Name: Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer hoe je een aanpasbare single-objectief light-sheet fluorescentiemicroscoop bouwt voor visualisatie van cytoskeletnetwerken. Deze methode minimaliseert fotobleking en biedt uitstekende optische sectie in dichte 3D-samples.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation (NSF) RUI Award (DMR-2203791) aan J.S. We zijn dankbaar voor de begeleiding van Dr. Bin Yang en Dr. Manish Kumar tijdens het afstemmingsproces. Wij danken Dr. Jenny Ross en K. Alice Lindsay voor de bereidingsinstructies voor de kinesinemotoren.

Aanpasbare fluorescentiemicroscoop om cytoskeletnetwerken te visualiseren

<ol><li>Girkin, J. M., Carvalho, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light-sheet+microscopy+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Optics%22%5BJournal%5D)">The light-sheet microscopy revolution.</a> Journal Optics. 20 (5), 053002(2018).</li>
<li>You, R., McGorty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+illuminating+soft+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy illuminating soft matter.</a> Frontiers in Physics. 9, 760834(2021).</li>
<li>Fuchs, E., Jaffe, J. S., Long, R. A., Azam, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin+laser+light+sheet+microscope+for+microbial+oceanography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Thin laser light sheet microscope for microbial oceanography.</a> Optics Express. 10 (2), 145-154 (2002).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Dunsby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optically+sectioned+imaging+by+oblique+plane+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optically sectioned imaging by oblique plane microscopy.</a> Optics Express. 16 (25), 20306-20316 (2008).</li>
<li>Bouchard, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swept+confocally-aligned+planar+excitation+%28SCAPE%29+microscopy+for+high-speed+volumetric+imaging+of+behaving+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Photonics%22%5BJournal%5D)">Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms.</a> Nature Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).</li>
<li>Smith, C. W., Botcherby, E. J., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+oblique-plane+images+in+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Resolution of oblique-plane images in sectioning microscopy.</a> Optics Express. 19 (3), 2662-2669 (2011).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epi-illumination+SPIM+for+volumetric+imaging+with+high+spatial-temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Epi-illumination SPIM for volumetric imaging with high spatial-temporal resolution.</a> Nature Methods. 16 (6), 501-504 (2019).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+multiview+capture+and+fusion+improves+spatial+resolution+in+wide-field+and+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optica%22%5BJournal%5D)">Simultaneous multiview capture and fusion improves spatial resolution in wide-field and light-sheet microscopy.</a> Optica. 3 (8), 897-910 (2016).</li>
<li>Sahasrabudhe, A., Vittal, V., Ghose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peeping+in+on+the+cytoskeleton%3A+Light+microscopy+approaches+to+actin+and+microtubule+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Science%22%5BJournal%5D)">Peeping in on the cytoskeleton: Light microscopy approaches to actin and microtubule organization.</a> Current Science. 105 (11), 1562-1570 (2013).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., Nasenbeny, J., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+one-+and+two-photon+scanned+oblique+plane+illumination+%28SOPi%29+microscopy+for+rapid+volumetric+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Integrated one- and two-photon scanned oblique plane illumination (SOPi) microscopy for rapid volumetric imaging.</a> Optics Express. 26 (10), 13027-13041 (2018).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nature Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Sapoznik, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+oblique+plane+microscope+for+large-scale+and+high-resolution+imaging+of+subcellular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A versatile oblique plane microscope for large-scale and high-resolution imaging of subcellular dynamics.</a> eLife. 9, e57681(2020).</li>
<li>Bernardello, M., Marsal, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+microscopy+for+the+in+vivo+study+of+microtubule+dynamics+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence microscopy for the in vivo study of microtubule dynamics in the zebrafish embryo.</a> Biomedical Optics Express. 12 (10), 6237-6254 (2021).</li>
<li>Shelden, E. A., Colburn, Z. T., Jones, J. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focusing+super+resolution+on+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Focusing super resolution on the cytoskeleton.</a> F1000Res. 5, F1000 Faculty Rev-998 (2016).</li>
<li>Wulstein, D. M., Regan, K. E., Garamella, J., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology-dependent+anomalous+dynamics+of+ring+and+linear+DNA+are+sensitive+to+cytoskeleton+crosslinking%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Topology-dependent anomalous dynamics of ring and linear DNA are sensitive to cytoskeleton crosslinking.</a> Science Advances. 5 (12), (2019).</li>
<li>Sheung, J. Y., Garamella, J., Kahl, S. K., Lee, B. Y., McGorty, R. J., Robertson-Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor-driven+advection+competes+with+crowding+to+drive+spatiotemporally+heterogeneous+transport+in+cytoskeleton+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physics%22%5BJournal%5D)">Motor-driven advection competes with crowding to drive spatiotemporally heterogeneous transport in cytoskeleton composites.</a> Frontiers in Physics. 10, 1055441(2022).</li>
<li>Zeiss Lightsheet 7. Light-Sheet Multiview Imaging of Living and Cleared Specimens. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Zeiss Lattice Lightsheet 7. Long-Term Volumetric Imaging of Living Cells. Zeiss. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html">https://www.zeiss.com/microscopy/en/products/light-microscopes/light-sheet-microscopes/lattice-lightsheet-7.html</a> (2023).</li>
<li>Kumar, M., Kishore, S., McLean, D. L., Kozorovitskiy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossbill%3A+An+open+access+single+objective+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Crossbill: An open access single objective light-sheet microscopy platform.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Optics+and+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Advances in Optics and Photonics. 10 (1), 111-179 (2018).</li>
<li>Pitrone, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSPIM%3A+An+open-access+light-sheet+microscopy+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">OpenSPIM: An open-access light-sheet microscopy platform.</a> Nature Methods. 10 (7), 598-599 (2013).</li>
<li>Sheung Lab, Single Objective Light Sheet Microscope (SOLS) Guide. Sheung Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols">https://sites.google.com/view/sheunglab/microscopy/single-objective-light-microscope-sols</a> (2023).</li>
<li>Lamb, J. R., Ward, E. N., Kaminski, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-source+software+package+for+on-the-fly+deskewing+and+live+viewing+of+volumetric+lightsheet+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Open-source software package for on-the-fly deskewing and live viewing of volumetric lightsheet microscopy data.</a> Biomedical Optics Express. 14 (2), 834-845 (2023).</li>
<li>Harvard University. Mitchison Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mitchison.hms.harvard.edu/home">https://mitchison.hms.harvard.edu/home</a> (2023).</li>
<li>Research at Dogic Lab. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/">http://dogiclab.physics.ucsb.edu/research/</a> (2023).</li>
<li>Watkins, S. C., St. Croix, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+imaging+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Light sheet imaging comes of age.</a> Journal of Cell Biology. 217 (5), 1567-1569 (2018).</li>
<li>Ndlec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D. T. N., DeCamp, S. J., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Berezney, J., Goode, B. L., Fraden, S., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensile+to+contractile+transition+in+active+microtubule-actin+composites+generates+layered+asters+with+programmable+lifetimes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extensile to contractile transition in active microtubule-actin composites generates layered asters with programmable lifetimes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (5), e2115895119(2022).</li>
<li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isomorphic+coalescence+of+aster+cores+formed+in+vitro+from+microtubules+and+kinesin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Isomorphic coalescence of aster cores formed in vitro from microtubules and kinesin motors.</a> Physical Biology. 13 (5), 056002(2016).</li>
<li>Millett-Sikking, A., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMillett-Sikking%2C+A+%22High+NA+single-objective+lightsheet%22">High NA single-objective lightsheet</a>. , (2019).</li>
<li>Bourgenot, C., Saunter, C. D., Taylor, J. M., Girkin, J. M., Love, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+adaptive+optics+in+a+light+sheet+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">3D adaptive optics in a light sheet microscope.</a> Optics Express. 20 (12), 13252-13261 (2012).</li>
<li>Bernardello, M., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+multimodal+platform+for+classical+and+high+throughput+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Modular multimodal platform for classical and high throughput light sheet microscopy.</a> Scientific Reports. 12 (1), 1969(2022).</li>
<li>Crombez, S., Leclerc, P., Ray, C., Ducros, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+hyperspectral+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Computational hyperspectral light-sheet microscopy.</a> Optics Express. 30 (4), 4856-4866 (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen. Al het onderzoek werd uitgevoerd bij gebrek aan commerciële of financiële relaties die als belangenverstrengeling kunnen worden geïnterpreteerd.

