Name: Onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-14T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: Leer een pomploos fluïdisch systeem voor real-time metabole analyse van oogweefsels, inclusief retina en RPE-cellen. Deze methode meet betrouwbaar zuurstofverbruik en lactaatproductie voor onderzoek naar retinale ziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door subsidies van de National Institutes of Health (R01 GM148741 I.R.S.), U01 EY034591, R01 EY034364, BrightFocus Foundation, Research to Prevent Blindness (J.R.C.) en R01 EY006641, R01 EY017863 en R21 EY032597 (J.B.H.).

Pomploze meerkanaals flowcultuur om weefsels en cellen te onderhouden en te beoordelen

<ol><li>Lacy, P. E., Walker, M. M., Fink, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perifusion+of+isolated+rat+islets+in+vitro%3A+Participation+of+the+microtubular+system+in+the+biphasic+release+of+insulin%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Perifusion of isolated rat islets in vitro: Participation of the microtubular system in the biphasic release of insulin.</a> Diabetes. 21 (10), 987-998 (1972).</li>
<li>Doliba, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+ionic+coupling+factors+in+amino+acid-stimulated+insulin+release+in+pancreatic+beta-HC9+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Metabolic and ionic coupling factors in amino acid-stimulated insulin release in pancreatic beta-HC9 cells.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (6), E1507-E1519 (2007).</li>
<li>Sweet, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ATP%2FADP+in+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulation of ATP/ADP in pancreatic islets.</a> Diabetes. 53 (2), 401-409 (2004).</li>
<li>Chertov, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+glucose+in+photoreceptor+survival%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Roles of glucose in photoreceptor survival.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34700-34711 (2011).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Bisbach, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+Can+Shuttle+Reducing+Power+from+the+Hypoxic+Retina+to+the+O2-Rich+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate Can Shuttle Reducing Power from the Hypoxic Retina to the O2-Rich Pigment Epithelium.</a> Cell Reports. 31 (5), 107606(2020).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitochondrial+pyruvate+transport+by+zaprinast+causes+massive+accumulation+of+aspartate+at+the+expense+of+glutamate+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitochondrial pyruvate transport by zaprinast causes massive accumulation of aspartate at the expense of glutamate in the retina.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (50), 36129-36140 (2013).</li>
<li>Hass, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Succinate+metabolism+in+the+retinal+pigment+epithelium+uncouples+respiration+from+ATP+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Succinate metabolism in the retinal pigment epithelium uncouples respiration from ATP synthesis.</a> Cell Reports. 39 (10), 110917(2022).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluidics+system+for+resolving+concentration-dependent+effects+of+dissolved+gases+on+tissue+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Fluidics system for resolving concentration-dependent effects of dissolved gases on tissue metabolism.</a> Elife. 10, e66716(2021).</li>
<li>Stryer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStryer%2C+L+%22Biochemistry%22">Biochemistry</a>. , 4th edn, Freeman and Company, New York. (1995).</li>
<li>Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+respiration+in+adherent+cells+by+Seahorse+XF96+Cell+Mito+Stress+Test%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100245(2021).</li>
<li>Engel, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+dysfunction+in+Sorsby+patient-derived+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix dysfunction in Sorsby patient-derived retinal pigment epithelium.</a> Experimental Eye Research. 215, 108899(2022).</li>
<li>Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Mitochondrial+Respiration+Impairs+Nutrient+Consumption+and+Metabolite+Transport+in+Human+Retinal+Pigment+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Mitochondrial Respiration Impairs Nutrient Consumption and Metabolite Transport in Human Retinal Pigment Epithelium.</a> Journal of Proteome Research. 20 (1), 909-922 (2021).</li>
<li>Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retina+Metabolism+and+Metabolism+in+the+Pigmented+Epithelium%3A+A+Busy+Intersection%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Vision+Science%22%5BJournal%5D)">Retina Metabolism and Metabolism in the Pigmented Epithelium: A Busy Intersection.</a> Annual Review of Vision Science. 7, 665-692 (2021).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+and+photoreceptor+survival+in+retinal+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation and photoreceptor survival in retinal detachment.</a> Experimental Eye Research. 205, 108492(2021).</li>
<li>Okawa, H., Sampath, A. P., Laughlin, S. B., Fain, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+consumption+by+mammalian+rod+photoreceptors+in+darkness+and+in+light%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ATP consumption by mammalian rod photoreceptors in darkness and in light.</a> Current Biology. 18 (24), 1917-1921 (2008).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">The cell biology of the retinal pigment epithelium.</a> Progress in Retinal and Eye Research. , 100846(2020).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+strategies+of+engineering+retinal+organoids+and+organoid-on-a-chip+in+modeling+intraocular+drug+delivery%3A+Current+progress+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Emerging strategies of engineering retinal organoids and organoid-on-a-chip in modeling intraocular drug delivery: Current progress and future perspectives.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 197, 114842(2023).</li>
<li>Arjamaa, O., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-dependent+diseases+in+the+retina%3A+role+of+hypoxia-inducible+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Oxygen-dependent diseases in the retina: role of hypoxia-inducible factors.</a> Experimental Eye Research. 83 (3), 473-483 (2006).</li>
<li>Kamat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Multi-Channel+Fluidics+System+for+the+Maintenance+and+Real-Time+Metabolic+and+Functional+Assessment+of+Tissue+or+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods.+In+Press%22%5BJournal%5D)">A Versatile Multi-Channel Fluidics System for the Maintenance and Real-Time Metabolic and Functional Assessment of Tissue or Cells.</a> Cell Reports Methods. In Press. , (2023).</li>
<li>Neal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Low-Level+Drug+Effects+Using+Real-Time%2C+in+vitro+Measurement+of+Oxygen+Consumption+Rate%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Low-Level Drug Effects Using Real-Time, in vitro Measurement of Oxygen Consumption Rate.</a> Toxicological Sciences. 148 (2), 594-602 (2015).</li>
<li>Jung, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+cytochrome+C+is+an+essential+regulator+of+sustained+insulin+secretion+by+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reduced cytochrome C is an essential regulator of sustained insulin secretion by pancreatic islets.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (20), 17422-17434 (2011).</li>
<li>Rountree, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+insulin+secretion+by+cytochrome+C+and+calcium+signaling+in+islets+with+impaired+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Control of insulin secretion by cytochrome C and calcium signaling in islets with impaired metabolism.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289 (27), 19110-19119 (2014).</li>
<li>Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Benchorin, G., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+measuring+extracellular+flux+from+intact+polarized+epithelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Method for measuring extracellular flux from intact polarized epithelial monolayers.</a> Molecular Vision. 24, 425-433 (2018).</li>
<li>Jarrett, S. G., Rohrer, B., Perron, N. R., Beeson, C., Boulton, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+mitochondrial+damage+in+retinal+cells+and+tissues+using+quantitative+polymerase+chain+reaction+for+mitochondrial+DNA+damage+and+extracellular+flux+assay+for+mitochondrial+respiration+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Assessment of mitochondrial damage in retinal cells and tissues using quantitative polymerase chain reaction for mitochondrial DNA damage and extracellular flux assay for mitochondrial respiration activity.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 227-243 (2013).</li>
<li>Perron, N. R., Beeson, C., Rohrer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+alterations+in+mitochondrial+reserve+capacity%3B+a+means+to+predict+subsequent+photoreceptor+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioenergetics+and+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Early alterations in mitochondrial reserve capacity; a means to predict subsequent photoreceptor cell death.</a> Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 45 (1-2), 101-109 (2013).</li>
<li>Cabrera, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-throughput+assays+for+evaluation+of+human+pancreatic+islet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">high-throughput assays for evaluation of human pancreatic islet function.</a> Cell Transplantation. 16 (10), 1039-1048 (2008).</li>
<li>Doliba, N. M., Qin, W., Vinogradov, S. A., Wilson, D. F., Matschinsky, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+acutely+inhibits+acetylcholine-+but+not+GLP-1-stimulated+insulin+secretion+in+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid acutely inhibits acetylcholine- but not GLP-1-stimulated insulin secretion in mouse pancreatic islets.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 299 (3), E475-E485 (2010).</li>
</ol>

