaat worden toegevoegd dat oplosbare factoruitwisseling door de perivasculaire ruimte mogelijk maakt. Dit voorbeeld werd eerder geïllustreerd34 en zou kunnen worden uitgebreid met andere cellen zoals microglia en neuronen in een 3D 'hersen'-compartiment. De modulaire architectuur van het platform maakt het mogelijk om eenvoudige assemblagestrategieën te gebruiken om deze herconfiguraties te realiseren, zodat het platform zo eenvoudig of complex is als nodig is om de hypothesen aan te pakken. Elke opstelling van de celkweek; moet echter worden geoptimaliseerd voor nieuwe cellijnen en multiculturen. Vanwege de eigenschappen van de siliciumnitridemembranen kan het bijvoorbeeld nodig zijn om coatingoplossingen aan te passen in vergelijking met weefselkweekplaten. De opname van fibronectine helpt meestal bij celhechting en overleving. Verder zouden gebruikers endotheelcellen en pericyten in tegengestelde richtingen kunnen kweken. In dit geval kan het nodig zijn om bijvoorbeeld de manier waarop de permeabiliteitsmetingen worden uitgevoerd en geïnterpreteerd aan te passen. Het geven van stappen voor dit soort cultuur valt echter buiten het bestek van dit document.
Een andere uitdaging die men kan tegenkomen tijdens celkweek is de snelle verdamping van media, aangezien de apparaten gevoeliger kunnen zijn voor veranderingen in de omgeving in vergelijking met standaard weefselkweekplaten en kolven. Als er overmatige verdamping wordt waargenomen of de celgroei wordt vertraagd, moeten alle kritische incubatorparameters worden gemeten om nauwkeurige instellingen te garanderen. Er kan meer water worden toegevoegd aan de weefseldop of het kleine petrischaaltje dat in de celkweekkamer is geplaatst, of media moeten vaker worden verwisseld. Verder kunnen luchtbellen het onderste kanaal binnendringen en vast komen te zitten in de greppel voor greppel-neerwaartse apparaten. Hoewel ze kunnen worden verwijderd, is het het gemakkelijkst om in de eerste plaats geen bubbels toe te voegen. Om dit te doen, is het belangrijk om te controleren of er geen luchtbellen in de pipetpunt of lucht aan het uiteinde van de pipetpunt zitten voordat u het pipetteermedium in de onderste kamer brengt. Verder kan mediaverdamping in het kanaal leiden tot een opening tussen het mediaoppervlak en de bovenkant van de poort. Een kleine hoeveelheid media kan in de ene poort worden gepipetteerd totdat de media het oppervlak van de tegenoverliggende poort bereikt, waarna de media in die tegenoverliggende poort kunnen worden uitgewisseld. Hoewel hECSR- en E6 + 10% FBS-media niet in het waterbad mogen worden opgewarmd, kunnen andere media worden voorverwarmd om de vorming van luchtbellen te verminderen. Als er toch een luchtbel in de onderste kamer komt, kan deze worden verwijderd door snel 100 μL door het kanaal te pipetteren. Deze methode kan echter leiden tot verontreiniging tussen kamers of media die over het oppervlak van het apparaat worden gemorst. Het kan ook de cellagen verstoren. Als alternatief kunnen de media eerst uit het kanaal worden verwijderd en vervolgens opnieuw worden geïntroduceerd met een volume van 50 μL. Als u echter eerst de media verwijdert, kan dit leiden tot meer luchtbelvorming in het kanaal. Als een luchtbel zich niet direct onder het membraangebied bevindt, kan deze in het kanaal worden achtergelaten zonder effecten op de celkweek.
Aanhechting en groei van pericyten, zoals aangetoond in figuur 2, kan een uitdaging zijn. Het gebruik van een geoptimaliseerde zaaidichtheid is essentieel voor de vorming van een laag met een fysiologisch relevante pericyt-endotheelcelverhouding. Verder, omdat de pericyten gevoelig zijn voor afschuiving, moeten alle media-uitwisselingen in het kanaal zeer langzaam worden gedaan om de cellen te beschermen. Voor BPLC-kweek kan een verbeterde hechting worden bereikt door de onderste kamer te coaten met 800 μg/ml collageen type IV of 100 μg/ml fibronectine.
Immunocytochemie in apparaten die hier worden beschreven, maakt kwalitatieve analyse van de gezondheid en functie van cellen mogelijk. Methoden voor kleuring in weefselkweekplaten of andere platforms moeten direct naar het platform kunnen worden vertaald. Voor celkweek in alleen de bovenste kamer kan PBS na fixatie in de onderste kamer worden toegevoegd en voor de resterende stappen worden gelaten, waarbij blokkering en kleuring alleen in de bovenste kamer worden gedaan. Dit minimaliseert de risico's op het breken van de vliezen of het krijgen van luchtbellen in de onderste kamer. Voor co-cultuur kleuring raden we aan om beide kamers in alle stappen te gebruiken. Het is belangrijk op te merken dat de viscositeit van het fixeermiddel en PBS verschilt van die van media. Het kan dus gemakkelijker zijn om luchtbellen in de onderste kamer toe te voegen en er moet extra aandacht aan worden besteed om pipetpunten aan het uiteinde van de tip op lucht te controleren voordat u in de onderste kamer pipettert.
Het protocol dat is beschreven voor de permeabiliteitstest van kleine moleculen maakt een functionele en kwantitatieve beoordeling mogelijk van de barrièrefunctie van de endotheelcellen die in het μSiM-apparaat zijn gekweekt. Een probleem dat zich tijdens deze test kan voordoen, is het aanzuigen van luchtbellen in de pipet tijdens het nemen van monsters uit het onderste kanaal bij protocolstap 4.1.7.4. Om dit probleem te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de punt in de poort is verzegeld voordat u begint met het verzamelen van monsters en dat het monster niet te snel mag worden afgenomen. Als dat het probleem niet oplost, kan de grootte van de gebruikte tips te klein of te groot zijn om in de poorten te passen; gebruik de tips in de materiaaltabel. Als er onverwacht hoge permeabiliteitswaarden worden gemeten ondanks een gezond ogende confluente monolaag, moet de integriteit van de monolaag tijdens de monsterafname worden gecontroleerd op verstoring. We raden aan om de monolaag altijd direct na het afnemen van het monster onder de microscoop te controleren. Als de monolaag nog intact en gezond lijkt, kan het monster worden gefixeerd en kunnen biologische markers van barrièrefunctie worden beoordeeld, bijvoorbeeld via immunokleuring van de junctie-eiwitten. Omgekeerd is het belangrijk om ervoor te zorgen dat 50 μL media uit het onderste kanaal wordt bemonsterd zonder luchtbellen als er onverwacht lage permeabiliteitswaarden worden gemeten. Als er medium uit de bemonsteringspoort komt zodra de punt van het reservoir is geplaatst, moet dat medium worden opgevangen voordat de pipet in de bemonsteringspoort wordt geplaatst, aangezien het grootste deel van het fluorescerende kleine molecuul aanwezig zal zijn in het initiële volume van 10 μl dat uit het onderste kanaal wordt bemonsterd. Door cirkels rond de poorten te tekenen met een hydrofobe pen of een hydrofobe tape met een gat rond de poort te plaatsen, wordt voorkomen dat passief verpompte media zich verspreiden. Als er tijdens de bemonstering belletjes worden opgezogen of als het volledige monster van 50 μl niet wordt verwijderd, mag het monster niet worden gebruikt. Als alternatief kan het exacte volume worden bepaald en gebruikt in de permeabiliteitsberekening; dit mag echter alleen worden gedaan als het verwijderde volume ≥40 μL is, wat overeenkomt met ~98-99% kleurstofterugwinning34.