Twee belangrijke details met betrekking tot dit protocol zijn de totale kosten van het systeem en de verwachte bouw- en uitlijntijd. Hoewel de exacte kosten variabel zijn, kunnen we gemakkelijk schatten dat de totale kosten van deze SOLS of een vergelijkbaar doe-het-zelfsysteem in het bereik van $ 85.000 USD zouden vallen. We merken op dat deze schatting rekening houdt met de verkoopprijs van alle componenten, dus deze totale prijs kan aanzienlijk worden verlaagd door gebruikte componenten in te kopen. Wat de bouwtijd betreft, zou het redelijk zijn om te verwachten dat een gebruiker met weinig optische ervaring dit hele SOLS-systeem binnen 1-2 maanden bouwt en uitlijnt, op voorwaarde dat alle componenten beschikbaar en klaar zijn. Ondanks de lengte en complexiteit van het protocol, zijn we van mening dat de hoeveelheid details in het geschreven manuscript, in combinatie met het videoprotocol, dit protocol eenvoudig en snel te volgen zou moeten maken.
Er zijn twee cruciale stappen in dit protocol. Ten eerste bepaalt de plaatsing van de galvo de plaatsing van veel lenzen, aangezien deze deel uitmaakt van drie afzonderlijke 4f-lensparen. Het is van cruciaal belang dat de galvo zowel geconjugeerd is met de achterste brandpuntsvlakken van O1 en O2 als correct is gecentreerd om kantel-invariant scannen te garanderen. Ten tweede is de beeldkwaliteit extreem gevoelig voor de uitlijning van O2 en O3 ten opzichte van elkaar. Hier moet ervoor worden gezorgd dat ten eerste de uitlijningshoek van O3 tot O2 overeenkomt met de kanteling van de excitatielichtplaat, waardoor een maximaal vlakke verlichting over het eveneens gekantelde gezichtsveld wordt geboden. Ten tweede moet O3 op de juiste axiale afstand worden geplaatst om een vlakke FoV met een zo groot mogelijk oppervlak te behouden. Ten derde moet O3 op de juiste laterale afstand van O2 worden geplaatst om het signaal dat door de O2-O3-interface gaat te maximaliseren.

