Name: Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-22T14:55:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Leer een snelle, kosteneffectieve methode voor de fabricage van tumorsferoïden en hun inkapseling in polyethyleenglycolhydrogels. Dit protocol bootst de tumor-micro-omgeving na zonder gespecialiseerde apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door startfondsen die door de Saint Louis University aan Dr. Silviya P Zustiak werden verstrekt, evenals door een startsubsidie van het Henry and Amelia Nasrallah Center for Neuroscience aan de Saint Louis University, toegekend aan Dr. Silviya P Zustiak.

Fabricage gevolgd door 3D-inkapseling van tumorsferoïden in PEG-hydrogels

<ol><li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroids+formation+on+non-adhesive+surfaces+by+liquid+overlay+technique%3A+Considerations+and+practical+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Spheroids formation on non-adhesive surfaces by liquid overlay technique: Considerations and practical approaches.</a> Biotechnology Journal. 13 (1), 1700417(2018).</li>
<li>Li, Y., Kumacheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+microenvironments+for+cancer+spheroid+growth+and+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Hydrogel microenvironments for cancer spheroid growth and drug screening.</a> Science Advances. 4 (4), eaas8998(2018).</li>
<li>Kamatar, A., Gunay, G., Acar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+synthetic+biomaterials+for+engineering+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Natural and synthetic biomaterials for engineering multicellular tumor spheroids.</a> Polymers. 12 (11), 2506(2020).</li>
<li>Wang, C., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+3D+brain+tumor+model+to+elucidate+the+effects+of+matrix+stiffness+on+glioblastoma+cell+behavior+using+PEG-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Bioengineered 3D brain tumor model to elucidate the effects of matrix stiffness on glioblastoma cell behavior using PEG-based hydrogels.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2115-2125 (2014).</li>
<li>Nakod, P. S., Kim, Y., Rao, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+biomimetic+hyaluronic+acid+hydrogels+to+investigate+glioblastoma+stem+cell+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional biomimetic hyaluronic acid hydrogels to investigate glioblastoma stem cell behaviors.</a> Biotechnology and Bioengineering. 117 (2), 511-522 (2020).</li>
<li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+scaffolds+for+3D+culture+demonstrate+extracellular+matrix-mediated+mechanisms+of+chemotherapy+resistance+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma.</a> Matrix Biology. 85, 128-146 (2020).</li>
<li>Pedron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid-functionalized+gelatin+hydrogels+reveal+extracellular+matrix+signals+temper+the+efficacy+of+erlotinib+against+patient-derived+glioblastoma+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid-functionalized gelatin hydrogels reveal extracellular matrix signals temper the efficacy of erlotinib against patient-derived glioblastoma specimens.</a> Biomaterials. 219, 119371(2019).</li>
<li>Hill, L., Bruns, J., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+matrix+presence+and+composition+influence+drug+responses+of+encapsulated+glioblastoma+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Hydrogel matrix presence and composition influence drug responses of encapsulated glioblastoma spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 132, 437-447 (2021).</li>
<li>Chen, J. -W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+microglia+and+patient-derived+glioblastoma+cells+inhibit+invasion+in+a+three-dimensional+gelatin+hydrogel+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between microglia and patient-derived glioblastoma cells inhibit invasion in a three-dimensional gelatin hydrogel model.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 346(2020).</li>
<li>Thakuri, P. S., Liu, C., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials-based+approaches+to+tumor+spheroid+and+organoid+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Biomaterials-based approaches to tumor spheroid and organoid modeling.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (6), 1700980(2018).</li>
<li>Shin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate-marine+collagen-agarose+composite+hydrogels+as+matrices+for+biomimetic+3D+cell+spheroid+formation%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Alginate-marine collagen-agarose composite hydrogels as matrices for biomimetic 3D cell spheroid formation.</a> RSC Advances. 6 (52), 46952-46965 (2016).</li>
<li>Pradhan, S., Clary, J. M., Seliktar, D., Lipke, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+spheroidal+cancer+model+based+on+PEG-fibrinogen+hydrogel+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional spheroidal cancer model based on PEG-fibrinogen hydrogel microspheres.</a> Biomaterials. 115, 141-154 (2017).</li>
<li>Imaninezhad, M., Hill, L., Kolar, G., Vogt, K., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Templated+macroporous+polyethylene+glycol+hydrogels+for+spheroid+and+aggregate+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Templated macroporous polyethylene glycol hydrogels for spheroid and aggregate cell culture.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (1), 34-46 (2018).</li>
<li>Mirab, F., Kang, Y. J., Majd, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+characterization+of+size-controlled+glioma+spheroids+using+agarose+hydrogel+microwells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Preparation and characterization of size-controlled glioma spheroids using agarose hydrogel microwells.</a> PLoS One. 14 (1), e0211078(2019).</li>