Levende weefsels worden gecompartimenteerd door gespecialiseerde cellen die barrières creëren en in stand houden en reguleren welke cellen en moleculen van het ene compartiment naar het andere worden getransporteerd. De onjuiste regulatie van barrièrefuncties kan de bron zijn van zowel acute ziekten als chronische ziekten. De bloed-hersenbarrière (BBB) is de meest beperkende weefselbarrière in het menselijklichaam1. Disfunctie van de BBB ligt ten grondslag aan een breed scala aan ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS), waaronder de ziekte van Alzheimer2, de ziekte van Parkinson3,4 en multiple sclerose 5,6. Letsel aan de BBB is ook gekoppeld aan langdurige cognitieve stoornissen als gevolg van acute aandoeningen, zoals sepsis7, COVID-198 en postoperatief delirium9. De ontwikkeling van geneesmiddelen met het potentieel om hersenaandoeningen te behandelen is frustrerend moeilijk geweest vanwege de uitdaging om opzettelijk de BBB te doorbreken om bioactieve moleculen af te leveren aan doelen in de hersenen10. Om deze redenen zijn methoden om de BBB-functie in vitro te bestuderen van het grootste belang voor het begrip en de behandeling van ziekten van het CZS.
De basismethoden voor het meten van de barrièrefunctie in vitro omvatten het aanbrengen van een monolaag of cocultuur op een semi-permeabel membraan en het meten van de weerstand die cellen geven aan diffusie van kleine moleculen of kleine elektrische stromen11,12,13,14. Hoewel de opkomst van microfysiologische systemen (MPS) een overvloed aan keuzes heeft opgeleverd voor het modelleren van de BBB in 3D15,16, maakt de diversiteit aan systeemgeometrieën het moeilijk om permeabiliteitsmetingen tussen MPS of gevestigde literatuurwaarden te vergelijken. Het vaststellen van betrouwbare basiswaarden is vooral belangrijk in BBB-onderzoek waar, vanwege de uitgebreide barrièreregulatie door vasculaire endotheelcellen in de hersenen, in vitro permeabiliteitswaarden sterk worden onderzocht12,17,18. Om deze redenen zullen permeabiliteitsmetingen over monolagen op 2D-membranen de komende jaren een hoofdbestanddeel blijven van BBB-studies. Dit geldt voor andere weefselbarrières, waaronder epitheliale barrières, waar absolute waarden van baseline permeabiliteit worden gebruikt om in vitro modellen te valideren en te vergelijken 19,20,21.
Met het doel om een waardevol nieuw hulpmiddel voor de BBB-onderzoeksgemeenschap tot stand te brengen, hebben we de afgelopen 5 jaar 22 en 23,24,25,26 het microapparaatmet een siliconm embrane (μSiM)-platform geïntroduceerd voor gebruik bij het modelleren van barrièreweefsel. Het faciliterende kenmerk van het platform is een ultradun (<100 nm dik) membraan met honderden miljoenen nanoporiën 27,28 of een mix van nanoporiën en microporiën29. De vrijstaande membraanchips worden geproduceerd op een silicium 'chip' van 300 μm die de ultradunne structurenstabiliseert 30 en het mogelijk maakt om ze met een pincet te hanteren voor de assemblage van het apparaat. Vanwege hun ultradunne aard hebben de membranen een permeabiliteit die twee ordes van grootte hoger is dan die van conventionele spoorgeëtste membranen die worden gebruikt in commerciële membraankweekapparaten31,32. In de praktijk betekent dit dat de hinder van het membraan voor de diffusie van moleculen kleiner dan de nanoporiën (<60 nm) verwaarloosbaar is33. Voor cellulaire barrières zullen dus alleen de cellen en de matrices die ze afzetten de snelheid bepalen van het transport van kleine moleculen van de apicale naar basale compartimenten die door het membraan worden gescheiden34. Het ontwerp van het apparaat en de ultradunne aard van de membranen bieden ook veel voordelen voor optische microscopie. Deze omvatten 1) de mogelijkheid om levende culturen te volgen met behulp van fasecontrast of helderveldbeeldvorming, 2) de mogelijkheid om fluorescerend te kleuren en in situ te beelden zonder de noodzaak om het membraan te extraheren en over te brengen naar een dekglas, en 3) het feit dat de membranen dunner zijn dan confocale 'plakjes', zodat directe co-culturen een meer natuurlijke afstand tussen celtypen hebben dan kan worden bereikt met 6-10 μm dikke spoorgeëtste membranen.
Onlangs hebben we het platform doorontwikkeld naar een modulair formaat om snelle montage34 en maatwerk35,36 mogelijk te maken. We hebben het modulaire formaat gebruikt om apparaatcomponenten te distribueren tussen onze bio-engineering en samenwerkende hersenbarrièrelaboratoria. Vervolgens ontwikkelden we gezamenlijk protocollen voor apparaatassemblage, monocultuur en co-cultuur, immunofluorescerende kleuring en permeabiliteit van kleine moleculen en toonden we aan dat deze methoden reproduceerbaar waren tussen laboratoria. Met behulp van deze protocollen toonden we ook aan dat het modulaire platform een gevalideerde BBB ondersteunt die is ontwikkeld met behulp van de uitgebreide endotheelkweekmethode (EECM) voor het creëren van microvasculaire-achtige endotheelcellen (BMEC) in de hersenen uit door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)37. Het doel van dit rapport is om deze methoden nader te bekijken en met behulp van de bijbehorende video een bredere acceptatie van het platform in de BBB-community mogelijk te maken.