In termen van de bruikbare FoV bereikte dit systeem een vlak, betrouwbaar veld met een consistente verlichting over een gebied van 80 μm x 80 μm. Dit gebied is kleiner dan de maximale gezichtsveldstraling die door de camera wordt geleverd, dus de bruikbare gezichtsveldaanval wordt aangegeven door het gele vak in afbeelding 13. In termen van het oplossend vermogen bereikte dit systeem een minimale oplosbare afstand van 432 nm langs de x-as en 421 nm langs de y-as, die werd gemeten door de gemiddelde sigma x en y van Gaussiaanse fits to point spread-functies (PSF's) in de goede FoV te vinden en met twee te vermenigvuldigen. We merken op dat dit systeem niet is geoptimaliseerd in termen van de totale NA, wat betekent dat er ruimte is voor aanzienlijke verbetering als gebruikers een oplossend vermogen wensen dat hoger is dan wat dit systeem bereikte. Er zijn een groot aantal compatibele objectiefopties voor dit type SOLS-build, waarvan er vele zouden bijdragen aan een hogere systeemresolutie, maar met de nadelen van hogere kosten, een kleinere FoV of meer gecompliceerde uitlijningstechnieken op de relaisinterface 8,11,13,20. Afzonderlijk, als gebruikers een grotere FoV wensen, zou het opnemen van een tweede galvo om 2D-scannen mogelijk te maken dit doel bereiken, maar zou extra optica en besturingsmechanica in het ontwerp moeten worden geïntegreerd32. We hebben meer details gegeven over wijzigingen aan het systeem op onze websitepagina, naast links naar andere nuttige bronnen met betrekking tot het ontwerpproces23.

Naast het verbeteren van de specifieke componenten voor dit specifieke ontwerp, zou het zeer goed mogelijk zijn om andere microscopietechnieken of -modaliteiten met hoge resolutie aan deze build toe te voegen. Een van die verbeteringen zou zijn om verlichting met meerdere golflengten op te nemen, wat zou inhouden dat extra excitatielasers worden uitgelijnd met het oorspronkelijke excitatiepad8. Bovendien, omdat dit type SOLS-ontwerp het monster toegankelijk laat, is het toevoegen van extra functies aan de microscoop, inclusief maar beperkt tot optisch pincet, microfluïdica en reometrie, relatief eenvoudig 2,33.

Vergeleken met de talloze light-sheet-handleidingen die zijn gepubliceerd, biedt dit protocol instructies op een begripsniveau dat een gebruiker zonder noemenswaardige optische ervaring nuttig kan vinden. Door een gebruiksvriendelijke SOLS-build met traditionele mogelijkheden voor het monteren van monsterglaasjes toegankelijk te maken voor een groter publiek, hopen we een nog verdere uitbreiding van de toepassingen van SOLS-gebaseerd onderzoek mogelijk te maken op alle gebieden waarin het instrument is of zou kunnen worden gebruikt. Zelfs nu de toepassingen van SOLS-instrumenten snel groeien in aantal 2,34,35, zijn wij van mening dat veel voordelen en toepassingen van SOLS-type instrumenten nog steeds onontgonnen zijn en uiten we ons verheugd over de mogelijkheden voor dit type instrument in de toekomst.

