Name: Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Leer haarworteltransformatie bij sojabonen voor genfunctieanalyse met behulp van CRISPR-Cas9 en RNA-interferentie. Deze methode maakt gelijktijdig onderzoek naar meerdere genen en polygenische netwerken mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) subsidienummer RGPIN-2020-06111 en door een genereuze donatie van Brad Lace. We willen Wayne Parrott (University of Georgia) bedanken voor de K599 Agrobacterium en het voorlopige protocol, en het Nakagawa & Hachiya lab (Shimane University) voor de lege vectoren pGWB2, pGWB6 en pANDA35HK.

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om alle stappen van de procedure onder steriele omstandigheden uit te voeren.
1. Sojazaadsterilisatie
<ol><li>Plaats in een bioveiligheidskast 16-20 ronde Williams 82 sojabonenzaden in onberispelijke staat (d.w.z. geen scheuren of vlekken) in een centrifugebuis van 50 ml.</li>
	<li>Voeg 30 ml 70% isopropylalcohol toe, schud zachtjes gedurende 30 s en decanteer vervolgens de alcohol.</li>
	<li>Schud de zaden voorzichtig met 30 ml 10% bleekmiddel gedurende 10 s en laat de zaden 5 minuten in de oplossing zitten bij kamertemperatuur (RT, 25 °C). Giet na 5 minuten het bleekmiddel af.</li>
	<li>Herhaal het schudden drie keer met 30 ml steriele ultrazuivere H 2 O gedurende1 minuut per spoeling en gooi de H2O tussen elke spoeling weg.</li>
	<li>Plaats de gesteriliseerde zaden op filtreerpapier verzadigd met 5 ml kiem- en co-cultivatie (GC) medium (autoclaaf halfsterkte vloeibare Murashige en Skoog [MS] medium met 1% sucrose [pH = 5,8] en voeg vervolgens 2,5 ml / L vitamines toe) in steriele petrischaaltjes.</li>
	<li>Plaats de platen gedurende 3 dagen in het donker bij RT (25 °C) voordat u de platen gedurende 4 dagen bij 22 °C onder 16 h koelwitte T5-fluorescentielampen (100 μE m-2·s-1) overbrengt om de zaden te laten ontkiemen. OPMERKING: Gooi zaden weg die gerimpeld of gebarsten zijn. De beste zaden zijn die welke groot en uniform geel zijn. Steriliseer ten minste het dubbele van het aantal zaden dat nodig is voor het experiment om zaden van goede kwaliteit te selecteren, omdat sommige zaden mogelijk niet optimaal zijn vanwege schade, ziekten of het niet ontkiemen.</li>
</ol>2. Infectie van zaadlobben met K599
OPMERKING: Gebruik vectoren uit de pGWB-serie, omdat hun dubbele selectie zorgt voor genomische integratie van de gehele T-DNA-cassette. Elektroporatie werd gebruikt om een binaire vector met het gen van belang om te zetten in A. rhizogenes pRi265918.
<ol><li>Ontwerp op basis van de sequentie van het A. rhizogenes pRi2659 plasmide18 primers om het Ti plasmide gen VirD2 (VirD2 forward: 5'-CCCGATCGAGCTCAAGTTAT-3' te detecteren; VirD2 omgekeerd: 5'-TCGTCTGGCTGACTTTCGT-3'; verwachte versterkingsgrootte: 221 bp). Test na transformatie de Agrobacterium-kolonies op het behoud van VirD2 door polymerasekettingreactie (PCR) met behulp van een PCR-kit (zie materiaaltabel). PCR-cyclus: 94 °C gedurende 3 minuten; 35 cycli (94 °C gedurende 1 min, 58 °C gedurende 30 sec, 72 °C gedurende 1 min); en 72 °C gedurende 10 min.</li>
	<li>Na de selectie van de A. rhizogenes-kolonie die zowel VirD2 als het gen van belang (GOI) bevat, streept u wat uit op Luria-Bertani (LB) mediumplaten met de juiste antibiotica (50 mg / L) voor het plasmide van belang en incubeert u 's nachts bij 30 °C. Als u spectinomycine gebruikt, voeg dan een concentratie van 100 mg / L toe.</li>