<table><tbody><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD31 polyklonaal antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PA5-32321</td><td></td></tr><tr><td>Claudin-5 muis IgG antilichaam, 4C3C2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35-2500</td><td></td></tr><tr><td>Geit &alpha;-Muis IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Geit &alpha;-Konijn IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>NG2, muis IgG2a, 9.2.27</td><td>Millipore</td><td>&nbsp;MAB2029</td><td></td></tr><tr><td>Occludin muis IgG antilichaam, OC-3F10</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>33-1500</td><td></td></tr><tr><td>PDGFR&beta;, konijn IgG antilichaam, 28E1</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3169</td><td></td></tr><tr><td>VE-cadherin muis IgG2B Clone # 123413</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB9381</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 konijn IgG antilichaam, polyklonaal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>40-2200</td><td></td></tr><tr><td>Chemicaliën, peptiden en recombinante eiwitten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Methanol</td><td>VWR</td><td>101443-718</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>Collageen IV uit menselijke placenta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>Collageen, Type I oplossing uit rattenstaart</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3867-1VL</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&rsquo;s F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 Endotheelcelgroeimedium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Peak Serum</td><td>PS-FB1</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine uit bovien plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine, humaan eiwit, plasma</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>hESFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11111044</td><td></td></tr><tr><td>Lucifer Yellow CH dilithiumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861502</td><td></td></tr><tr><td>Normaal geitenserum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>500627</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>PBS zonder calcium, magnesium</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.01</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>Pericyte Medium</td><td>ScienCell</td><td>1201</td><td>Gebruik compleet kit (inclusief supplementen)</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine, 10 mg/mL</td><td>ScienCell</td><td>0413</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>JT Baker</td><td>X198-05</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-vrij gedestilleerd water</td><td>Invitrogen&trade;</td><td>10977015</td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>Experimentele modellen: Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloed-hersenbarrière hCMEC/D3-cellijn</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>Vasculaire pericyten uit menselijk brein</td><td>ScienCell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>iPS(IMR90)-4 humane geïnduceerde pluripotente stamcellen</td><td>WiCell</td><td>RRID:CVCL_C437</td><td></td></tr><tr><td>Glaswerk en kunststofwerk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 mm TC-behandelde celkweekschaal met 20 mm raster</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>Klemmen</td><td>VWR</td><td>MFLX06832-10</td><td></td></tr><tr><td>Corning weefselkweekplaten (6-well)</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Vlakke 96-well niet-bindende microplaten</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglashouder</td><td>&nbsp;SiMPore</td><td>USIM-SB</td><td>Afmetingen compatibel met microscoopglashouders</td></tr><tr><td>Nunc 15 mL conische steriele polypropyleen centrifugebuizen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 50 mL conische steriele polypropyleen centrifugebuizen</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>339653</td><td>Buisdoppen kunnen worden gevuld met water voor celkweek</td></tr><tr><td>P20-200 pipettenpunten</td><td>VWR</td><td>76322-516</td><td>Alternatieve merken sluiten mogelijk niet zo effectief in poorten</td></tr><tr><td>Transwell-filters (12 well, 12 mm, 0,4 &mu;m poriegrootte, PC)</td><td>CoStar</td><td>3401</td><td></td></tr><tr><td>Instrumenten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10X Objectief (voor Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD00105</td><td>Lucht; WD: 4 mm; NA 0,45</td></tr><tr><td>10X Objectief (voor Nikon)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRP40102</td><td>Lucht; WD: 6,2 mm; NA 0,25</td></tr><tr><td>40X Objectief (LWD) (voor Andor)</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>MRD77410</td><td>Waterimmersie; WD: 590-610 mm; NA 1,15</td></tr><tr><td>Andor Spinning Disc Confocal-microscoop</td><td>Oxford Instruments, Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ts2 Fase Contrast Microscoop</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>TECAN Infinite M200</td><td>TECAN</td><td></td><td>Kan worden vervangen door vergelijkbare producten</td></tr><tr><td>Overige</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced PAP Pen</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z672548</td><td>2 mm tip wordt aanbevolen</td></tr><tr><td>Montagekit met armaturen</td><td>SiMPore</td><td>USIM-JIGSET</td><td>Inclusief armatuur A1, A2, B1 en B2</td></tr><tr><td>Cameraadapter voor