Light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) vertegenwoordigt een familie van fluorescentiebeeldvormingstechnieken met hoge resolutie waarbij het excitatielicht wordt gevormd tot een vel 1,2, waaronder selectieve vlakverlichtingsmicroscopie (SPIM), geveegde confocaal uitgelijnde planaire excitatie (SCAPE) en schuine vlakmicroscopie (OPM)3,4,5,6,7 . In tegenstelling tot andere microscopiemodaliteiten zoals epifluorescentie, totale interne reflectiefluorescentiemicroscopie (TIRFM) of confocale microscopie, is fototoxiciteit minimaal bij LSFM en kunnen monsters over langere tijdschalen worden afgebeeld omdat alleen het vlak van het monster dat actief wordt afgebeeld wordt verlicht 8,9,10. Daarom zijn LSFM-technieken uiterst nuttig voor het afbeelden van 3D-monsters over langere perioden, met name zelfs die welke te dik zijn voor confocale microscopietechnieken. Om deze redenen is LSFM sinds de oorspronkelijke ontwikkeling in 2004 de beeldvormingstechniek bij uitstek geworden voor veel fysiologen, ontwikkelingsbiologen en neurowetenschappers voor de visualisatie van hele organismen zoals levende zebravissen en Drosophila-embryo's 3,4,6,11 . In de afgelopen twee decennia zijn de voordelen van LSFM benut om structuur en dynamiek op steeds kleinere schalen te visualiseren, waaronder de weefselschaal11,12, cellulaire en subcellulaire schaal, zowel in vivo als in vitro 13,14,15,17.
Ondanks de meldingen van succesvolle use-cases in de literatuur, verhinderen de hoge kosten van commerciële LSFM-systemen (~0,25 miljoen USD op het moment van schrijven)18,19 het wijdverbreide gebruik van de techniek. Om doe-het-zelf-builds een haalbaar alternatief te maken voor onderzoekers, zijn er meerdere build-handleidingen gepubliceerd 8,13,20,21, waaronder de open-access-inspanning OpenSPIM 22. Tot op heden kunnen onderzoekers met minimale optische ervaring echter alleen eerdere LSFM-ontwerpen gebruiken, die niet compatibel zijn met traditionele op objectglaasjes gemonteerde monsters (Figuur 1A). Recente single-objective, light-sheet (SOLS) implementatie gebruikt een enkele doelstelling voor zowel de excitatie als de detectie (Figuur 1C), waardoor de beperking met betrekking tot compatibiliteit 5,6,8,13,20 wordt overwonnen. De kosten voor de veelzijdigheid van het SOLS-ontwerp zijn echter een aanzienlijke toename van de complexiteit van de constructie als gevolg van de vereiste van twee extra doelstellingen om het objectvlak op de camera door te geven, te de-kantelen en opnieuw af te beelden voor beeldvorming (Figuur 1D). Om de toegang tot de complexe opstellingen in SOLS-stijl te vergemakkelijken, presenteert dit artikel een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp, de bouw, het uitlijningsproces en het gebruik van een dia-compatibel SOLS-systeem, wat nuttig zou zijn voor onderzoekers met kennis van alleen een opticacursus op instapniveau.
Hoewel het protocol zelf beknopt is, moeten lezers tijdens de voorbereidingsstappen andere bronnen raadplegen om meer te weten te komen over bepaalde delen van het ontwerp of hardware-overwegingen. Als een lezer echter van plan is de specificaties van dit ontwerp te volgen, is het misschien niet nodig om te begrijpen hoe bepaalde optische componenten moeten worden geselecteerd.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig01.jpg"> Figuur 1: Kenmerken van verschillende LSFM-configuraties. (A) De opstelling met twee orthogonale objectieven die gebruikelijk zijn in vroege LSFM-ontwerpen. In deze configuratie wordt een capillair buisje of een cilinder met gel gebruikt om het monster te bevatten, wat niet compatibel is met traditionele technieken voor het monteren van objectglaasjes. (B) een schema van een SOLS-lichtplaatontwerp waarop het volgende is aangegeven: (C) het enige objectief dat wordt gebruikt voor zowel de excitatie als de emissieverzameling op het monstervlak (O1); hierdoor kan een traditionele slede bovenop worden gemonteerd, en (D) het relaisobjectiefsysteem in het SOLS-emissiepad. O2 vangt het emissielicht op en demagnifiert het beeld. O3 beeldt het vlak in de juiste kantelhoek af op de camerasensor. Afkortingen: LSFM = light-sheet fluorescentiemicroscopie; SOLS = lichtscherm met één objectief; O1-O3 = doelstellingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table><tbody><tr><td>1" Plano-Concave Lens f = -50 mm</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>LC1715-A-ML</td><td>Voor het uitlijnen van de laser Geschatte kosten: $49,5</td></tr><tr><td>1" Achromatische dubbellens f = 100 mm (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A-ML</td><td>L2, L4 en uitlijnlaser Geschatte kosten: $342,42</td></tr><tr><td>1" Achromatische dubbellens f = 125 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-125-A-ML</td><td>SL2 Geschatte kosten: $114,14</td></tr><tr><td>1" Achromatische dubbellens f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>L3 Geschatte kosten: $114,14</td></tr><tr><td>1" Achromatische dubbellens f = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A-ML</td><td>TL2 