Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen
3 november 2023
Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.
Ons laboratorium werkt aan het begrijpen, voorkomen en omkeren van bètaceldisfunctie en andere ooglidafwijkingen bij diabetes type één en type twee. Onze studies richten zich op de pathogenese van menselijke diabetes door studies van de menselijke alvleesklier en ooglidbiologie en gezondheid en ziekte te integreren. Menselijke oogjes zijn 3D-bolvormige structuren en toegang tot cellen in het hele oogje brengt enkele experimentele uitdagingen met zich mee.
Bij het introduceren van biosensoren om oogcelsignalering te begrijpen, overwint ons pseudo-ooglidprotocol deze uitdaging bijvoorbeeld door genetische manipulaties uit te voeren in de toestand van één cel en deze getransduceerde menselijke oogcellen samen te voegen tot pseudo-oogleden voor stroomafwaartse studies. Ons pseudo-ooglidsysteem stelt ons in staat om biosensoren door het hele oogje uit te drukken, in plaats van alleen het ooglidoppervlak. In combinatie met onze live cell imaging en Microperfusion System kunnen we dynamische intracellulaire processen meten en co-registreren met stroomafwaartse hormoonsecretie.
Dit protocol kan worden toegepast om een verscheidenheid aan belangrijke wetenschappelijke vragen te beantwoorden. Gen-uitschakelingsstrategieën kunnen bijvoorbeeld worden gecombineerd met deze benadering om de impact van een gen van belang op de ooglidfunctie en de bijbehorende signaalroutes te begrijpen, hetzij wereldwijd, hetzij op een zelfspecifieke manier.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op bètacelfunctiestoornissen en eilandjesabnormaliteiten bij diabetes, waarbij gebruik wordt gemaakt van een pseudoeilandjesmodel voor de synchrone acquisitie van cellulaire signalering en hormoonsecretie. De methode maakt gebruik van adenovirale aflevering van een cAMP-biosensor en een microperfusiesysteem om dynamische analyse van insuline- en glucagonresponsen mogelijk te maken.
Belangrijkste Onderdelen van de Studie
Onderzoeksgebied
- Diabetes type 1 en type 2
- Biologie van menselijke eilandjes van Langerhans
- Cel-signaleringsdynamiek
Achtergrond
- Menselijke eilandjes zijn sferische structuren die experimentele uitdagingen met zich meebrengen.
- Het pseudoeilandjes-protocol lost deze uitdagingen op voor een effectieve introductie van biosensoren.
- Het begrijpen van de signalering van eilandjes is cruciaal voor diabetesonderzoek.
Gebruikte methoden
- Adenovirale aflevering voor biosensorexpressie
- Primair menselijk pseudoisletmodel
- Microperfusiesysteem voor de meting van hormoonsecretie
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle co-registratie van intracellulaire signalering en hormoonafgifte.
- Maakte analyse mogelijk van de effecten van gene silencing op de eilandjesfunctie.
- Dynamische monitoring van secretierespons in real-time.
Conclusies
- Deze studie biedt een robuust protocol voor het onderzoeken van de hormoonsignalering in eilandjes van Langerhans.
- Het heeft belangrijke implicaties voor het begrijpen van de biologie van deze eilandjes bij diabetes.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Managers
Het menselijke pseudoeilandjes-systeem maakt synchrone, kwantitatieve beoordeling mogelijk van intracellulaire signalering en hormoonsecretie in primaire menselijke eilandjescellen, waarmee een kritiek knelpunt in de validatie van diabetes-doelwitten wordt weggenomen. Door genetische manipulatie en de integratie van biosensoren in de gehele 3D-eilandjesstructuur mogelijk te maken, verhoogt dit platform de voorspellende betrouwbaarheid in mechanistische studies en ondersteunt het risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen in het onderzoek naar metabole ziekten. De integratie van live-cell imaging en microperfusieworkflows positioneert het als een herbruikbare capaciteit voor vroege ontdekkingsfasen en translationele onderzoekspijplijnen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door intracellulaire signalering te koppelen aan hormoonsecretie in menselijke eilandcellen.
- Faciliteert biologische risicoreductie via gene-silencing of biosensorgebaseerde verduidelijking van signaalpaden in een fysiologisch relevante 3D-context.
- Ondersteunt het voorspellende vertrouwen en de functionele targetvalidatie voor programma's gericht op diabetes en metabole ziekten.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde pseudoislet-systemen voor voor downstream compound-screening en mechanistische assays.
- Standaardiseert assay-condities voor reproduceerbare, kwantitatieve meting van hormoonsecretie en biosensordynamiek.
- Maakt schaalbare, gemultiplexte evaluatie van kandidaat-interventies mogelijk in een mens-relevant model.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt in vitro bevindingen in lijn met ziekterelevante menselijke eilandjesbiologie voor de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door mechanistische risicoreductie in primair menselijk weefsel mogelijk te maken.
- Ondersteunt besluitvorming bij risico-gecorrigeerde voortgang door functionele en signaleringsmetingen te integreren.
Pijplijn- & workflowintegratie
Dit systeem slaat een brug tussen vroege ontdekking, targetvalidatie en preklinisch onderzoek door hypothese-gedreven analyse van eilandjesignalering en -functie in één enkele workflow mogelijk te maken.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt het testen van mechanistische hypothesen en het verduidelijken van signaalpaden via synchrone biosensor- en hormoonmetingen.
- Screening: Levert assay-klare, reproduceerbare pseudoislet-modellen voor kwantitatieve evaluatie van interventies.
- Analytiek: Biedt dynamische, kwantitatieve metingen van cAMP-signalering en hormoonsecretie voor een robuuste vergelijking van condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro mechanistische inzichten met de biologie van menselijke ziekten, ter ondersteuning van biomarker-afstemming.
- Bedrijfsbrede hergebruikbaarheid: Biedt een gestandaardiseerd, aanpasbaar platform voor herhaaldelijk gebruik in ontdekkingsprogramma's voor metabole ziekten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van diabetes-doelen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van functionele eilandjes-assays.
- Strategische waarde: Verbetert de kwaliteit van go/no-go-beslissingen en de kapitaalefficiëntie door de integratie van functionele gegevens en signaleringsgegevens.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van activa voor metabole ziekten mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in menselijke eilandjes-isolatie, genetische manipulatie en live-cell imaging.
- Vereist toegang tot confocale microscopie, microperfusiesystemen en kwantitatieve hormoonanalyse.
- Noodzaak tot cross-team standaardisatie van de bereiding van pseudoeilandjes en assay-protocollen.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende donorbronnen of ziekte modellen.
- Doorvoersnelheid en schaalbaarheid zijn beperkt door de beschikbaarheid van primair weefsel en de technische complexiteit.