gebruik van het microsim (μsim) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

De microSiM (μSiM) is een op membraan gebaseerd kweekplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière (BBB). In tegenstelling tot conventionele op membranen gebaseerde platforms, biedt de μSiM experimentalisten nieuwe mogelijkheden, waaronder beeldvorming van levende cellen, ongehinderde paracriene signalering tussen 'bloed'- en 'hersen'-kamers, en de mogelijkheid om immunofluorescentie direct in beeld te brengen zonder de noodzaak van extractie/hermontage van membranen. Hier demonstreren we het basisgebruik van het platform om monocultuur (endotheelcellen) en co-cultuur (endotheelcellen en pericyten) modellen van de BBB op te zetten met behulp van ultradunne nanoporeuze siliciumnitridemembranen. We tonen compatibiliteit aan met zowel primaire celculturen als humane geïnduceerde pluripotente stamcelculturen (hiPSC). We bieden methoden voor kwalitatieve analyse van BBB-modellen via immunofluorescentiekleuring en demonstreren het gebruik van de μSiM voor de kwantitatieve beoordeling van de barrièrefunctie in een permeabiliteitstest van kleine moleculen. De aangeboden methoden moeten gebruikers in staat stellen hun barrièremodellen op het platform vast te stellen, waardoor het gebruik van weefselchiptechnologie voor het bestuderen van menselijke weefsels wordt bevorderd.