Geschatte kosten: $114,14</td></tr><tr><td>1" Achromatische dubbellens f = 45 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-045-A-ML</td><td>L1 Geschatte kosten: $114,14</td></tr><tr><td>1" Achromatische dubbellens f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-075-A-ML</td><td>SL1 Geschatte kosten: $114,14</td></tr><tr><td>1" Cilindrische lens f = 100 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1567RM</td><td>CL3 Geschatte kosten: $117,62</td></tr><tr><td>1" Cilindrische lens f = 200 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1653RM</td><td>CL2 Geschatte kosten: $111,22</td></tr><tr><td>1" Cilindrische lens f = 50 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1695RM</td><td>CL1 Geschatte kosten: $117,62</td></tr><tr><td>1" Gemonteerde pinhole, 30 µm pinhole diameter</td><td>Thorlabs</td><td>P30K</td><td>Geschatte kosten: $77,08</td></tr><tr><td>1" Zilveren spiegel (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>PF10-03-P01</td><td>M1, M2, één voor uitlijning Geschatte kosten: $168,78</td></tr><tr><td>2" Elliptische spiegel</td><td>Thorlabs</td><td>PFE20-P01</td><td>M3 Geschatte kosten: $179,98</td></tr><tr><td>2" Postsokkel (x11)</td><td>Thorlabs</td><td>PH2</td><td>Voor aangepaste lasermontage, ND-wiel, veiligheidsschermen Geschatte kosten: $98,45</td></tr><tr><td>2" Posts (x47)</td><td>Thorlabs</td><td>TR2</td><td>Voor aangepaste lasermontage en optische componenten Geschatte kosten: $277,3</td></tr><tr><td>3" Posts (x4)&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TR3</td><td>Voor M3-ondersteuningen en andere montages Geschatte kosten: $24,6</td></tr><tr><td>3" Postsokkel (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>PH3</td><td>Geschatte kosten: $38,48</td></tr><tr><td>30 tot 60 mm kooiadapter&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>LCP33</td><td>Om O1 te monteren Geschatte kosten: $45,42</td></tr><tr><td>30mm kooifilterwiel</td><td>Thorlabs</td><td>CFW6</td><td>Om ND-filters te monteren Geschatte kosten: $172,36</td></tr><tr><td>30mm kooiplaat (x6)</td><td>Thorlabs</td><td>CP33</td><td>Om kooi voor uitlijning en uitlijnlaser te bouwen Geschatte kosten: $114,54</td></tr><tr><td>30mm rechte hoek kinematische spiegelmontage (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>KCB1</td><td>Om M1 en M2 te monteren en voor uitlijnlaser Geschatte kosten: $463,95</td></tr><tr><td>4" Postsokkel (x30)</td><td>Thorlabs</td><td>PH4</td><td>Geschatte kosten: $320,1</td></tr><tr><td>561 nm laser en voeding&nbsp;</td><td>Opto Engine LLC</td><td>MGL-FN-561-100mW</td><td>Excitatilaser Geschatte kosten: $6000</td></tr><tr><td>60mm kooiplaat (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>LCP01</td><td>Om TL1 en M3-montage te monteren Geschatte kosten: $88,52</td></tr><tr><td>60mm rechte hoek kinematische spiegelmontage</td><td>Thorlabs</td><td>KCB2</td><td>Om M3 te monteren Geschatte kosten: $187,26</td></tr><tr><td>90° Flip-montage</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>TRF90</td><td>Voor uitlijnlaser Geschatte kosten: $95,5</td></tr><tr><td>Adapter met externe C-mount schroefdraad en interne SM1-schroefdraad</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A9</td><td>Om lensbuis met camera te verbinden Geschatte kosten: $20,96</td></tr><tr><td>Adapter met externe SM1-schroefdraad en interne C-mount schroefdraad</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A10</td><td>Om buislens met lensmontage te verbinden Geschatte kosten: $21,82</td></tr><tr><td>Adapter met externe SM1-schroefdraad en interne M25-schroefdraad (x2)</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A12</td><td>Om O1 en O2 te monteren Geschatte kosten: $47,06</td></tr><tr><td>Adapter met externe SM1-schroefdraad en interne M26-schroefdraad</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A27</td><td>Om O3 te monteren Geschatte kosten: $22,38</td></tr><tr><td>Uitlijningsschijf</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1A7</td><td>Geschatte kosten: $20,45</td></tr><tr><td>Uitlijningslaser</td><td>BISKEE</td><td></td><td>https://www.amazon.com/Tactical-Presentation-Teaching-Interactive-Adjustable/dp/B09B1VXPNM Geschatte kosten: $16,98</td></tr><tr><td>Autofluorescente plastic dia, rood&nbsp;</td><td>Chroma</td><td>92001</td><td>Geschatte kosten: $20</td></tr><tr><td>Stroboscoopslot&nbsp;</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>SM1SH1</td><td>Om laserlicht te blokkeren Geschatte kosten: $65,8</td></tr><tr><td>Kooi rotatiemontage (x3)</td><td>Thorlabs</td><td>CRM1T</td><td>Om CL1-3 te monteren Geschatte kosten: $282,15</td></tr><tr><td>Kooisysteem staven 1" (x8)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER1</td><td>Om M3 en O1 te monteren Geschatte kosten: $44,8</td></tr><tr><td>Kooisysteem staven 3" (x2)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER3</td><td>Om O3 te monteren Geschatte kosten: $14,28</td></tr><tr><td>Kooisysteem staven 4" (x4)</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>ER4</td><td>Om spleet te monteren Geschatte kosten:

ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Design and Building of a Customizable, Single-Objective, Light-Sheet Fluorescence Microscope for the Visualization of Cytoskeleton Networks

Gereconstitueerde cytoskeletcomposieten zijn naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem voor het bestuderen van niet-evenwichtszachte materie. Het getrouw vastleggen van de dynamiek van deze 3D, dichte netwerken vereist optische doorsnede, wat vaak wordt geassocieerd met fluorescentie-confocale microscopen. Recente ontwikkelingen op het gebied van light-sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM) hebben het echter bewezen als een kosteneffectief en soms superieur alternatief. Om LSFM toegankelijk te maken voor cytoskeletonderzoekers die minder bekend zijn met optica, presenteren we een stapsgewijze beginnershandleiding voor het bouwen van een veelzijdige light-sheet fluorescentiemicroscoop uit kant-en-klare componenten. Om monstermontage met traditionele objectglaasjes mogelijk te maken, volgt deze LSFM het single-objective light-sheet (SOLS)-ontwerp, dat gebruik maakt van een enkel objectief voor zowel de excitatie- als de emissieverzameling. We beschrijven de functie van elk onderdeel van de SOLS voldoende gedetailleerd om lezers in staat te stellen de instrumentatie aan te passen en te ontwerpen om aan hun specifieke behoeften te voldoen. Ten slotte demonstreren we het gebruik van dit op maat gemaakte SOLS-instrument door asters te visualiseren in kinesine-gedreven microtubuli-netwerken.