<li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+size-controlled+tumor+spheroids+using+microwell+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 81, e50665(2013).</li>
<li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTimmins%2C+NE+%22Generation+of+Multicellular+Tumor+Spheroids+by+the+Hanging-Drop+Method%22">Generation of Multicellular Tumor Spheroids by the Hanging-Drop Method</a>. Hauser, H., Fussenegger, M. 140, Springer, Humana Press, NJ. (2007).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+printed+hanging+drop+dripper+for+tumor+spheroids+analysis+without+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D printed hanging drop dripper for tumor spheroids analysis without recovery.</a> Scientific Reports. 9 (1), 19717(2019).</li>
<li>Amaral, R. L., Miranda, M., Marcato, P. D., Swiech, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+3D+bladder+tumor+spheroids+obtained+by+forced+floating+and+hanging+drop+methods+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening.</a> Frontiers in Physiology. 8, 605(2017).</li>
<li>Gencoglu, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+multicellular+tumor+spheroid+formation+methods+and+implications+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparative study of multicellular tumor spheroid formation methods and implications for drug screening.</a> ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 410-420 (2018).</li>
<li>Zhang, C., Liu, C., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+brain+tissue+based+on+microstructure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Mechanical+Behavior+of+Biomedical+Materials%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of brain tissue based on microstructure.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 126, 104924(2021).</li>
<li>Alifieris, C., Trafalis, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+Pathogenesis+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: Pathogenesis and treatment.</a> Pharmacology & Therapeutics. 152, 63-82 (2015).</li>
<li>Zustiak, S. P., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolytically+degradable+poly+%28ethylene+glycol%29+hydrogel+scaffolds+with+tunable+degradation+and+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Hydrolytically degradable poly (ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties.</a> Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).</li>
<li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-hydrogel+interactions+in+tissue+engineering%3A+Mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein-hydrogel interactions in tissue engineering: Mechanisms and applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 19 (2), 160-171 (2013).</li>
<li>Kroger, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+hydrolytically+degradable+polyethylene+glycol+crosslinkers+for+facile+control+of+hydrogel+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Design of hydrolytically degradable polyethylene glycol crosslinkers for facile control of hydrogel degradation.</a> Macromolecular Bioscience. 20 (10), 2000085(2020).</li>
<li>Raeber, G., Lutolf, M., Hubbell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecularly+engineered+PEG+hydrogels%3A+a+novel+model+system+for+proteolytically+mediated+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecularly engineered PEG hydrogels: a novel model system for proteolytically mediated cell migration.</a> Biophysical Journal. 89 (2), 1374-1388 (2005).</li>
<li>Bruns, J., Egan, T., Mercier, P., Zustiak, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+spheroid+growth+and+chemotherapeutic+responses+in+single+and+dual-stiffness+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma spheroid growth and chemotherapeutic responses in single and dual-stiffness hydrogels.</a> Acta Biomaterialia. 163, 400-414 (2023).</li>
<li>Kuwajima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent-and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Holt, S. E., Ward, E. S., Ober, R. J., Alge, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shooting+for+the+moon%3A+using+tissue-mimetic+hydrogels+to+gain+new+insight+on+cancer+biology+and+screen+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Communications%22%5BJournal%5D)">Shooting for the moon: using tissue-mimetic hydrogels to gain new insight on cancer biology and screen therapeutics.</a> MRS Communications. 7 (3), 427-441 (2017).</li>
<li>Jain, E., Scott, K. M., Zustiak, S. P., Sell, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+polyethylene+glycol-based+hydrogel+microspheres+through+electrospraying%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fabrication of polyethylene glycol-based hydrogel microspheres through electrospraying.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (8), 823-835 (2015).</li>
<li>Raghavan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+tumor+spheroid+generation+techniques+for+differential+in+vitro+drug+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of tumor spheroid generation techniques for differential in vitro drug toxicity.</a> Oncotarget. 7 (13), 16948(2016).</li>
<li>Lee, K. -H., Kim, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+multicellular+tumor+spheroid+generation+for+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">Recent advances in multicellular tumor spheroid generation for drug screening.</a> Biosensors. 11 (11), 445(2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Op hydrogel gebaseerde meercellige tumorsferoïde modellen worden in toenemende mate ontwikkeld om therapeutische ontdekkingen op het gebied van kanker te bevorderen 11,13,29. Ze zijn gunstig omdat ze de belangrijkste parameters van de micro-omgeving van de tumor op een gecontroleerde manier nabootsen en, ondanks hun complexiteit, eenvoudiger en goedkoper te gebruiken zijn dan in vivo modellen, en vele zijn compatibel met high-th...