De montage van een sleuf is weergegeven in figuur 1. De armaturen begeleiden de assemblage van de componenten en de membraanchip. Component 1 is voornamelijk acryl met een PSA-oppervlak voor hechting aan de chip en een opening naar de onderste kamer en poorten voor pipettoegang tot de onderste kamer. Component 2 is de kanaallaag en bevat rechtsboven een niet-klevende, PSA-vrije "driehoek" om vast te pakken. Trench-down-apparaten bieden een vlak celkweekgebied in de bovenste kamer, terwijl trench-up-apparaten een plat oppervlak hebben voor celkweek in de onderste kamer.
We voerden endotheliale monoculturen en co-culturen uit van hCMEC/D3 en HBVP's en van hiPSC IMR90-4-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen en BPLC's en verkregen fasebeelden met behulp van een Nikon Eclipse Ts2 fasecontrastmicroscoop en 10x objectief (Figuur 2). Optimale zaaidichtheden voor primaire celkweek worden getoond (foto's genomen 1 dag na het zaaien), evenals ondergezaaide HBVP's (Figuur 2A). Definitieve beelden van de cocultuur- en monocultuurfase (6 dagen endotheelcelkweek) kunnen moeilijk te onderscheiden zijn (Figuur 2C), en bevestiging van succesvolle co-cultuur van primaire cellen kan immunofluorescentiekleuring vereisen (zie protocolsectie 3). Lage, hoge en optimale hiPSC-afgeleide BPLC-zaaidichtheden worden ook geïllustreerd (Figuur 2B). hiPSC-afgeleide co-cultuur is duidelijker te onderscheiden in fasecontrastbeeldvorming in vergelijking met primaire co-culturen (Figuur 2D). Lage BPLC-seeding resulteert in een slechte pericytendekking en perocytenklontering, terwijl doorzaaien resulteert in het afbladderen van de pericytlaag van het membraan. Verder kan het te snel verwisselen van het medium in de onderste kamer leiden tot pericytenverlies, omdat deze cellen erg gevoelig zijn voor afschuiving. Optimale dekking door pericyten is ~90% voor een BBB-model, zonder openingen in de endotheellaag.
Representatieve beelden van immunogekleurde hiPSC-afgeleide cocultuur worden geïllustreerd in figuur 3 (6 dagen endotheelcelkweek). IMR90-4-afgeleide BPLC's werden gekleurd voor de pericytmarker PDGFRβ, en IMR90-4-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen werden gekleurd voor de adherens-junctiemarker VE-cadherine. Hoechst werd gebruikt om de kernen te kleuren. De beelden werden verkregen op een confocale microscoop van een draaiende schijf met behulp van een 40x LWD-objectief met plakjes van 0,2 μm en verwerkt met Imaris. Beide cellagen kunnen worden gevisualiseerd, ook al is het dunne nanomembraan niet te zien.
We voerden de op bemonstering gebaseerde permeabiliteitstest van kleine moleculen uit onder dezelfde experimentele omstandigheden in twee fysiek van elkaar verwijderde laboratoria aan de Universiteit van Bern, Zwitserland, en de Universiteit van Rochester, NY, VS om de reproduceerbaarheid van resultaten tussen laboratoria aan te tonen (Figuur 4)34. hiPSC IMR90-4-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen werden gedurende 2, 4 of 6 dagen in het μSiM-apparaat gekweekt en gedurende 6 dagen op transwellfilters. De test werd uitgevoerd met 150 μg/ml Lucifer Yellow (457 Da) in beide laboratoria. Hoge variabiliteit in de permeabiliteit van de endotheelcellen die gedurende 2 dagen in het apparaat zijn gekweekt, geeft aan dat 2 dagen kweek onvoldoende was voor barrièrerijping. Er waren geen significante verschillen in permeabiliteit tussen de laboratoria bij barrièrerijping - vanaf 4 dagen. We toonden ook aan dat de permeabiliteit van de endotheelcellen die gedurende 6 dagen in μSiM- en transwellfilters werden gekweekt, overeenkwam met de eerder gepubliceerde40.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig01.jpg"> Figuur 1: Stappen van μSiM-assemblage . (A) Bereid de chip voor door deze op armatuur A1 te plaatsen. Plaats de spaansleuf omhoog voor een laatste sleuf-neerwaarts apparaat. Plaats de spaansleuf naar beneden voor een laatste sleufinrichting. (B) Bind component 1 aan de chip door de beschermende maskers van component 1 te verwijderen en deze met de voorkant naar beneden in FA1 te plaatsen. Verlijm door druk uit te oefenen met armatuur A2. (C) Bind component 2 en component 1 door component 2 van de plaat te verwijderen en de bovenste beschermlagen af te pellen. Plaats het kanaal omhoog in armatuur B1 en plaats component 1 met de voorkant naar boven op component 2. Lijm door druk uit te oefenen met armatuur B2. Afkortingen: FAn = armatuur An; FBn = armatuur Bn. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig02.jpg"> Figuur 2: Schema van cocultuur en representatieve fasecontrastbeelden van celkweek in apparaten. (A) Locatie van pericyten en endotheelcellen. (B) Zijaanzichtschema van cellocaties over de sleuf van de membraanchip. (C) Representatieve beelden van lage en optimale zaaidichtheden voor primaire HBVP- en hCMEC/D3-endotheelcellijn in de hersenen. Beelden werden verkregen 1 dag na het zaaien (HBVP) en 2 uur na het zaaien (hCMEC/D3). (D) Representatieve beelden van lage, hoge en optimale zaaidichtheden voor hiPSC-afgeleide pericytachtige cellen in de hersenen. De beelden zijn 1 dag na het zaaien verkregen. (E) Representatieve beelden van de uiteindelijke HBVP- en hCMEC/D3-cocultuur en hCMEC/D3-monocultuur. De beelden werden verkregen 8 dagen na het zaaien van HBVP en 7 dagen na het zaaien van hCMEC/D3. (F) Representatieve beelden van mislukte en succesvolle BPLC- en EECM-BMEC-achtige celcocultuur en EECM-BMEC-achtige celmonocultuur. De beelden werden verkregen 7 dagen na het zaaien van BPLC en 6 dagen na het zaaien van EECM-BMEC. Ondergezaaide BPLC-culturen hebben onvoldoende dekking, terwijl doorzaaiende BPLC-culturen overvloeiend zullen worden en zullen gaan klonteren/terugtrekken. Schaalbalken = 100 μm (CF). Afkortingen: HBVP's = human brain vascular pericytes; hiPSC = humaan geïnduceerde pluripotente stamcel; BPLC's = hiPSC-afgeleide pericytachtige cellen in de hersenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve beelden van immuno-gekleurde hiPSC-afgeleide celcocultuur in apparaten. Cellen werden gekleurd voor endotheelcelmarker VE-cadherine (groen), pericytmarker PDGFRβ (rood) en nucleaire kleuring (blauw). Twee lagen cellen zijn dicht bij elkaar te zien, alleen gescheiden door een dun siliciumnitride nanomembraan (witte pijl markeert de locatie van het membraan op de linkerafbeelding). Schaalbalk = 50 μm. Afkortingen: hiPSC = humaan geïnduceerde pluripotente stamcel; PDGFRβ = van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor bèta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65258/65258fig04.jpg"> Figuur 4: Op bemonstering gebaseerde permeabiliteitstest van kleine moleculen . (A) Schema van de experimentele workflow. (B) Demonstratie van de reproduceerbaarheid tussen twee fysiek van elkaar verwijderde laboratoria aan de Universiteit van Bern (UniBe), Zwitserland, en de Universiteit van Rochester (UR), NY, VS: van hiPSC afgeleide endotheelcellen werden gedurende 2, 4 of 6 dagen gekweekt in het μSiM-apparaat en gedurende 6 dagen in transwellfilters. De permeabiliteitstest werd uitgevoerd met behulp van 150 μg/ml Lucifergeel (457 Da). De rode balk geeft de eerder gepubliceerde permeabiliteitsgegevens van natriumfluoresceïne (376 Da) aan van dezelfde hiPSC-afgeleide endotheelcellen die gedurende 6 dagen in transwellfilters zijn gekweekt40. N = 4-16 per groep. Er werd gebruik gemaakt van tweerichtings-ANOVA met Tukey's post-hoctest en vergelijkingen werden alleen weergegeven voor relevante p < 0,05. (C) Demonstratie van cytokinerespons met behulp van hiPSC-afgeleide EECM-BMEC-achtige cellen die gedurende 2 dagen in de μSiM zijn gekweekt; 0,1 ng/ml TNFα + 2 IE/ml IFNγ) of mediacontrole (niet-gestimuleerd, NS) werd gedurende 20 uur aan de bovenste kamer toegevoegd voorafgaand aan de permeabiliteitstest met behulp van 150 μg/ml Lucifer Yellow. N = 3 per groep. T-toets van de student, p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bovenste kamer zaaioppervlak</td>
			<td>Top Well Volume</td>
			<td>Bodemkamer Zaaioppervlak</td>
			<td>Volume onderste kanaal</td>
		</tr><tr><td>~37 mm2</td>
			<td>100 μL (kan ≥115 μL bevatten)</td>
			<td>~42 mm2</td>
			<td>10 μL (pipette 20 μL om luchtbellen te voorkomen)</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Kritische μSiM-oppervlakte en -volumes.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Doel</td>
			<td>Fixative</td>
			<td>Blokkerende oplossing</td>
			<td>Verdunning</td>
		</tr><tr><td>VE-cadherine</td>
			<td>4% PFA of 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,4% Tx-100 of 10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>4% PFA of 100% MeOH</td>
			<td>5% GS + 0,3-0,4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Claudin-5</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>ZO-1</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Occludine</td>
			<td>100% MeOH</td>
			<td>5-10% GS + 0,3% Triton X-100</td>
			<td>1:50</td>
		</tr><tr><td>PDGFRβ</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>NG2</td>
			<td>4% PFA</td>
			<td>5% GS + 0.4% Triton X-100</td>
			<td>1:100</td>
		</tr><tr><td>Geit α-muis IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr><tr><td>Geit α-muis IgG Alexa Fluor 568</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1:200</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Antilichamen en kleuringsmethoden gevalideerd voor co-cultuur immunocytochemie in μSiM-apparaten. Afkortingen: PFA = paraformaldehyde; MeOH = methanol; GS = geiten serum.
Aanvullend bestand 1: Sjabloon voor de berekening van de permeabiliteitswaarde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65258/65258_SupplementalFile_SamplingCalcTemplate_Updated.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit rapport biedt protocollen voor assemblage, celkweek en assays op het μSiM-platform voor de constructie van bloed-hersenbarrièremodellen.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