We voerden volumetrische scans uit van 1 μm kralen ingebed in gellangom. Figuur 14 toont de projecties van de maximale intensiteit van de symmetrische scans langs de x-, y- en z-richtingen.
<img alt="Figure 14" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig14.jpg"> Figuur 14: Volumetrische beeldvorming van 1 μm fluorescerende bolletjes in gellangom. Projecties van de maximale intensiteit van symmetrische scans worden getoond. Schaalbalken = 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig14large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
We hebben het gebruik van de single-objective, light-sheet microscoop gedemonstreerd om gereconstitueerde cytoskeletnetwerken te karakteriseren door volumetrische scans uit te voeren van monsters van microtubuli-asters. In het kort, rhodamine-gelabelde, taxol-gestabiliseerde microtubuli werden gepolymeriseerd uit gereconstitueerde dimeren door GTP; vervolgens, na polymerisatie, werden op streptavidine gebaseerde kinesinemotorclusters gemengd in monsters samen met ATP voor eindconcentraties van 6 μM microtubuli, 0,5 μM kinesinedimeren en 10 mM ATP. Uitgebreide protocollen en handleidingen voor de bereiding van taxol-gestabiliseerde microtubuli en kinesinemotorclusters zijn te vinden op de websites van Mitchson Lab en Dogic Lab25,26. De monsters werden voorzichtig in microscoopglaasjes gepipetteerd, verzegeld en 8 uur laten zitten voordat ze werden afgebeeld om de motorische activiteit te laten stoppen, zodat de monsters een stabiele structurele toestand bereikten die op asters leek.
Studies van gereconstitueerde cytoskeletsystemen maken meestal gebruik van confocale of epifluorescentiemicroscopie om gelabelde filamenten in beeld te brengen. Beide technieken zijn echter beperkt in hun vermogen om dichte 3D-monsters in beeld te brengen27. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt in het in vitro onderzoek naar actieve materie op basis van cytoskeletten door monsters te beperken tot quasi2D 28,29, zijn cytoskeletnetwerken inherent 3D, en veel van de huidige inspanningen liggen in het begrijpen van de effecten die alleen kunnen optreden in 3D-monsters29,30, waardoor er behoefte ontstaat aan 3D-beeldvorming met hoge resolutie.
<img alt="Figure 15" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65411/65411fig15.jpg"> Figuur 15: Facilitering van de 3D-visualisatie van gereconstitueerde cytoskeletmonsters door middel van single-objective light-sheet microscopie. (A) Beelden van fluorescerende microtubuli asters verkregen met een Leica DMi8 confocale microscoop met laserscanning. De afbeeldingen tonen verschillende vlakken van een z-scan. Schaalbalk = 30 μm. (B) Gedeconvolueerde scheefgetrokken beelden van een volumetrische scan uitgevoerd op de single-objective light-sheet opstelling van hetzelfde monster. Schaalbalk = 30 μm. Het rechtlijnige beeldgebied komt hier overeen met de bruikbare FoV (gele doos) die in figuur 13B wordt getoond. Terwijl het confocale uitblinkt in het afbeelden van enkele vlakken in de buurt van het dekglaasje, introduceert de dichtheid van het fluorescerende monster complicaties bij beeldvorming op hogere vlakken als gevolg van het extra signaal van onder het beeldvormingsvlak. De lichtplaat omzeilt dit probleem door alleen het beeldvlak te verlichten, waardoor een uniform scherpe beeldvorming op verschillende vlakken in z mogelijk is. Afkortingen: SOLS = single-objective light-sheet; FoV = gezichtsveld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65411/65411fig15large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
In figuur 15 demonstreren we de volumetrische beeldvorming van een gereconstitueerd microtubuli-netwerk dat door kinesinemotorclusters is samengetrokken tot asterachtige structuren. Zoals aangetoond in eerder onderzoek 28,31, hebben deze 3D-structuren de neiging om dicht naar het centrum toe te groeien, wat resulteert in heldere fluorescentiegebieden die overheersend zijn in het signaal. In beeldvormingsvlakken in de buurt van het dekglaasje (laag z-niveau) kan confocale microscopie (figuur 15A) enkele filamenten rond de periferie van de aster oplossen, met extra achtergrond naar het midden als gevolg van onscherpe fluorescentiesignalen van bovenaf. Het verplaatsen van een paar micron in z vermindert echter snel de kwaliteit van de beelden omdat de onscherpe dichte delen van de aster overheersend zijn in het signaal in het beeldvlak. De enkelvlaksverlichting van de lichtplaat (figuur 15B) elimineert de onscherpe signalen van de dichte delen van de aster boven en onder het beeldvlak, waardoor een vergelijkbare beeldkwaliteit tussen de vlakken mogelijk is. Het vermogen van de lichtplaat om hoogwaardige, betrouwbare volumetrische scangegevens te produceren, opent de mogelijkheid om 3D-fenomenen in gereconstitueerde cytoskeletsystemen te visualiseren en te karakteriseren.

Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Reconstituted cytoskeleton composites have emerged as a valuable model system for studying non-equilibrium soft matter. The faithful capture of the ...

Ons werk is gericht op het vergroten van de kennis over de relatie tussen transwerkdynamiek, lokale structuur en mechanische eigenschappen in materialen die ver van evenwicht zijn. Het visualiseren van materialen die ver van evenwicht zijn, zoals cytoskeletnetwerken, vereist het vermogen om dichte, driedimensionale monsters met een vergelijkbare beeldkwaliteit over het hele volume van het monster in beeld te brengen, terwijl ze minimale schade veroorzaken via fotobleken, een technisch uitdagende taak waarvoor fluorescentielichtbladmicroscopie het meest geschikt is. Fluorescentie-lichtbladmicroscoopsystemen bieden uitstekende optische sectiemogelijkheden, waardoor deze dikke, driedimensionale monsters op lange tijdschalen kunnen worden afgebeeld met minimale fotobleking.Met name het lichtvelsysteem met één objectief dat we zullen presenteren, is compatibel met traditionele op dia's gemonteerde monsters, waardoor het een zeer veelzijdig hulpmiddel is. De overgrote meerderheid van de lichtbladgeleiders met één objectief zijn geschreven voor gebruikers met uitgebreide optische ervaring. Om de complexe opstelling in de stijl van een lichtscherm met één objectief toegankelijker te maken, biedt deze gedetailleerde gids stappen die een gebruiker met een instapcursus optica kan volgen.

design-building-customizable-single-objective-light-sheet

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In veel biologische en klinische situaties is het voordelig om cellulaire processen te bestuderen als ze zich ontwikkelen in hun eigen micro-omgeving. Hier beschrijven we de montage en het gebruik van een low-cost fiber-optische microscoop, die real-time beeldvorming kan bieden in celkweek, dierproeven en klinische studies de patiënt.