	<li>Gebruik een P200-pipetpunt om een lengte van ~ 1,5 cm van de K599 Agrobacterium van de LB-platen af te schrapen en de cellen te resuspenderen in 1 ml fosfaatbuffer (PB; 0,01 M Na2HPO4, 0,15 M NaCl, pH 7,5).</li>
	<li>Verdun de Agrobacterium in gesteriliseerde, ultrazuivere H2O (v/v = 1:1) en acetosyringon (AS; 100 mM voorraad in dimethylsulfoxide [DMSO], v/v = 1:1000). Meet de absorptie met behulp van een cuvettebuis met een optische dichtheid van 600 nm (OD600). Het verwachte optimale bereik ligt tussen 0,5 en 0,8.</li>
	<li>Dompel in een bioveiligheidskast een gesteriliseerd scalpel in de K599 Agrobacterium-oplossing en maak verschillende 1 mm diepe sneden langs het binnenoppervlak (adaxiale, platte kant) van de zaadlob. Gebruik tijdens de inenting een gesteriliseerde tang om de zaadlob te stabiliseren.</li>
	<li>Leg ongeveer 6-8 zaadlobben die met de zijkant zijn gesneden op een petrischaaltje met filterpapier verzadigd met GC-medium met AS. OPMERKING: Om 6 platen te bereiden, is 50 ml GC-medium en 50 μL 100 mM AS om een eindconcentratie van 100 μM te bereiken voldoende.</li>
	<li>Incubeer de platen bij RT (25 °C) gedurende 3 dagen onder een fotoperiode van 16 uur (~65 μE).</li>
	<li>Breng de geïnfecteerde zaadlobben over op harige wortelgroeiplaten (HRG) (autoclaaf halfsterkte MS met 3% sucrose [pH = 5,8] en 2,6 g / L Gelzan, voeg vervolgens 2,5 ml / L vitaminemengsel en 500 mg / L timentine toe). OPMERKING: Er waren enkele problemen met timentin van sommige alternatieve leveranciers, waarvan de K599 niet werd geëlimineerd. Het wordt aanbevolen om hogere petrischaalplaten (100 mm x 25 mm) te gebruiken voor HRG-medium.</li>
	<li>Incubeer de HRG-platen bij 22 °C in een groeikamer met de parameters ingesteld op 100 μE licht op een fotoperiode van 16 uur totdat primaire wortels met secundaire wortels van 2-3 cm lang worden waargenomen (~ 3-4 weken).</li>
</ol>3. Selectie en oogsten van HRs
<ol><li>Oogst primaire wortels (5-7 cm lang) die uit het eelt groeien en secundaire wortels bevatten (2-3 cm lang) met behulp van een steriel scalpel en een tang. Breng HRG-platen met de juiste antibiotica over op selectie. Laat de HRs nog 5 dagen groeien op de selectie HRG-platen. OPMERKING: Kanamycine (50 mg / L), hygromycine (50 mg / L), of fosfinothricine (10 mg / L) worden meestal gebruikt voor selectie. Voor expressievectoren wordt pGWB2 gebruikt voor overexpressie, pANDA35HK wordt gebruikt voor RNAi-uitschakeling, pGWB6 wordt gebruikt voor subcellulaire lokalisatie en pMDC7 wordt gebruikt voor induceerbare expressie.</li>
	<li>Oogst op dag 5 transgene HRs met secundaire wortels van 3-6 cm lang. Bij het waarnemen van fluorescerende eiwitten hebben de secundaire wortels weinig autofluorescentie. Als u elicitor- of chemische behandelingen uitvoert, snijdt u de secundaire wortels in stukken van 1 cm en plaatst u ~ 100 mg op HRG-agar op een stapel. Verzadig vervolgens de palen met 80 μL van de juiste behandeling en laat de platen incuberen bij RT (25 °C).</li>
	<li>Ga na de gewenste behandelingstijd verder met RNA- of metabolietextracties.</li>
	<li>Voor RNA, dep de wortels snel droog op een gesteriliseerde papieren handdoek en oogst ze rechtstreeks in een microcentrifugebuis van 2 ml.</li>
	<li>Sluit onmiddellijk de bovenkant van de buis af met parafilm, maak twee kleine gaatjes met een puntige tang en dompel de buizen onder in vloeibare stikstof. Lyofileer gedurende 3 dagen en bewaar de monsters vervolgens bij -80 °C. OPMERKING: Het is essentieel om HRs te selecteren die wit zijn. Na 5 dagen groei op de selectieve plaat blijven transgene HRs wit, maar niet-transgene wortels worden bruin.</li>
</ol>