I.R.S., M.G. en K.B. hebben financiële banden met EnTox Sciences, Inc. (Mercer Island, WA), de fabrikant/distributeur van het BaroFuse-perifusiesysteem dat in deze studie wordt beschreven. Alle andere auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Vanwege het belang van bio-energetica in alle aspecten van de celfunctie en het onderhoud van verschillende componenten van het oog, is er een kritieke behoefte aan methoden om de regulatie ervan te bestuderen. In het bijzonder zijn neuraal netvlies en RPE afhankelijk van het metabolisme voor zowel energieopwekking als intra- en intercellulaire signalering14,15,16,17. Vanwege hun hoge oxidatieve capaciteit worden geïsoleerde weefsels van het oog niet goed onderhouden onder statische omstandigheden18,19 en daarom vereist de studie van geïsoleerde componenten van het oog stroomsystemen die metabolische processen zowel kunnen handhaven als beoordelen. Het fluïdica-systeem is ontwikkeld om OCR- en LPR-gegevens te genereren van een breed scala aan weefseltypes en in dit artikel hebben we gedetailleerde protocollen gepresenteerd die optimale resultaten bleken te produceren.
De belangrijkste bepalende factor voor het genereren van robuuste gegevens met behulp van het stroomsysteem omvat pre-equilibratie van op CO2 gebaseerde media/buffer bij 39 °C (om ervoor te zorgen dat perifusaat niet oververzadigd raakt met opgelost gas dat tijdens het experiment zou ontgassen). Met name media of KRB-buffers die bij 4 °C zijn opgeslagen, zullen oververzadigd zijn ten opzichte van 37 °C en zullen tijdens het experiment ontgassen als de pre-equilibratietijden onvoldoende zijn. Bovendien mag weefsel dat in de weefselkamers wordt geladen, niet worden getraumatiseerd door onjuiste isolatie van weefsel als gevolg van scheuren of onvolledige scheiding van weefsel, of door weefsel in een lage hoeveelheid op bicarbonaat gebaseerde buffer te lang bloot te stellen aan atmosferische lucht. De temperatuurregeling, stromingsstabiliteit en betrouwbaarheid van O2-detectie hebben weinig variabiliteit en deze factoren dragen niet significant bij aan het uitvalpercentage.
Het instrument heeft acht stroomkanalen/weefselkamers die gelijktijdig lopen en die worden gevoed met perifusaat uit twee reservoirs, vier weefselkamers voor elk reservoir. Om het meest nauwkeurige verloop van OCR te krijgen, worden kinetische curven volgens de basislijn gecorrigeerd door kamers die niet met weefsel zijn belast. Een typisch experimenteel protocol zou dus twee groepen van drie weefselkamers omvatten. Protocollen vallen in het algemeen in twee categorieën: de ene zijn de verschillende protocollen voor testverbindingen aan elke kant (bijvoorbeeld geneesmiddel/vehiculum aan de ene kant van de MRM en alleen vehiculum aan de andere kant); de tweede is hetzelfde injectieprotocol voor testverbindingen aan beide zijden van de MRM, maar aan elke kant van de MRM een ander weefsel of weefselmodel. In dit artikel werden de effecten van oligomycine en FCCP op het netvlies vergeleken met OCR door weefsel dat niet werd blootgesteld aan testverbindingen, en twee weefsels werden gelijktijdig beoordeeld volgens hetzelfde protocol en dezelfde omstandigheden om weefselspecifiek gedrag te identificeren. Dit laatste werd in deze studie geïllustreerd door in hetzelfde experiment een verhoogd dynamisch bereik van de stofwisseling door RPE-choroïde-sclera ten opzichte van het netvlies parallel aan te tonen. Andere rapporten hebben een breder scala aan onderzoeksontwerpen beschreven, waaronder het meten van de effecten variërend van O2-niveaus op OCR en LPR, en concentratie-afhankelijkheden van brandstoffen, medicijnen en toxines20,21. Bovendien, hoewel we de analyse van uitstroomfracties hebben beperkt tot het meten van lactaat en het berekenen van LPR, neemt de informatie-inhoud van een experiment sterk toe als meerdere verbindingen en klassen van verbindingen in de uitstroomfracties worden getest, zoals hormonen, neurotransmitters, celsignalen en metabolieten die de cellen kunnen verlaten20,22, 23. okt.
Het laden van geïsoleerd netvlies of RPE-choroide-sclera is eenvoudig, en eenmaal geïsoleerd worden deze weefsels eenvoudig met een pincet in de bovenkant van de weefselkamers geplaatst en naar de fritte laten zinken. RPE-cellen gekweekt op filterinzetstukken ontwikkelen de juiste polarisatie en markers van RPE-rijpheid na 4-8 weken in kweek. Het is niet haalbaar om de RPE te verwijderen voor analyse van levende cellen zodra deze aan het transwellmembraan is bevestigd, als de rijpheid en polarisatie van de RPE moeten worden gehandhaafd24. De perifusiekamer is geschikt voor stroken van het transwellmembraan die met een scalpel worden doorgesneden terwijl ze in buffer worden ondergedompeld en snel in de weefselkamers worden ingebracht. Hoewel het snijden van filterstrips in een statisch systeem is geplaatst24, is er geen andere fluïdische methode beschikbaar om deze belangrijke celtypen te beoordelen. De reacties van RPE-cellen waren snel en dynamischer dan het netvlies of de RPE-choroide-sclera, waarschijnlijk gedeeltelijk als gevolg van onmiddellijke toegang tot zowel de apicale als de basale aspecten van de RPE-cellen die zijn geconfigureerd als een monolaag op het membraaninzetstuk.
Een andere factor om ervoor te zorgen dat gegevens het hoogste signaal-ruispercentage hebben, is het selecteren van de optimale verhouding van weefsel dat in de perifusiekamers wordt geladen ten opzichte van de stroomsnelheid. Te weinig weefsel ten opzichte van het debiet resulteert in een verschil in opgelosteO2-concentratie tussen instroom en uitstroom dat zeer klein is en moeilijk betrouwbaar te meten. Als de stroom daarentegen te langzaam is, wordt de concentratie van O2 zo laag dat het weefsel wordt aangetast door hypoxie. Desalniettemin kan de gasdrukgestuurde vloeistofstroom worden gehandhaafd op stroomsnelheden tot 5 ml/min, waarbij slechts kleine hoeveelheden weefsel nodig zijn voor nauwkeurige OCR- en LPR-metingen. In de hier getoonde experimenten werd ongeveer 20 ml/min/kanaal gebruikt, wat geschikt was voor één netvlies, twee RPE-choroïde-sclera's of 360.000 RPE-cellen. Om de systeemeffecten te minimaliseren die de blootstelling van het weefsel aan de geïnjecteerde teststof vertragen en verspreiden, worden meerdere maten van de weefselkamers geleverd, zodat de hoeveelheid weefsel (en stroomsnelheid) is afgestemd op de juiste grootte van de kamer.
Gegevens uit de analyses in dit artikel werden op twee manieren weergegeven: absolute grootte ten opzichte van de snelheid, of fractionele veranderingen ten opzichte van een steady-state of baseline. De nadruk lag op het illustreren van het meten van responsen op testverbindingen. Het fluïdische systeem is echter zeer geschikt om effecten van weefselbehandeling voorafgaand aan de perifusieanalyse, zoals genetische modificaties, te beoordelen en te vergelijken. Testen of een behandeling verschilt van de controle, is het meest robuust als de effecten van de behandeling op genormaliseerde responsen van testverbindingen worden geanalyseerd. Als de analyse absolute grootheden vereist, wordt de statistische kracht van de analyses van voorbehandelde monsters gemaximaliseerd als hun beoordeling en controles in hetzelfde perifusie-experiment worden uitgevoerd.
Met uitzondering van de roerder worden alle onderdelen die in contact komen met vloeistof door de fabrikant geleverd als verbruiksartikelen en zijn ze gesteriliseerd. Deze onderdelen mogen niet opnieuw worden gebruikt, omdat experimenten af en toe verloren gaan door onvolledige reiniging en vervuilde oppervlakken. Het systeem aan het begin van de installatie is steriel. Er worden echter media aan de MRM toegevoegd en weefsel wordt onder niet-steriele omstandigheden in de kamers geladen. We hebben OCR gemeten in het systeem dat is samengesteld met onderdelen die steriel zijn, maar waarbij het experiment zelf onder niet-steriele omstandigheden wordt uitgevoerd. Het duurt ongeveer 14 uur voordat bacteriën zich ophopen tot het punt dat ze meetbare OCR hebben (niet-gepubliceerde resultaten). Als protocollen worden gebruikt die minder dan 10 uur duren, zijn de ophoping van bacteriën en eventuele effecten als gevolg hiervan verwaarloosbaar.
Veel onderzoekers gebruiken instrumenten die zijn ontworpen om OCR te meten onder statische incubatie van een monolaag van cellen met een relatief hoge doorvoer25,26. Daarentegen houdt het fluïdische instrument dat we in dit artikel hebben getest en beschreven, het weefsel in stand door te zorgen voor een adequate O2-afgifte, wat van cruciaal belang is voor de grotere diffusieafstanden die aanwezig zijn in weefselmonsters. Bovendien is het in staat om breuken te verzamelen, waardoor meerdere parameters parallel met OCR kunnen worden beoordeeld, wat het vermogen om relaties tussen hen te bestuderen aanzienlijk verbetert. Ten slotte kunnen opgeloste gasconcentraties (zoals O 2 en CO 2) worden gecontroleerd, waardoor de duur van experimenten met bicarbonaatgebaseerde media en buffer wordt verlengd, waardoor de gebruiker de effecten van O2 kan bestuderen. Opgemerkt moet worden dat een beperking voor beide methodologieën het onvermogen is om het uitspoelen van testverbindingen te bestuderen, een functionaliteit die andere perifusiesystemen hebben 4,27,28. Een andere overweging bij het bepalen van de optimale analysemodaliteit is het feit dat fluïdische systemen meer media en testverbindingen gebruiken dan statische systemen. De extra kosten worden echter geminimaliseerd met de huidige fluïdische systemen vanwege de lage stroomsnelheden die het systeem kan gebruiken.
In het algemeen wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van de protocollen om experimenten uit te voeren met een nieuw flow/assessment instrument. Gegevens gegenereerd met retina en RPE-choroide-sclera recapituleerden eerdere resultaten die zijn verkregen met systemen die veel moeilijker te gebruiken zijn (en niet direct beschikbaar). Er werd ook aangetoond dat het systeem RPE-cellen kan onderhouden en beoordelen die zijn bevestigd aan transwellmembranen, een zeer belangrijk cellulair model dat niet eerder is geanalyseerd met flowsystemen vanwege de kwetsbaarheid van de cellen. De belangrijkste onderdelen van het protocol bestaan uit een insteltijd van 75 minuten, gevolgd door een evenwichtsperiode van 90 minuten en het experimentele protocol waardoor het geschikt is voor routinematig gebruik door laboratoria die niet gespecialiseerd zijn in de werking van fluïdische systemen. Hoewel we ons hebben gericht op het meten van de acute respons van weefsel op testverbindingen, is het systeem zeer geschikt om weefsel uit verschillende bronnen te vergelijken, zoals diermodellen of celmodellen die genetisch zijn veranderd of testbehandelingen/omstandigheden hebben ondergaan. Bovendien is de reikwijdte van de tests die kunnen worden uitgevoerd op de uitstroomfracties breed en omvatten ze metabolieten, celsignaalmoleculen en uitgescheiden hormonen/neurotransmitters, evenals multicomponentenanalyse gegenereerd door massaspectrometrie op zowel de fracties als het weefsel.

