Ontwerp en bouw van een aanpasbare, single-objectief, light-sheet fluorescentiemicroscoop voor de visualisatie van cytoskeletnetwerken
26 januari 2024
Dit protocol beschrijft in detail hoe een fluorescentiemicroscoop met één objectief en lichtvel kan worden gebouwd en hoe deze kan worden gebruikt voor het visualiseren van cytoskeletnetwerken.
Ons werk is gericht op het vergroten van de kennis over de relatie tussen transwerkdynamiek, lokale structuur en mechanische eigenschappen in materialen die ver van evenwicht zijn. Het visualiseren van materialen die ver van evenwicht zijn, zoals cytoskeletnetwerken, vereist het vermogen om dichte, driedimensionale monsters met een vergelijkbare beeldkwaliteit over het hele volume van het monster in beeld te brengen, terwijl ze minimale schade veroorzaken via fotobleken, een technisch uitdagende taak waarvoor fluorescentielichtbladmicroscopie het meest geschikt is. Fluorescentie-lichtbladmicroscoopsystemen bieden uitstekende optische sectiemogelijkheden, waardoor deze dikke, driedimensionale monsters op lange tijdschalen kunnen worden afgebeeld met minimale fotobleking.
Met name het lichtvelsysteem met één objectief dat we zullen presenteren, is compatibel met traditionele op dia's gemonteerde monsters, waardoor het een zeer veelzijdig hulpmiddel is. De overgrote meerderheid van de lichtbladgeleiders met één objectief zijn geschreven voor gebruikers met uitgebreide optische ervaring. Om de complexe opstelling in de stijl van een lichtscherm met één objectief toegankelijker te maken, biedt deze gedetailleerde gids stappen die een gebruiker met een instapcursus optica kan volgen.
Overzicht
Deze studie beoogt het begrip van trans-werkdynamiek binnen materialen ver uit equilibrium te verbeteren, met een specifieke focus op cytoskeletnetwerken. Het onderzoek beschrijft de constructie en toepassing van een single-objective light-sheet fluorescentiemicroscoop voor optimale visualisatie van deze dichte driedimensionale monsters.
Belangrijkste componenten van de studie
Onderzoeksgebied
- Celbiologie
- Microscopie
- Materialen ver uit equilibrium
Achtergrond
- Uitdagingen bij het beelden van dichte driedimensionale biologische monsters
- Het belang van het minimaliseren van fotobleken tijdens lange beeldingssessies
- Voordelen van light-sheet microscopie voor optische sectieering
Gebruikte methoden
- Constructie van een lichtblad fluorescentiemicroscoop met één objectief
- Gebruik van rhodamine-gelabelde microtubuli-testmonsters
- Uitlijnings- en kalibratieprocedures voor optimale beeldvorming
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van cytoskeletnetwerken
- Demonstratie van minimale schade aan monsters tijdens beeldvorming
- Effectieve beeldvorming op verschillende dieptes in het monster
Conclusies
- Het protocol presenteert een haalbare aanpak voor het in beeld brengen van complexe biologische structuren
- Deze methode kan onderzoekers aanzienlijk ondersteunen bij het bestuderen van mechanisch actieve biologische materialen
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Hoge-resolutie visualisatie van dichte, driedimensionale cytoskeletnetwerken is cruciaal voor vroege ontdekking en mechanistische risicoreductie bij geneesmiddelenonderzoek gedreven door celbiologie. De aanpasbare single-objective light-sheet fluorescentiemicroscoop (SOLS) maakt reproduceerbare beeldvorming met weinig fotobleken van complexe biologische complexen mogelijk, wat bijdraagt aan de voorspellende betrouwbaarheid bij doelwitvalidatie en fenotypische screening. Deze toegankelijke instrumentatie overbrugt de kloof tussen geavanceerde optische sectieering en praktische R&D-workflows, waardoor de besluitvorming over portfolio's bij het kritieke punt van ontdekking wordt verbeterd.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe visualisatie van cytoskeletale dynamiek in gereconstitueerde modelsystemen mogelijk voor hypotheseonderzoek.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door middel van getrouwe, volumetrische beeldvorming van biologische structuren in niet-evenwichtstoestanden.
- Faciliteert functionele target-validatie via kwantitatieve, reproduceerbare beeldvormingsresultaten.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde 3D biologische systemen voor voor downstream fenotypische screeningworkflows.
- Levert gestandaardiseerde, kwantitatieve optische sectiegegevens voor reproduceerbaarheid van de assay.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van compound-effecten op de cytoskeletale architectuur in dichte monsters mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt beeldvormingsresultaten uit met ziekterelateerde cytoskeletfenotypen in translationele modellen.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door robuuste, longitudinale beeldvormingsstudies mogelijk te maken.
- Vermindert het risico bij het verder ontwikkelen van kandidaten door biologische mechanismen in complexe systemen te verduidelijken.
Integratie van pipeline en workflow
De SOLS-microscoop integreert in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door kwantitatieve beeldvorming van 3D-cytoskeletmodellen mogelijk te maken, wat zowel hypothesegestuurd onderzoek als schaalbare assay-ontwikkeling ondersteunt.
- Discovery Biology: Biedt optische sectie voor hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking in dichte biologische structuren.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve imaging-outputs die geschikt zijn voor assay-standaardisatie en compound-screening.
- Analytics: Genereert volumetrische en time-lapse-data voor comparatieve analyse van experimentele condities.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt imaging-fenotypes met ziekterelevante mechanismen wanneer toegepast op passende modellen.
- Enterprise Reuse: Het modulaire ontwerp ondersteunt adaptatie over diverse biologische systemen en onderzoeksteams.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in onderzoek gericht op het cytoskelet.
- Operationele waarde: Bevordert standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid in imaging-workflows.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door het mogelijk maken van robuuste datageneratie met minimale artefacten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering en bevordering van activa in de ontdekkingsfase.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist basiskennis van optica en een zorgvuldige uitlijning van optische componenten.
- Vereist toegang tot standaard microscopie-instrumentatie en analytische software voor beeldbewerking.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor reproduceerbare beeldvorming en data-interpretatie.
- Aanpasbaar aan diverse modelsystemen met de juiste kalibratie en monstervoorbereiding.
- Praktische beperkingen omvatten de complexiteit van de uitlijning en de noodzaak van monstercompatibiliteit met montage op objectglazen.