Zeer efficiënte productie van transgene harige wortels van sojabonen

<ol><li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transformation+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).</li>
<li>Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbiosis+of+soybean+with+nitrogen+fixing+bacteria+affected+by+root+lesion+nematodes+in+a+density-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria affected by root lesion nematodes in a density-dependent manner.</a> Scientific Reports. 10, 1619(2020).</li>
<li>Huang, X. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizosphere+interactions%3A+root+exudates%2C+microbes%2C+and+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Botany%22%5BJournal%5D)">Rhizosphere interactions: root exudates, microbes, and microbial communities.</a> Botany. 92 (4), 267-275 (2014).</li>
<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+genetic+transformation+and+applications+in+citrus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation and applications in citrus.</a> Frontiers in Plant Science. 13, 1039094(2022).</li>
<li>Hwang, H. -H., Yu, M., Lai, E. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+plant+transformation%3A+biology+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22The+Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated plant transformation: biology and applications.</a> The Arabidopsis Book. 15, e0186(2017).</li>
<li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+cultures-a+versatile+tool+with+multiple+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root cultures-a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33(2020).</li>
<li>Ono, N. N., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multiplicity+of+hairy+root+cultures%3A+prolific+possibilities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The multiplicity of hairy root cultures: prolific possibilities.</a> Plant Science. 180 (3), 439-446 (2011).</li>
<li>Kereszt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+of+soybean+to+study+root+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology.</a> Nature Protocols. 2 (4), 948-952 (2007).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+hairy+roots+produced+in+vitro+by+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Crop+Journal%22%5BJournal%5D)">Soybean hairy roots produced in vitro by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation.</a> The Crop Journal. 6 (2), 162-171 (2018).</li>
<li>Song, J., Tóth, K., Montes-Luz, B., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soybean+hairy+root+transformation%3A+a+rapid+and+highly+efficient+method%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soybean hairy root transformation: a rapid and highly efficient method.</a> Current Protocols. 1 (7), e195(2021).</li>
<li>Fattahi, F., Shojaeiyan, A., Palazon, J., Moyano, E., Torras-Claveria, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl-%CE%B2-cyclodextrin+and+coronatine+as+new+elicitors+of+tropane+alkaloid+biosynthesis+in+Atropa+acuminata+and+Atropa+belladonna+hairy+root+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Physiologia+Plantarum%22%5BJournal%5D)">Methyl-β-cyclodextrin and coronatine as new elicitors of tropane alkaloid biosynthesis in Atropa acuminata and Atropa belladonna hairy root cultures.</a> Physiologia Plantarum. 172 (4), 2098-2111 (2021).</li>
<li>Farrell, K., Jahan, M., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mechanisms+of+biotic+and+chemical+elicitors+enable+additive+elicitation+of+the+anticancer+Phytoalexin+Glyceollin+I%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Distinct mechanisms of biotic and chemical elicitors enable additive elicitation of the anticancer Phytoalexin Glyceollin I.</a> Molecules. 22 (8), 1261(2017).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+Agrobacterium+rhizogenes-mediated+hairy+root+transformation+for+gene+functional+and+gene+editing+analysis+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation for gene functional and gene editing analysis in soybean.</a> Plant Methods. 17 (1), 73(2021).</li>
<li>Arora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+proximity-dependent+biotinylation+approaches+in+different+plant+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems.</a> Plant Cell. 32 (11), 3388-3407 (2020).</li>
<li>Gomes, C., Dupas, A., Pagano, A., Grima-Pettenati, J., Paiva, J. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hairy+root+transformation%3A+a+useful+tool+to+explore+gene+function+and+expression+in+Salix+spp.+recalcitrant+to+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Hairy root transformation: a useful tool to explore gene function and expression in Salix spp. recalcitrant to transformation.</a> Frontiers in Plant Science. 10, 1427(2019).</li>
<li>Ahmed, S., Kovinich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+phytoalexin+biosynthesis+for+agriculture+and+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of phytoalexin biosynthesis for agriculture and human health.</a> Phytochemistry Reviews. 20, 483-505 (2021).</li>
<li>Walker, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceollins+trigger+anti-proliferative+effects+in+hormone-dependent+aromatase-inhibitor-resistant+breast+cancer+cells+through+the+induction+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Glyceollins trigger anti-proliferative effects in hormone-dependent aromatase-inhibitor-resistant breast cancer cells through the induction of apoptosis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 23 (5), 2887(2022).</li>