Perifusiesystemen hebben een lange geschiedenis in de levenswetenschappen. In het bijzonder voor de studie van de secretoire functie door eilandjes, zijn ze gebruikt om de kinetiek van insulinesecretie te karakteriseren als reactie op secretagogen1. Naast het verzamelen van uitstroomfracties voor latere bepaling van hormonen en metabolieten, zijn real-time sensoren ingebouwd, voornamelijk voor de detectie van zuurstofverbruik 2,3,4. Wijdverbreide inspanningen om mechanismen die oogziekten mediëren beter te begrijpen, zijn beperkt door een gebrek aan fysiologisch relevante methoden om metabole regulatie en ontregeling van de verschillende geïsoleerde componenten van het oog te beoordelen, waaronder het netvlies, retinale pigmentepitheliale (RPE)-choroïde-sclera en gekweekte RPE-cellen. Statische systemen die zijn ontworpen voor gekweekte cellen zijn aangepast voor weefsel5, maar weefsel heeft stroming nodig voor voldoende zuurstofvoorziening. Flowsystemen zijn succesvol geweest in het nauwkeurig en reproduceerbaar meten van real-time reacties in zuurstofverbruik (OCR) door het netvlies en RPE-choroide-sclera, en de weefsels blijven metabolisch stabiel gedurende meer dan 8 uur, waardoor zeer informatieve protocollen met meerdere testverbindingen mogelijk zijn 4,6,7,8,9 . Desalniettemin heeft de werking van fluïdische systemen van oudsher een op maat gemaakt apparaat en opgeleid technisch personeel in niet-gestandaardiseerde methodologieën vereist. Dergelijke systemen zijn in de meeste laboratoria niet als standaardmethode aangenomen. De BaroFuse is een nieuw ontwikkeld fluïdisch systeem dat niet afhankelijk is van pompen, maar van gasdruk om de stroom door meerdere kanalen en weefselkamers te drijven (Figuur 1). Elk kanaal wordt continu gecontroleerd op OCR en de uitstroom wordt opgevangen met een plaatgebaseerde fractiecollector voor latere analyse van de inhoud. Belangrijk is dat de weefselperifusiekamers voor het instrument zijn ontworpen om weefsels van verschillende geometrieën en groottes te huisvesten.
Het hart van het instrument is het fluïdische systeem, waarbij de stroom wordt aangedreven van een verzegeld, onder druk staand reservoir door slangen met een kleine binnendiameter (ID) (die bijdragen aan de belangrijkste stromingsweerstand in het vloeistofcircuit) naar de glazen weefselkamers die het weefsel huisvesten. De druk naar de mediareservoirmodule (MRM) wordt geleverd door lagedruk- en hogedrukregelaars die zijn aangesloten op een gasfles die een mengsel van gassen bevat (meestal 21% O 2, 5% CO 2, balans N2), en het reservoir wordt van bovenaf afgesloten door de perifusiekamermodule (PCM) die de weefselkamerassemblages (TCA's) bevat. Het debiet wordt geregeld door de lengte en ID van de weerstandsbuizen en de drukinstelling van een lagedrukregelaar. Uitstroombuizen die zijn aangesloten op de bovenkant van weefselkamers leveren vloeistof aan een afvalcontainer (die continu wordt gewogen voor automatische bepaling van het debiet) of aan putten van een plaat met 96 putjes die wordt bestuurd door de fractiecollector. Het O2-detectiesysteem meet de levensduur van eenO2-gevoelige kleurstof die aan de binnenkant van elk van de glazen weefselkamers stroomafwaarts van het weefsel is geschilderd. Deze informatie wordt vervolgens gebruikt om de OCR continu te berekenen. Het gehele fluidics-systeem bevindt zich in een temperatuurgecontroleerde behuizing en de gastank, de fractiecollector en de computer zijn de belangrijkste componenten van het instrument (Figuur 2A). Ten slotte dient de software die het instrument bestuurt om de werking ervan te regelen (inclusief de voorbereiding en timing van geïnjecteerde testverbindingen, het stroommeetsysteem en de timing van de fractiecollector), evenals het verwerken en grafieken maken van de OCR-gegevens en andere aanvullende metingen.
In dit artikel beschrijven we de protocollen voor het gebruik van het fluïdische systeem om OCR en lactaatproductiesnelheid (LPR) voor verschillende geïsoleerde componenten van het oog te perifuseren en te beoordelen. LPR is een parameter die de glycolytische snelheid weerspiegelt en die zeer complementair is aan OCR, waarbij het paar verantwoordelijk is voor de twee belangrijkste takken van energieopwekking uit koolhydraten in de cel10. Aangezien de voorbereiding van het weefsel en het laden ervan in de weefselkamers het beste kan worden geleerd door de procedure te bekijken, zal de video helpen bij het illustreren van verschillende van de kritieke stappen die worden uitgevoerd tijdens het instellen en bedienen en die niet gemakkelijk kunnen worden overgebracht door tekst alleen.
De beschrijving van het protocol is opgedeeld in 8 secties die overeenkomen met verschillende fasen van het experiment (Figuur 2B): 1. pre-experimentele voorbereiding; 2. bereiding/evenwicht van het perifusaat; 3. Opzetten van het instrument; 4. weefselevenwicht; 5. experimenteel protocol; 6. instrument defect; 7. Gegevensverwerking; en 8. Analyse van uitstroomfracties.