We ontwikkelen een weefsel GI-model van de bloed-hersenbarrière om de impact van sepsis op de hersenen en de bijdrage van door bloed overgedragen factoren te begrijpen. Met behulp van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen. We zijn van plan om de bijdrage van genetische factoren aan de gevoeligheid van bepaalde patiëntenpopulaties te evalueren.De huidige experimentele uitdagingen binnen de weefselchipgemeenschap zijn de reproduceerbaarheid van resultaten en de adoptie van technieken door externe laboratoria. Unieke ontwerpen van weefselchips, kleine volumes in weefselchips en het ontbreken van standaard functionele assays dragen allemaal bij aan deze uitdagingen en beperken gebruikers vaak tot fluorescerende assays als hun primaire output. Micro simm-apparaten bieden modulariteit voor veelzijdige in vitro modellering, een glazen lichtoppervlak dat ideaal is voor lifestyle-beeldvorming met hoge resolutie en ultra syn 100 nanometer, sterk geproduceerd nanomembraan, wat zorgt voor naadloze overspraak van oplosbare factoren en nauwkeurige permeabiliteitstests.Met de microsimulatie hebben we gezien dat specifieke celtypen de neiging hebben om meer van de matrixeiwitten te produceren die een ondersteunende steiger rond de bloedvaten van de hersenen vormen. Nu kunnen we ons afvragen of ontsteking ervoor zorgt dat dezelfde cellen hun matrices versterken of afbreken, waardoor de integriteit van de barrière verandert. In de toekomst zullen we nog een compartiment aan het model toevoegen met groene cellen zoals astrocyten en microglia om te bestuderen hoe die cellen interageren met de bloed-hersenbarrière in gevallen van systemische ontsteking zoals sepsis.We zijn ook van plan om aanvullende oorzaken van systemische ontsteking te onderzoeken, zoals postoperatief delirium, bovenop dementie.