<li>Tong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+genome+sequence+of+cucumopine-type+Agrobacterium+rhizogenes+strain+K599+%28NCPPB2659%29%2C+a+nature%27s+genetic+engineer+inducing+hairy+roots%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Agriculture+Biology%22%5BJournal%5D)">The complete genome sequence of cucumopine-type Agrobacterium rhizogenes strain K599 (NCPPB2659), a nature's genetic engineer inducing hairy roots.</a> International Journal of Agriculture Biology. 20 (5), 1167-1174 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+dissects+incomplete+activation+of+phytoalexin+biosynthesis+by+the+soybean+transcription+factors+GmMYB29A2+and+GmNAC42-1%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq dissects incomplete activation of phytoalexin biosynthesis by the soybean transcription factors GmMYB29A2 and GmNAC42-1.</a> Plants. 12 (3), 545(2023).</li>
<li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyceollin+transcription+factor+GmMYB29A2+regulates+soybean+resistance+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Glyceollin transcription factor GmMYB29A2 regulates soybean resistance to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 183 (2), 530-546 (2020).</li>
<li>Jahan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NAC+family+transcription+factor+GmNAC42-1+regulates+biosynthesis+of+the+anticancer+and+neuroprotective+glyceollins+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">The NAC family transcription factor GmNAC42-1 regulates biosynthesis of the anticancer and neuroprotective glyceollins in soybean.</a> BMC Genomics. 20, 149(2019).</li>
<li>Nguyen, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+uricase+and+xanthine+dehydrogenase+in+soybean+nitrogen+fixation+and+nodule+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Genome%22%5BJournal%5D)">Critical role for uricase and xanthine dehydrogenase in soybean nitrogen fixation and nodule development.</a> The Plant Genome. , e20171(2021).</li>
<li>Brear, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GmVTL1a+is+an+iron+transporter+on+the+symbiosome+membrane+of+soybean+with+an+important+role+in+nitrogen+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">GmVTL1a is an iron transporter on the symbiosome membrane of soybean with an important role in nitrogen fixation.</a> New Phytologist. 228 (2), 667-681 (2020).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+transcription+factor+GmTGA15+enhances+drought+tolerance+in+transgenic+soybean+hairy+roots+and+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Agronomy%22%5BJournal%5D)">Overexpression of transcription factor GmTGA15 enhances drought tolerance in transgenic soybean hairy roots and Arabidopsis plants.</a> Agronomy. 11 (1), 170(2021).</li>
<li>Savka, M., Ravillion, B., Noel, G., Farrand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+hairy+roots+on+cultivated+soybean+genotypes+and+their+use+to+propagate+the+soybean+cyst+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Induction of hairy roots on cultivated soybean genotypes and their use to propagate the soybean cyst nematode.</a> Phytopathology. 80 (5), 503-508 (1990).</li>
<li>Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+of+soybean+isoflavone+synthase+genes+leads+to+silencing+in+tissues+distal+to+the+transformation+site+and+to+enhanced+susceptibility+to+Phytophthora+sojae%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">RNA interference of soybean isoflavone synthase genes leads to silencing in tissues distal to the transformation site and to enhanced susceptibility to Phytophthora sojae.</a> Plant Physiology. 137 (4), 1345-1353 (2005).</li>
<li>Sharma, A. R., Gajurel, G., Ahmed, I., Roedel, K., Medina-Bolivar, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+prenylated+stilbenoids+arachidin-1+and+arachidin-3+and+their+semi-preparative+separation+and+purification+from+hairy+root+cultures+of+peanut+%28Arachis+hypogaea+l.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Induction of the prenylated stilbenoids arachidin-1 and arachidin-3 and their semi-preparative separation and purification from hairy root cultures of peanut (Arachis hypogaea l.).</a> Molecules. 27 (18), 6118(2022).</li>
<li>Lozovaya, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflavonoid+accumulation+in+soybean+hairy+roots+upon+treatment+with+Fusarium+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isoflavonoid accumulation in soybean hairy roots upon treatment with Fusarium solani.</a> Plant Physiology Biochemistry. 42 (7-8), 671-679 (2004).</li>
<li>Rahimi Khonakdari, M., Rezadoost, H., Heydari, R., Mirjalili, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+photoperiod+and+plant+growth+regulators+on+in+vitro+mass+bulblet+proliferation+of+Narcissus+tazzeta+L.+%28Amaryllidaceae%29%2C+a+potential+source+of+galantamine%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%2C+Tissue%2C+and+Organ+Culture%22%5BJournal%5D)">Effect of photoperiod and plant growth regulators on in vitro mass bulblet proliferation of Narcissus tazzeta L. (Amaryllidaceae), a potential source of galantamine.</a> Plant Cell, Tissue, and Organ Culture. 142 (1), 187-199 (2020).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In het afgelopen decennium is de HR-methode van sojabonen ontwikkeld als een krachtig hulpmiddel om genen te bestuderen die betrokken zijn bij stikstoffixatie 22,23, biotische en abiotische stresstolerantie 24,25 en metaboliet biosynthetische routes 26,27. De kennis van hoe planten metabolieten produceren, heeft een overvloed aan voordelen voor de...