<table><tbody><tr><td>BIOLOGISCHE VOORBEELDENS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J muizen</td><td>Envigo Harlan (Indianapolis, IN)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>REAGENTIA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920L9795</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270G</td><td></td></tr><tr><td>KCN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60178</td><td></td></tr><tr><td>Lactaat&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>L6661</td><td></td></tr><tr><td>Oliigomycine A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351L9795</td><td></td></tr><tr><td>CEL KULTUREN EN WEEFSELVERZAMELING</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beuthanasia-D</td><td>Schering-Plough Animal Health Corp., Union, NJ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rundserumalbumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol, 390 mg/ml natriumpentobarbital</td><td>Virbac</td><td>RXEUTHASOL</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Buffered Salt Solution</td><td>GIBCO</td><td>14065056</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Ringer Bicarbonaat (KRB)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J67795L9795</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&nbsp;</td><td>ThermoFisher&nbsp;</td><td>#CB-40230</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>ThermoFisher Scientific&nbsp;</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ROCKi&nbsp;</td><td>Selleck Chemicals</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>#25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>BENODIGDHEDEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gasflessen: 21% O2/5% CO2/rest N2</td><td>Praxair Distribution, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Transwell filters&nbsp;</td><td>MilliporeSigma</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>COMMERCIELE ASSAY'S</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplex Red Glucose/Glucose Oxidase Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>A22189</td><td></td></tr><tr><td>Glucose Oxidase uit Aerococcus viridans</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>A22189L9795</td><td></td></tr><tr><td>Lactaat Oxidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9795</td><td></td></tr><tr><td>APPARATUUR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BaroFuse&nbsp; Multi-Channel Perifusie systeem</td><td>EnTox Sciences, Inc (Mercer Island, WA</td><td>Model 001-08</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 4 Fluorometer</td><td>BioTek (Winooski, VT)</td><td>S4MLFPTA</td><td></td></tr></tbody></table>

onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem

Maintaining and Assessing Various Tissue and Cell Types of the Eye Using a Novel Pumpless Fluidics System

Veel in vitro modellen die worden gebruikt om weefselfunctie en celbiologie te onderzoeken, hebben een stroom van media nodig om voldoende zuurstof en optimale celomstandigheden te bieden die nodig zijn voor het behoud van functie en levensvatbaarheid. Daartoe hebben we een meerkanaals stroomkweeksysteem ontwikkeld om weefsel en cellen in kweek te houden en continu de functie en levensvatbaarheid te beoordelen door middel van in-line sensoren en/of het verzamelen van uitstroomfracties. Het systeem combineert 8-kanaals, continue optische detectie van het zuurstofverbruik met een ingebouwde fractiecollector om tegelijkertijd de productiesnelheid van metabolieten en hormoonsecretie te meten. Hoewel het in staat is om een breed scala aan weefsel- en celmodellen te onderhouden en te beoordelen, waaronder eilandjes, spieren en hypothalamus, beschrijven we hier de werkingsprincipes en de experimentele preparaten/protocollen die we hebben gebruikt om bio-energetische regulatie van geïsoleerd muizennetvlies, retinaal pigmentepitheel (RPE)-choroïde-sclera van muizen en gekweekte menselijke RPE-cellen te onderzoeken. Innovaties in het ontwerp van het systeem, zoals pomploze vloeistofstroom, hebben geleid tot een sterk vereenvoudigde werking van een meerkanaals stromingssysteem. Er worden video's en afbeeldingen getoond die illustreren hoe het instrument moet worden geassembleerd, voorbereid op een experiment en hoe de verschillende weefsel-/celmodellen in de perifusiekamers moeten worden geladen. Daarnaast worden richtlijnen voor het selecteren van omstandigheden voor protocol- en weefselspecifieke experimenten afgebakend en besproken, inclusief het instellen van de juiste verhouding tussen stroomsnelheid en weefsel om consistente en stabiele kweekomstandigheden en nauwkeurige bepalingen van consumptie- en productiesnelheden te verkrijgen. De combinatie van optimaal weefselonderhoud en real-time beoordeling van meerdere parameters levert zeer informatieve datasets op die van groot nut zullen zijn voor onderzoek in de fysiologie van het oog en de ontdekking van geneesmiddelen voor de behandeling van verminderd gezichtsvermogen.