use-microsim-sim-barrier-tissue-platform-for-modeling-blood-brain

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.

Genereren van een geïmmortaliseerde Murine Brain microvasculaire endotheliale cellijn als<em&gt; In Vitro</em&gt; Blood Brain Barrier Model

Oprichting van menselijke modellen van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​kan profiteren onderzoek naar hersenen voorwaarden in verband met BBB mislukking. We beschrijven hier een verbeterde techniek voor de bereiding van een contact BBB model dat coculturing menselijke astrocyten en brein endotheelcellen maakt aan de tegenovergestelde zijden van een poreus membraan.

Verbeterde werkwijze voor de bereiding van een Human-Cell gebaseerde, Contact Model van de bloed-hersenbarrière

Het doel van deze studie was om de reproduceerbaarheid van een in vitro BBB model met een syngene ratten co-kweek van endotheelcellen en astrocyten valideren. De endotheelcellen monolaag gepresenteerd hoge TEER en lage LY permeabiliteit. Expressie van specifieke eiwitten TJ, functionele reacties op ontstekingen en functionaliteit van vervoerders en receptoren werden beoordeeld.

Oprichting van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van Rat bloed-hersenbarrière (BBB): een focus op BBB Ondoordringbaarheid en receptor-gemedieerd transport

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Het doel van het protocol is te presenteren van een geoptimaliseerde procedure tot vaststelling van een in vitro bloed - hersenbarrière (BBB) model gebaseerd op primaire varkens endothelial hersencellen (pBECs). Het model toont hoge reproduceerbaarheid, hoge dichtheid, en is geschikt voor studies van vervoer en intracellulaire drugontdekking mensenhandel.

Verbeterde methode voor de vaststelling van een In Vitro bloed - hersenbarrière Model gebaseerd op varkens Endothelial hersencellen

Geïsoleerde hersenen haarvaten van menselijk hersenweefsel kunnen worden gebruikt als een preklinische model om te studeren barrièrefunctie fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Hier presenteren we een geoptimaliseerde protocol om te isoleren van de hersenen haarvaten van verse menselijk hersenweefsel.

Isolatie van cerebrale haarvaten van verse menselijk hersenweefsel

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de instelling van een in gnudles BBB (bloed-hersenbarrière)-Minibrain polyester poreuze membraan cultuur invoegen systeem teneinde het vervoer van biomoleculen of infectieuze agentia via een menselijke BBB en hun fysiologische effect op de naburige hersencellen.

Een Model Interface menselijke Blood-Brain barrière kruisingen door ziekteverwekkers of geneesmiddelen en hun interacties met de hersenen bestuderen

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een meercellige neurovasculaire eenheid die hersenhomeostase strak regugugaat. Door menselijke iPSCs en organ-on-chip technologieën te combineren, hebben we een gepersonaliseerde BBB-chip gegenereerd, geschikt voor ziektemodellering en CNS-voorspellingen voor medicijndoordring. Een gedetailleerd protocol wordt beschreven voor de productie en werking van de BBB-chip.

Generatie van een menselijke iPSC-gebaseerde bloed-hersenbarrière chip

Dit protocol beschrijft een methode om een menselijk bloed-hersenbarrière (BBB) in vitro model vast te stellen. De endotheelcellen en pericyten worden aan elke kant van een insertfilter (bloedcompartiment) gezaaid en astrocyten worden in de onderste put (hersencompartiment) gezaaid. Het gekarakteriseerde model werd gebruikt voor nanodeeltjestransportexperimenten.

Een drievoudig kweekcelsysteem dat de menselijke bloed-hersenbarrière modelleert

De bloed-hersenbarrière (BBB) speelt een cruciale rol bij het in stand houden van een stabiele en gezonde hersenomgeving. BBB-disfunctie wordt in verband gebracht met veel neurologische aandoeningen. We hebben een 3D, stamcel-afgeleid model van de BBB ontwikkeld om cerebrovasculaire pathologie, BBB-integriteit te onderzoeken en hoe de BBB wordt veranderd door genetica en ziekte.

Reconstructie van de bloed-hersenbarrière in vitro om neurologische aandoeningen te modelleren en therapeutisch aan te pakken

Dit protocol beschrijft een herconfigureerbaar, op membraan gebaseerd celkweekplatform dat het open-well-formaat integreert met vloeistofstroommogelijkheden. Dit platform is compatibel met standaardprotocollen en maakt omkeerbare overgangen mogelijk tussen open-well en microfluïdische kweekmodi, om tegemoet te komen aan de behoeften van zowel technische als biowetenschappelijke laboratoria.

Statische barrièreweefselmodellen transformeren in dynamische microfysiologische systemen

Verken het MicroSiM barrièreweefselplatform voor modellering van de bloed-hersenbarrière met menselijke iPSC-cellen. Deze methode onderzoekt hoe systemische ontsteking de barrièreintegriteit beïnvloedt.

Gebruik van het MicroSiM (μSiM) barrièreweefselplatform voor het modelleren van de bloed-hersenbarrière

Meer video's verkennen