Soja (Glycine max) is een van de meest waardevolle gewassen in de landbouw. Het heeft duizenden commerciële en industriële toepassingen, zoals voedsel, veevoer, olie en als bron van grondstoffen voor de productie1. Het vermogen om een symbiotische relatie te vormen met stikstofbindende bodemmicro-organismen, namelijk wortelstokken, verhoogt het belang van het bestuderen van de genetica van sojabonen verder2. Het verfijnen van stikstoffixatie-eigenschappen in sojawortels kan bijvoorbeeld leiden tot de vermindering van koolstofemissies en de behoefte aan stikstofmeststofaanzienlijk verminderen 3. Het begrijpen van de genetica die aspecten van de biologie van sojabonenwortels controleert, heeft dus brede toepassingen in de landbouw en de industrie. Gezien deze voordelen is het belangrijk om een betrouwbaar protocol te hebben om de functie van sojaboongenen te analyseren.
Agrobacterium tumefaciens is misschien wel het meest gebruikte hulpmiddel voor genetische transformatie van planten, omdat het de mogelijkheid heeft om overdrachts-DNA (T-DNA) te integreren in het nucleaire genoom van veel plantensoorten. Wanneer Agrobacterium een plant infecteert, brengt het het tumor-inducerende (Ti) plasmide over naar het gastheerchromosoom, wat leidt tot de vorming van een tumor op de infectieplaats. De Agrobacterium-gemedieerde transformatie wordt al tientallen jaren op grote schaal gebruikt voor genfunctionele analyse en om gewaskenmerken te wijzigen4. Hoewel elk gen van belang gemakkelijk kan worden overgedragen in waardplantencellen door middel van A. tumefaciens-gemedieerde transformatie, heeft deze methode verschillende nadelen; Het is tijdrovend, duur en vereist uitgebreide expertise voor veel plantensoorten, zoals sojabonen. Hoewel een paar soorten sojabonen kunnen worden getransformeerd door de cotyledonaire knooppuntbenadering met behulp van A. tumefaciens, vereist de inefficiëntie van deze aanpak de behoefte aan een alternatieve genetische transformatietechnologie die snel en zeer efficiënt is 4,5. Zelfs een niet-expert kan deze Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde harige wortel (HR) transformatiemethode gebruiken om deze nadelen te overwinnen.
HR-transformatie is een relatief snel hulpmiddel, niet alleen voor het analyseren van de genfunctie, maar ook voor biotechnologische toepassingen, zoals de productie van gespecialiseerde metabolieten en fijne chemicaliën, en complexe bioactieve glycoproteïnen6. De productie van HRs van sojabonen vereist geen uitgebreide expertise, omdat ze kunnen worden gegenereerd door de oppervlakken van zaadlobben te verwonden, gevolgd door inenting met Agrobacterium rhizogenes7. A. rhizogenes brengt virulentie (Vir) genen tot expressie die gecodeerd zijn door zijn Ti-plasmide die zijn T-DNA-segment overbrengen, dragen en integreren in het genoom van plantencellen en tegelijkertijd de buitenbaarmoederlijke wortelgroei stimuleren8.
In vergelijking met andere genexpressiesystemen voor sojabonen, zoals biolistica of op A. tumefaciens gebaseerde transformatie van weefsel-, cel- en orgaancultuur, vertoont het HR-expressiesysteem verschillende voordelen. Ten eerste zijn HRs genetisch stabiel en worden ze snel geproduceerd op hormoonvrije media 1,9,10. Bovendien kunnen HRs gespecialiseerde metabolieten produceren in hoeveelheden gelijk aan of groter dan inheemse wortels11,12. Deze voordelen maken HRs een wenselijk biotechnologisch hulpmiddel voor plantensoorten die onverenigbaar zijn met A. tumefaciens of die speciale weefselkweekomstandigheden vereisen om compatibele weefsels te vormen. De HR-methode is een efficiënte benadering voor het analyseren van eiwit-eiwitinteracties, eiwitsubcellulaire lokalisatie, recombinante eiwitproductie, fytoremediatie, mutagenese en genoombrede effecten met behulp van RNA-sequencing13,14,15. Het kan ook worden gebruikt om de productie van gespecialiseerde metabolieten te bestuderen die waarde hebben in de industrie, waaronder glyceollen, die de verdediging van sojabonen tegen de belangrijke microbiële ziekteverwekker Phytophthora sojae mediteren en indrukwekkende antikanker- en neuroprotectieve activiteiten bij mensen hebben16,17.
Dit rapport toont een eenvoudig, efficiënt protocol om HRs voor sojabonen te produceren. In vergelijking met eerdere HR-transformatiemethoden biedt dit protocol een significante (33% -50%) verbetering van de snelheid van HR-vorming door A. rhizogenes-transformanten vooraf te screenen op de aanwezigheid van het Ti-plasmide voorafgaand aan het enten van soja-zaadlobben. We tonen de toepasbaarheid van dit protocol aan door verschillende binaire vectoren te transformeren die de transcriptiefactorgenen van sojabonen overexpressie of het zwijgen opleggen.