Om de resolutie van de gegevens die zijn gegenereerd uit geïsoleerde componenten van het oog te illustreren, werden OCR en LPR gemeten met drie soorten weefsel (netvlies, RPE-choroïde-sclera en RPE-cellen) volgens een veelgebruikt protocol (de mitochondriale stresstest10; Figuur 10, Figuur 11 en Figuur 12). De hoeveelheid weefsel die voor elk weefsel wordt gebruikt, is weergegeven in tabel 1. De gegevens werden verwerkt en in grafieken weergegeven met behulp van het softwarepakket dat voor het fluidics-systeem werd ontwikkeld. De voorbereiding van retina en RPE-choroide-sclera is relatief eenvoudig en duurt minder dan 20 minuten voor elk weefseltype. OCR was constant gedurende de tijd dat teststoffen werden geïnjecteerd, wat wijst op een stabiele gezondheid en functie van het weefsel en de validiteit van de methode ondersteunt (figuur 10). Eenmaal gevalideerd voor elk weefseltype, hebben we het niet nodig gevonden om controles uit te voeren waarbij geen testverbindingen worden geïnjecteerd voor elk experiment. In overeenstemming met gegevens verkregen met behulp van meer conventionele perifusiemethoden 6,8,13, OCR afname als reactie op oligomycine en verhoogde OCR als reactie op FCCP. Veranderingen in LPR waren in de tegenovergestelde richting van die waargenomen voor OCR: oligomycine verhoogde LPR, die vervolgens afnam (maar slechts licht) als reactie op FCCP (Figuur 11). Om de statistische significantie van het effect van elke sequentiële teststof te vergelijken, werden t-tests uitgevoerd (die automatisch worden berekend door de software die bij het instrument wordt geleverd). Aangezien het doel van het artikel was om te beschrijven hoe de methode moest worden uitgevoerd, was het aantal uitgevoerde replicaten niet altijd hoog genoeg om statistische significantie te produceren. Over het algemeen echter, wanneer het aantal replicaten 3 of meer was, waren de effecten van FCCP en oligomycine op zowel OCR als LPR significant.
RPE-cellen zijn niet eerder geanalyseerd met flowsystemen, maar reageerden op dezelfde manier op RPE-choroide-sclera (in overeenstemming met de opvatting dat een groot deel van OCR te wijten is aan RPE-cellen; Figuur 11). Deze illustratieve voorbeelden benadrukken het vermogen van het systeem om de levensvatbaarheid van weefsels te behouden, zoals blijkt uit de stabiliteit van OCR in de controlekanalen, en de hoge signaal-ruisverhouding voor veranderingen in OCR van de omvang die wordt geïnduceerd door oligomycine en FCCP, die meer dan 100 op 1 was. Bovendien kunnen analyses van uitstroomfracties worden gebruikt om de opnamesnelheid of productie van een breed scala aan verbindingen die worden uitgewisseld met de extracellulaire vloeistof te correleren, wat complementair is aan OCR (in dit geval LPR). Deze kenmerken van het instrument maakten een nauwkeurige kwantificering mogelijk van karakteristieke verschillen in weefselresponsen tussen weefseltypes die parallel werden uitgevoerd. OCR door RPE-choroïde-sclera en RPE-cellen zijn consequent gevoeliger voor oligomycine dan voor netvlies (Figuur 11 en Figuur 12), hoewel voor de RPE-choroïde-sclera de duur van de blootstelling aan FCCP niet lang genoeg was om de steady state te bereiken. Een aandachtspunt ontstond bij het gebruik van DMSO als oplosmiddel. Bij hogere concentraties (0,2%) had DMSO een voorbijgaand effect op OCR door het netvlies (vermoedelijk als gevolg van een effect van een verandering in osmotische druk veroorzaakt door het effect van DMSO op de membraanpermeabiliteit).
Op basis van de veronderstelling dat KCN de ademhaling volledig remt door zijn directe werking op cytochroom-c-oxidase, wordt OCR aan het einde van de KCN-blootstelling op 0 gezet en worden alle OCR-waarden berekend op basis van de verandering ten opzichte van de KCN-waarde. OCR kan onafhankelijk van de ademhalingsketen en cytochroom-c-oxidase optreden. De omvang van deze bijdrage aan de totale OCR is echter over het algemeen niet meer dan een paar procent (gegevens niet getoond) en de langere tijd dat weefsel wordt blootgesteld aan KCN zorgt ervoor dat substraten van oxidasen die geen deel uitmaken van de elektronentransportketen zijn uitgeput.
Statistische analyse Enkelvoudige experimenten werden getoond zoals aangegeven in de figuren, maar met meerdere kanalen die gemiddeld waren. De gegevens werden vervolgens in een grafiek weergegeven als het gemiddelde ± de standaardfout (SE; berekend als SD/√n).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2.jpg"> Figuur 1. Schema van het fluïdica/beoordelingssysteem. Belangrijke componenten zijn onder meer de behuizing, temperatuurregelelementen, fluïdica- en weefselkamersystemen, regeling van de gasdruk in de hoofdruimte boven perifusaat, fractiecollector/debietbewaking enO2-detectoren . Afkortingen: MRM = Media Reservoir Module, PCM = Perifusion Chamber Module, TCA = Tissue Chamber Assemblies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig02.jpg"> Figuur 2. (A) Afbeelding van de belangrijkste onderdelen van het instrument. De belangrijkste componenten bestaan uit een gastank (drukregelaars), behuizing, fractiecollector en computer. (B) Experimenteel stroomschema met de belangrijkste categorieën stappen en de tijd die nodig is om ze te voltooien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig03.jpg"> Figuur 3. Zicht op de MRM. De MRM wordt weergegeven met een MRM-inzetstuk (links) en roerstaven (rechts) die in de onderkant van de MRM-inzetstukken zijn geplaatst (aan weerszijden van de MRM-verdeler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig04.jpg"> Figuur 4. Slangassemblage en spoelslangassemblage in de MRM. (A) De injectieslang van de testverbinding en de spoelslang die aan de poorten van de MRM zijn bevestigd. (B-C) De injectie van de testverbinding en de spoelslang (B) worden in de groef aan de voorkant van de behuizing (C) geplaatst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig05.jpg"> Figuur 5. De MRM-temperatuurregelaar inschakelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig06.jpg"> Figuur 6. Weefselkamers en gastank. Het plaatsen van de O2-detector op de detectorstandaard (die ook de MRM en PCM ondersteunt) en het plaatsen van de band rond de vinnen van de PCM die helpen de weefselkamers op hun plaats te houden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig07.jpg"> Figuur 7. (A) Hoge- en lagedrukregelaars op de gastank. (B-C) Spoel de buis door. De ontluchtingsbuis zorgt ervoor dat de hoofdruimte in de MRM lucht kan vrijmaken en zich kan vullen met gas uit de toevoertank. Foto's van de open ontluchtingsbuis (B) en de dichte ontluchtingsbuis (C). De injectie-eenheid van de testverbinding blijft gesloten tijdens het zuiveringsproces. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig08v3.jpg"> Figuur 8. Weefselkamer en de uitstroomopstelling. (A) Afmetingen van het Transwell-membraan nadat het in drie stroken van gelijke breedte is gesneden. (B) Uitstroom multi-tube ondersteuning. (C) Uitstroomsteun met meerdere slangen op de lip van de behuizing met de slangadapters in de buurt van de weefselkamers. (D) Foto van uitstroomslangen die aan de weefselkamers zijn bevestigd. (E) Luchtfoto van de behuizing zonder het deksel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig08largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig09.jpg"> Figuur 9. Injectie van verbinding in MRM. Het injecteren van een teststof via de injectiepoort in de MRM met behulp van een spuit van 5 ml. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig09large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig10.jpg"> Figuur 10. OCR- en LPR-curven als reactie op testverbindingen. OCR en LPR door netvlies geïsoleerd van muizen (1 netvlies/kanaal) als reactie op de aan- of afwezigheid (controle) van testverbindingen zoals aangegeven. Elke curve is het gemiddelde van 6 replicaten van een enkel experiment (foutbalken zijn SE; p-waarden worden berekend door gepaarde t-tests uit te voeren waarbij de steady-state-waarden voor elk testmiddel worden vergeleken met die van het vorige testmiddel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig10large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig11.jpg"> Figuur 11. OCR-curves. OCR door RPE-choroide-sclera en retina geïsoleerd van muizen (1 netvlies of 2 RPE-choroïde-sclera/kanaal) parallel gemeten als reactie op testverbindingen zoals aangegeven. De gegevens zijn het gemiddelde van de replicaten van een enkel experiment (n = 2 en 4 voor respectievelijk RPE-choroïde-sclera en netvlies; p-waarden worden berekend door gepaarde t-tests uit te voeren waarbij de steady-state-waarden voor elk testagens worden vergeleken met die van het vorige testmiddel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig11large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65399/65399fig12.jpg"> Figuur 12. OCR- en LPR-curven van RPE-cellen. OCR en LPR van RPE-cellen die waren bevestigd aan transwellmembranen die in reepjes werden gesneden en in de perifusiekamers werden geladen. De gegevens zijn het gemiddelde van de replicaten van een enkel experiment (n = 3, met 1,5 membranen/kanaal (360.000 cellen/kanaal); p-waarden worden berekend door gepaarde t-tests uit te voeren waarbij de steady-state-waarden voor elk testmiddel worden vergeleken met die van het vorige testmiddel). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/65399fig12large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>WEEFSEL/CEL</td>
			<td>Bedrag/kanaal</td>
			<td>DEBIET: ml/min</td>
		</tr><tr><td>Netvlies (muis)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.025</td>
		</tr><tr><td>RPE-choroïde-sclera (muis)</td>
			<td>2</td>
			<td>0.02</td>
		</tr><tr><td>RPE-cellen op transwellmembranen</td>
			<td>360.000 cellen (4 x 1/3 filterstrips)</td>
			<td>0.016</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1. Aanbevolen gebruiksspecificaties voor verschillende weefsels.
Aanvullende figuur 1. Grafische weergave van experimenteel ontwerp. Tijdstip en samenstelling van de blootstelling aan testverbindingen en tijdstip van het verzamelen van fracties. Concentratieverhoging (Conc Inc) is de concentratiewijziging die moet worden doorgevoerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig1.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2. Gebruikersinterface bij het opstarten. UI van het opstartvenster van de O 2-detectiesoftware die de O2 bewaakt in de weefselkamers die in de PCM zijn ingebracht. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 3. Gebruikersinterface voor experimentinstellingen. Gebruikersinterface voor het invoeren van experimentele informatie (links) en het selecteren van tijden voor het verzamelen van uitstroomfracties (rechts). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig3.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 4. Gebruikersinterface van de injectiepagina. Injectiepagina die de injectievolumes berekent op basis van de gewenste concentraties van de teststof en het resterende volume in de MRM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/Supp%20Fig4.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 1: Methoden voor de bereiding van weefselmonsters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65399/supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Real-time analyse van levend weefsel levert belangrijke functionele en mechanistische gegevens op. Dit artikel beschrijft de protocollen en kritische variabelen om te zorgen voor een nauwkeurige en reproduceerbare generatie van gegevens door een nieuw en pompvrij meerkanaals fluïdisch systeem dat een breed scala aan weefsel- en celmodellen onderhoudt en beoordeelt.

Onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem

Many in vitro models used to investigate tissue function and cell biology require a flow of media to provide adequate oxygenation and optimal cell ...

De meest gebruikte apparaten voor het meten van het zuurstofverbruik ondersteunen niet de gelijktijdige verzameling van uitstroomfracties. Het is van cruciaal belang om ook de uitstroom te testen om het metabolisme te correleren met de weefselfunctie. Door beide door technologie te meten, kunnen cellulaire mechanismen die weefselfunctie en ziekte mediëren, beter worden beoordeeld.De belangrijkste uitdaging bij het meten van het zuurstofverbruik en levend weefsel is het leveren van voldoende zuurstof om de levensvatbaarheid en functie van het weefsel te behouden. Dit kan het beste worden bereikt met stroomsystemen. Het gebruik van gasdruk in plaats van standaard peristaltische pompen vereenvoudigt de procedure aanzienlijk en elimineert ook de vorming van luchtbellen.Het nut van een metabole meting is slechts zo goed als het vermogen om de resultaten te kwantificeren en te reproduceren. Ons protocol maakt gebruik van de combinatie van nauwkeurig geregeld debiet met stabiele detectie van opgeloste zuurstof in zowel in- als uitstroom. Deze aanpak kan reproduceerbaar veranderingen in het zuurstofverbruik van zelfs maar een paar procent oplossen.De biochemische processen die de functie van het netvlies mediëren, zijn het resultaat van het metabolische samenspel tussen verschillende weefsels van het oog. Het vermogen van ons stroomsysteem om meerdere weefseltypes met verschillende geometrieën te beoordelen, vergemakkelijkt de studie van de unieke intrinsieke eigenschappen van elk celtype en hun gecoördineerde functies. Veel ziekten die het oog treffen, worden veroorzaakt door verminderde metabole routes en signalering.We richten ons op het meten van het zuurstofverbruik en de afgifte van metabole bijproducten door oogweefsels om de ontwikkeling van netvliesaandoeningen en degeneratie te karakteriseren, te begrijpen en te behandelen.