Hoge-resolutie Fiber-optic Microendoscopy voor In situ Cellular Imaging

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Dit protocol beschrijft de installatie van een lichte plaat microscoop en de uitvoering ervan in vivo beeldvorming van C. elegans embryo's.

Het opzetten van een eenvoudige Light Sheet Microscope voor<em&gt; In Toto</em&gt; Beeldvorming van<em&gt; C. elegans</em&gt; Ontwikkeling

Een module voor enkel vlak verlichting microscopie (SPIM) beschreven die gemakkelijk wordt aangepast om een ​​omgekeerde wide-field microscoop en geoptimaliseerd voor 3-dimensionale celculturen. Het monster is gelegen in een rechthoekige capillaire en via een microfluïdische systeem fluorescente kleurstoffen kunnen farmaceutische middelen of geneesmiddelen in kleine hoeveelheden worden toegepast.

Single Plane Verlichting Module en Micro-capillaire Aanpak voor een Wide-field microscoop

Hier wordt de bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde planaire glas-ondersteunde lipide bilayers, de bepaling van eiwitmobiliteit binnen en de meting van eiwitdichtheden getoond. Een routekaart voor het bouwen van een ruisonderdrukte Total Internal Reflection microscoop wordt geschetst, die het mogelijk maakt om enkele bilayer-residente fluorochromen met hoge ruimtelijk-temporele resolutie te visualiseren.

Single Molecule Fluorescentie Microscopie op Ondersteunde Planar dubbellagen

Hier beschrijven we een microscopie-aanpak van lichte lakens om het cardiale CD45 + leukocyten infiltraat te visualiseren in een muizenmodel van aseptische fulminante myocarditis, die wordt geïnduceerd door de intratracheale difterie toxine behandeling van CD11c.DTR muizen.

Kwantitatieve visualisatie van leukocytinfectiet in een muizenmodel van Fulminant-myocarditis door middel van lichte microscopie

Afbeelden van de morfogenese van insecten embryo met licht-sheet based fluorescentiemicroscopie is state of the art worden. Dit protocol beschrijft en vergelijkt drie montagetechnieken geschikt voor Tribolium castaneum embryo, worden twee nieuwe op maat gemaakte transgene lijnen geschikt voor levende imaging bespreekt essentiële kwaliteitscontroles en geeft de huidige experimentele beperkingen.

Light-Sheet gebaseerd fluorescentiemicroscopie van de levens- of gefixeerd en gekleurd<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryo&#39;s

Hier beschrijven we een protocol voor het visualiseren van motor neuron projectie en axon arborization in transgene Hb9::GFP muis embryo's. Na immunokleuring voor motorische neuronen, we gebruikten licht blad fluorescentie microscopie op afbeelding embryo's voor verdere kwantitatieve analyse. Dit protocol is van toepassing op andere neuron navigatie processen in het centrale zenuwstelsel.

Visualisatie van Motor Axon navigatie en kwantificering van Axon Arborization In muis embryo's met behulp van licht blad fluorescentie microscopie

Deze studie gebruikt een tweezijdig verlichting licht vel fluorescentie microscopie (LSFM) techniek gecombineerd met optische clearing om te studeren het lymfkliertest hart.

Licht vel fluorescentie microscopie voor de studie van het lymfkliertest hart

Een gedetailleerde instructies wordt beschreven op het bouwen van een sterk geneigd geveegd Tegel (HIST.) Microscoop en het gebruik ervan voor single-molecuul imaging.

Een gids voor het bouwen van een sterk geneigd geveegd tegel Microscoop voor uitgebreide veld-of-view Single-molecuul Imaging

Op lichtplaten gebaseerde fluorescentiemicroscopie is het meest waardevolle hulpmiddel in de ontwikkelingsbiologie. Een belangrijk probleem in vergelijkende studies is de variantie van de omgeving. Ons protocol beschrijft een experimenteel kader voor gelijktijdige live beeldvorming van meerdere specimens en pakt dit probleem daarom proactief aan.

Gelijktijdige live beeldvorming van meerdere insectenembryo's in op de kamer gebaseerde fluorescentiemicroscopen

Leer hoe je een aanpasbare single-objectief light-sheet fluorescentiemicroscoop bouwt voor visualisatie van cytoskeletnetwerken. Deze methode minimaliseert fotobleking en biedt uitstekende optische sectie in dichte 3D-samples.

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken (Video) | JoVE Journal

Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken

Meer video's verkennen