<table><tbody><tr><td>Acetosyringone</td><td>Cayman</td><td>23224</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>lavo</td><td>21124</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher bioreagents</td><td>195679</td><td></td></tr><tr><td>Gelzan</td><td>Phytotech</td><td>HYY3251089A</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Phytotech</td><td>HHA0397050B</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td>Fisher chemical</td><td>206462</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Phytotech</td><td>SQS0378007G</td><td></td></tr><tr><td>LB powder</td><td>Fisher bioreagents</td><td>200318</td><td></td></tr><tr><td>MS powder</td><td>Caisson labs</td><td>2210001</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher bioreagents</td><td>194171</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher chemical</td><td>192946</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-11</td><td>100 mm x 25 mm</td></tr><tr><td>Phosphinothricin</td><td>Cedarlane</td><td>P034-250MG</td><td></td></tr><tr><td>REDExtract-N-Amp PCR Kit</td><td>Sigma</td><td>R4775</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Bioshop</td><td>2D76475</td><td></td></tr><tr><td>Timentin</td><td>Caisson labs</td><td>12222002</td><td></td></tr><tr><td>Vitamins</td><td>Caisson labs</td><td>2211010</td><td></td></tr></tbody></table>

sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Soybean Hairy Root Transformation for the Analysis of Gene Function