maintaining-assessing-various-tissue-cell-types-eye-using-novel

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Een microfluïdische eilandje perifusion apparaat werd ontwikkeld voor de beoordeling van dynamische insuline secretie van verschillende eilandjes en gelijktijdige fluorescentie beeldvorming van calcium influx en mitochondriale potentiële veranderingen.

Een Multi-parametrische Islet Perifusion System binnen een Microfluïdische Perifusion Device

Dit protocol repliceert fysiologische of pathologische bloedstroom in vitro te helpen bij het ​​bepalen celrespons ziekte pathologieën. Door de invoering van een druk rustkamer stroomafwaarts van een bloed pomp, kan de bloedstroom over het vaatstelsel worden gerecapituleerd en opgelegd aan een monolaag van vasculaire endotheel of mimetische co-cultuur.

In vitro model van de fysiologische en pathologische Blood Flow met toepassing op onderzoeken van Vascular celremodelering

Huidige in vitro modellen voor het beoordelen contactlenzen (CL's) en andere eye toepassingen ernstig beperkt. De gepresenteerde oculaire platform simuleert fysiologische traanvocht, scheur volume, belichting lucht en mechanische slijtage. Dit systeem is zeer veelzijdig en kan worden toegepast op diverse in vitro analyses CL's.

Ontwikkeling van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Contactlenzen Test

Een stap voor stap protocol voor niet-destructieve en lange-termijn follow-up van het proces van vasculaire remodeling en aantasting van de steiger in real-time cultuur van biologisch afbreekbaar polymeer steiger gebaseerde weefsel-engineered bloedvaten met Pulsatiele stimulatie met behulp van optische coherentie tomografie wordt hier beschreven.

Niet-destructieve controle van afbreekbaar steiger gebaseerde weefsel-Engineered bloedvat ontwikkelen met behulp van optische coherentie tomografie

We beschrijven en detailleren het gebruik van het translaminaire autonome systeem. Dit systeem maakt gebruik van het menselijke posterieure segment om onafhankelijk de druk in het segment (intraoculair) en rond de oogzenuw (intracranieel) te reguleren om een translaminaire drukgradiënt te genereren die kenmerken van glaucomateuze optische neuropathie nabootst.

Translaminair autonoom systeemmodel voor de modulatie van intraoculaire en intracraniale druk in posterieure donorsegmenten van menselijke donoren

Het doel van dit protocol is om de ontwikkeling van een driedimensionaal (3D) microfluïdisch model van sterk uitgelijnd menselijk hartweefsel, samengesteld uit stamcel-afgeleide cardiomyocyten, samen met hartfibblasten (CFs) in een biomimetische, op collageen gebaseerde hydrogel, uit te leggen en aan te tonen, voor toepassingen in hartweefseltechniek, geneesmiddelenscreening en ziektemodellering.

Het ontwikkelen van 3D georganiseerd menselijk hartweefsel binnen een microfluïdisch platform

Open globe oogletsel kan onbehandeld blijven voor meerdere dagen in landelijke of militair-relevante scenario's, wat resulteert in blindheid. Therapeutica zijn nodig om verlies van gezichtsvermogen te minimaliseren. Hier beschrijven we een orgaancultuur open globe letselmodel. Met dit model kunnen potentiële therapieën voor het stabiliseren van deze verwondingen goed worden geëvalueerd.

Anterieur segment orgaancultuurplatform voor het volgen van open globe verwondingen en therapeutische prestaties

We presenteren een protocol voor het gebruik van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie (CLM) om de spatio-temporele verdeling van liposomen in het oog na subconjunctivale injectie niet-invasief te bestuderen.

Spatio-temporale in vivo beeldvorming van oculaire medicijnafgiftesystemen met behulp van fiberoptische confocale lasermicro-endoscopie

Hier presenteren we een protocol om een microfluïdisch systeem te fabriceren en te bedienen dat endotheelcellen blootstelt aan gesynchroniseerde oscillerende hyperglykemie en pulserende schuifspanning. Deze benadering biedt een fysiologisch relevant in vitro model voor het bestuderen van diabetische endotheeldysfunctie. Dit protocol maakt kwantitatieve metingen van oxidatieve stress en endotheelcelresponsen mogelijk.

Een microfluïdisch systeem voor het modelleren van endotheeldisfunctie onder gecombineerde fysiologische pulserende schuifspanning en oscillerende hyperglykemie

Raman spectroscopie is een geschikte techniek voor de non-contact, label-free analyse van levende cellen, weefsel-engineering constructen en cellen. Bronspecifieke spectrale vingerafdrukken worden gegenereerd en geanalyseerd met multivariate analyse.

Non-contact, Label-free monitoring van cellen en extracellulaire matrix met behulp van Raman spectroscopie

Leer een pomploos fluïdisch systeem voor real-time metabole analyse van oogweefsels, inclusief retina en RPE-cellen. Deze methode meet betrouwbaar zuurstofverbruik en lactaatproductie voor onderzoek naar retinale ziekten.

Onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem (Video) | JoVE Journal

Onderhouden en beoordelen van verschillende weefsel- en celtypes van het oog met behulp van een nieuw pomploos fluïdisch systeem

Meer video's verkennen