Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken
January 26th, 2024
Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.
Ons werk is gericht op het vergroten van de kennis over de relatie tussen transwerkdynamiek, lokale structuur en mechanische eigenschappen in materialen die ver van evenwicht zijn. Het visualiseren van materialen die ver van evenwicht zijn, zoals cytoskeletnetwerken, vereist het vermogen om dichte, driedimensionale monsters met een vergelijkbare beeldkwaliteit over het hele volume van het monster in beeld te brengen, terwijl ze minimale schade veroorzaken via fotobleken, een technisch uitdagende taak waarvoor fluorescentielichtbladmicroscopie het meest geschikt is. Fluorescentie-lichtbladmicroscoopsystemen bieden uitstekende optische sectiemogelijkheden, waardoor deze dikke, driedimensionale monsters op lange tijdschalen kunnen worden afgebeeld met minimale fotobleking.
Met name het lichtvelsysteem met één objectief dat we zullen presenteren, is compatibel met traditionele op dia's gemonteerde monsters, waardoor het een zeer veelzijdig hulpmiddel is. De overgrote meerderheid van de lichtbladgeleiders met één objectief zijn geschreven voor gebruikers met uitgebreide optische ervaring. Om de complexe opstelling in de stijl van een lichtscherm met één objectief toegankelijker te maken, biedt deze gedetailleerde gids stappen die een gebruiker met een instapcursus optica kan volgen.
Overzicht
Deze studie heeft tot doel het begrip van de dynamischen van transwerk binnen ver-van-evenwicht materialen te verbeteren, met een specifieke focus op cytoskeletnetwerken. Het onderzoek beschrijft de constructie en toepassing van een enkel-objectief lichtblad-fluorescentiemicroscoop voor optimale visualisatie van deze dichte driedimensionale monsters.
Belangrijke studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Microscopie
- Ver-van-evenwicht materialen
Achtergrond
- Uitdagingen bij het beeldvormen van dichte driedimensionale biologische monsters
- Belang van het minimaliseren van fotobleken tijdens lange beeldvormingssessies
- Voordelen van lichtblad-microscopie voor optische secties
Gebruikte methoden
- Constructie van een enkel-objectief lichtblad-fluorescentiemicroscoop
- Gebruik van met rodamine gelabelde microtubulus testmonsters
- Uitlijnings- en kalibratieprocedures voor optimale beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van cytoskeletnetwerken
- Demonstratie van minimale schade aan monsters tijdens beeldvorming
- Effectieve beeldvorming over verschillende diepten in het monster
Conclusies
- Het protocol presenteert een haalbare benadering voor het beeldvormen van complexe biologische structuren
- Deze methode kan onderzoekers aanzienlijk helpen bij het bestuderen van mechanisch actieve biologische materialen
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
High-resolution visualization of dense, three-dimensional cytoskeleton networks is critical for early discovery and mechanistic de-risking in cell biology-driven drug discovery. The customizable single-objective light-sheet fluorescence microscope (SOLS) enables reproducible, low-photobleaching imaging of complex biological assemblies, supporting predictive confidence in target validation and phenotypic screening. This accessible instrumentation bridges the gap between advanced optical sectioning and practical R&D workflows, enhancing portfolio decision-making at the discovery inflection point.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of cytoskeletal dynamics in reconstituted model systems for hypothesis testing.
- Supports mechanistic de-risking by providing high-fidelity, volumetric imaging of non-equilibrium biological structures.
- Facilitates functional target validation through quantitative, reproducible imaging outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 3D biological systems for downstream phenotypic screening workflows.
- Delivers standardized, quantitative optical sectioning data for assay reproducibility.
- Enables reliable evaluation of compound effects on cytoskeletal architecture in dense samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant cytoskeletal phenotypes in translational models.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust, longitudinal imaging studies.
- Reduces risk in advancing candidates by clarifying biological mechanisms in complex systems.
Pipeline & Workflow Integration
The SOLS microscope integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative imaging of 3D cytoskeleton models, supporting both hypothesis-driven research and scalable assay development.
- Discovery Biology: Provides optical sectioning for hypothesis testing and pathway clarification in dense biological assemblies.
- Screening: Offers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for assay standardization and compound screening.
- Analytics: Generates volumetric and time-lapse data for comparative analysis of experimental conditions.
- Translational Research: Connects imaging phenotypes to disease-relevant mechanisms when applied to appropriate models.
- Enterprise Reuse: The modular design supports adaptation across diverse biological systems and research teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cytoskeleton-targeted research.
- Operational Value: Promotes standardization, reproducibility, and scalability in imaging workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust, low-artifact data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires foundational optics knowledge and careful alignment of optical components.
- Needs access to standard microscopy instrumentation and analytical software for image processing.
- Demands cross-team standardization for reproducible imaging and data interpretation.
- Adaptable to various model systems with appropriate calibration and sample preparation.
- Practical limitations include alignment complexity and the need for sample compatibility with slide-based mounting.