Soja (Glycine max) is een waardevol gewas in de landbouw dat duizenden industriële toepassingen heeft. Sojawortels zijn de primaire plaats van interactie met bodemmicroben die symbiose vormen om stikstof en pathogenen te fixeren, waardoor onderzoek met sojawortelgenetica van het grootste belang is om de landbouwproductie te verbeteren. De genetische transformatie van sojabonen harige wortels (HRs) wordt gemedieerd door de Agrobacterium rhizogenes stam NCPPB2659 (K599) en is een efficiënt hulpmiddel voor het bestuderen van de genfunctie in sojawortels, die slechts 2 maanden van begin tot eind duurt. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat de methode schetst voor het overexpressie en het uitschakelen van een gen dat van belang is in HRs van sojabonen. Deze methodologie omvat sterilisatie van sojazaad, infectie van zaadlobben met K599 en de selectie en oogst van genetisch getransformeerde HRs voor RNA-isolatie en, indien gerechtvaardigd, metabolietanalyses. De doorvoer van de aanpak is voldoende om tegelijkertijd verschillende genen of netwerken te bestuderen en zou de optimale engineeringstrategieën kunnen bepalen voordat ze zich committeren aan stabiele transformatiebenaderingen op lange termijn.

De representatieve resultaten zijn afkomstig van de gepubliceerde gegevens19,20. De kolonie PCR (cPCR) resultaten van de getransformeerde K599 Agrobacterium zijn weergegeven in figuur 1. Zoals aangegeven door de positieve kolonies in figuur 1, werd het gen van belang gedetecteerd door cPCR (figuur 1A). Een derde tot de helft van de kolonies was echter negatief voor ...

Hier presenteren we een protocol voor de zeer efficiënte productie van transgene sojabonenharige wortels.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Soybean (Glycine max) is a valuable crop in agriculture that has thousands of industrial uses. Soybean roots are the primary site of interaction with ...

Onze sojabonen harige worteltransformatiemethode is voldoende om tegelijkertijd de functies van verschillende genen of netwerken te bestuderen en zou de optimale engineeringstrategieën kunnen bepalen voordat we ons committeren aan stabiele transformatiebenaderingen op lange termijn. Sojabonen harige worteltransformatie is een nuttig hulpmiddel voor de analyse van de genfunctie in sojaplanten. De technologie die momenteel wordt gebruikt, omvat CRISPR-Cas9-genoombewerking, RNA-interferentie, transcriptomics en proteomics en beeldvormingstechnologieën.De grootste uitdaging in het modeltijdperk van functionele genomica is het voldoende analyseren van de functie van talrijke genen. De meeste genen zijn polygeen en worden bereikt door de interactie van vele genen. Ons harige wortelprotocol zal genfunctie-analyse met voldoende doorvoer vergemakkelijken, zodat polygene netwerken kunnen worden begrepen.We hebben het belang van het Ti-plasmide in agrobacterium rhizogene stammen vastgesteld. We ontdekten dat zonder screening op het Ti-plasmide, het het risico verhoogde voor de getransformeerde soja-zaadlob, om geen kleuren te produceren. Als gevolg hiervan werd screening op het plasmide een essentiële stap vóór de transformatie.In vergelijking met andere genexpressietechnieken is ons haarwortelexpressiesysteem gemakkelijk te hanteren, minder tijdrovend en kosteneffectief. Ook heeft ons nieuwe protocol de harige worteltransformatiesnelheid tot 50% verbeterd door te controleren op de Ti-plasmide en agrobacterie voorafgaand aan de zaadlobligtransformatie. Door de functie van meer dan een dozijn transcriptiefactorgenen te karakteriseren, hebben onze recente resultaten de weg vrijgemaakt voor multi-gen engineeringstudies, gericht op het ontsluiten van de biosynthese van waardevolle fytoalexinemetabolieten in planten.In de toekomst zullen we deze harige worteltransformatiemethode gebruiken om de transcriptiefactorgennetwerken te ontleden die de biosynthese van fytoalexinen reguleren. De aanpak kan worden gebruikt om de productie van deze gespecialiseerde metabolieten voor de farmaceutische en agrarische industrie te verbeteren.

soybean-hairy-root-transformation-for-the-analysis-of-gene-function

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Promotor expressie analyses zijn cruciaal voor de verbetering van het begrip van genexpressie en de spatio uitdrukking van de doelgenen. Hierin presenteren wij een protocol om te identificeren, isoleren en klonen van een plant promotor. Verder, beschrijven we de karakterisatie van de knobbel-specifieke promotor in de gemeenschappelijke bean harige wortels.

De analyse van de promotor van de plant: Identificatie en karakterisering van Root knobbeltje specifieke promotor in de gemeenschappelijke Boon

We ontwikkelden een eenvoudige en efficiënte protocol voor de voorbereiding van grote hoeveelheden soja protoplasten om te studeren van de ingewikkelde regelgeving en signalering mechanismen in levende cellen.

Een eenvoudige methode voor het isoleren van soja protoplasten en toepassing op voorbijgaande gen expressie Analyses

We beschrijven een methode om harige wortels te induceren door Agrobacterium rhizogenes-gemedieerde transformatie in Tartary boekweit(Fagopyrum tataricum). Dit kan worden gebruikt om genfuncties en de productie van secundaire metabolieten in Tartary boekweit te onderzoeken, worden aangenomen voor elke genetische transformatie, of gebruikt voor andere geneeskrachtige planten na verbetering.

Inducerende harige wortels door Agrobacterium rhizogenes-Gemedieerde transformatie in Tartary Boekweit(Fagopyrum tataricum)

Hier bieden we het gedetailleerde protocol van een transformatiemethode in één stap, gemedieerd door Agrobacterium tumefaciens om samengestelde planten te produceren.

Een efficiënte en reproduceerbare methode voor het produceren van samengestelde planten door Agrobacterium rhizogenes-gebaseerde harige worteltransformatie

Het protocol beschrijft de inductie van harige wortels met behulp van Arabidopsis primaire bloeiwijzestengels en Brassica napus hypocotyls. De harige wortels kunnen worden gekweekt en gebruikt als explantaten om transgene planten te regenereren.

Transformatie en regeneratie van harige wortels bij Arabidopsis thaliana en Brassica napus

Dit is een stap-voor-stap handleiding toont het doel, de werking, en representatieve resultaten van de roman zwaartekracht spectrometer.

Demonstratie van het gebruik van de Novel zwaartekracht Spectrometer te rekken en te meten Stapel-eiwitten

Dit artikel geeft een protocol voor de teelt van Arabidopsis zaailingen in de RootChip, een microfluïdische imaging platform dat automatisch besturen van de voorwaarden voor groei combineert met microscopische wortel monitoring en FRET-gebaseerde meting van intracellulaire metaboliet niveaus.

Time-lapse fluorescentie beeldvorming van Arabidopsis wortelgroei met Rapid Manipulatie van het wortelmilieu Het gebruik van de RootChip

Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Een dubbelstrengs RNA interferentie (dsRNAi) techniek wordt toegepast om down-reguleren van de maïs cinnamoyl co-enzym A-reductase (ZmCCR1) gen tot lagere planten ligninegehalte. Lignine down-regulatie van de celwand wordt gevisualiseerd door microscopische analyses en gekwantificeerd door de Klason methode. Compositionele veranderingen in hemicellulose en cellulose geanalyseerd.

Lignine Neerregeling van<em&gt; Zea mays</em&gt; Via dsRNAi en Klason Lignine Analyse

Leer haarworteltransformatie bij sojabonen voor genfunctieanalyse met behulp van CRISPR-Cas9 en RNA-interferentie. Deze methode maakt gelijktijdig onderzoek naar meerdere genen en polygenische netwerken mogelijk.

Sojabonen harige worteltransformatie voor de analyse van de genfunctie

Meer video's verkennen