Tumorsferoïden zijn naar voren gekomen als nuttige in vitro-hulpmiddelen bij het bestuderen van de etiologie, pathologie enresponsiviteit van kanker1. Traditioneel worden sferoïden gekweekt in omstandigheden zoals platen met lage adhesie of bioreactoren, waar cel-cel adhesie de voorkeur heeft boven cel-oppervlak adhesie2. Het wordt nu echter erkend dat om de micro-omgeving van de tumor getrouwer te recapituleren, in vitro sferoïde modellen zowel cel-cel- als cel-matrixinteracties moeten vastleggen. Dit heeft meerdere groepen ertoe aangezet om steigers te ontwerpen, zoals hydrogels, waar sferoïden kunnen worden ingekapseld 3,4. Dergelijke op hydrogel gebaseerde sferoïde modellen maken het mogelijk om cel-cel- en celmatrixinteracties op verschillende celgedragingen op te helderen, zoals levensvatbaarheid, proliferatie, stamheid of therapieresponsiviteit.
Hier beschrijven we een protocol voor het inkapselen van glioblastoomsferoïden in polyethyleenglycol (PEG) hydrogels. Er zijn meerdere literatuurrapporten over inkapseling van glioblastoomcellen in hydrogels. Sferoïden werden bijvoorbeeld gevormd door U87-cellen in te kapselen in PEG-hydrogels versierd met een RGDS-kleefligand en verknoopt met een enzymatisch splitsbaar peptide om het effect van hydrogelstijfheid op celgedrag te bepalen. U87-cellen zijn ook gevormd in andere op PEG gebaseerde of op hyaluronzuur gebaseerde hydrogels om de kankerstamcelpopulatie uit te breiden6 of om matrix-gemedieerde mechanismen van chemotherapieresistentie te onderzoeken 7,8,9. Glioblastoom-sferoïden zijn ook ingekapseld in gelatinehydrogels om de overspraak tussen microglia en kankercellen en het effect ervan op celinvasie te bestuderen10. Over het algemeen hebben dergelijke onderzoeken het nut aangetoond van op hydrogel gebaseerde in vitro modellen bij het begrijpen van glioblastoompathologie en het bedenken van behandelingen.
Verder zijn er verschillende methoden voor de fabricage van tumorsferoïden en hydrogel-inkapseling11. Gedispergeerde cellen kunnen bijvoorbeeld in hydrogels worden gezaaid en in de loop van de tijd sferoïden kunnen vormen 5,12. Een nadeel van een dergelijke methode is de polydispersiteit van de gevormde sferoïden, wat kan leiden tot differentiële celreacties. Om uniforme sferoïden te produceren, kunnen cellen worden ingekapseld in microgels en gedurende langere perioden worden gekweekt totdat ze de gel binnendringen en hermodelleren13, of cellen kunnen worden afgezet in sjabloongels met bolvormige 'gaten' en14 kunnen aggregeren. Het nadeel van deze methoden is hun relatieve complexiteit, de noodzaak van een druppelgenerator of andere middelen om microgels of de 'gaten' in de gel te vormen, en de tijd die sferoïden nodig hebben om te groeien en te rijpen. Als alternatief kunnen sferoïden worden voorgevormd in microwells 9,15,16 of in hangende druppelplaten17,18 en vervolgens worden ingekapseld in een hydrogel, vergelijkbaar met de hier beschreven techniek. Deze methoden zijn eenvoudiger en kunnen met een hogere doorvoer worden uitgevoerd. Interessant is dat is aangetoond dat de methode van sferoïde vorming het gedrag van sferoïde cellen kan beïnvloeden, zoals genexpressie, celproliferatie of responsiviteit vangeneesmiddelen19,20.
Hier richten we ons op glioblastoom, omdat het een solide tumor is waarvan de oorspronkelijke omgeving de zachte, nanoporeuze hersenmatrix21 is, die kan worden nagebootst door een zachte, nanoporeuze hydrogel. Glioblastoom is ook de dodelijkste hersenkanker waarvoor geen remedie beschikbaar is. Het hier beschreven protocol kan echter worden gebruikt voor het inkapselen van sferoïden die een solide tumor vertegenwoordigen. We hebben ervoor gekozen om PEG-hydrogels te gebruiken die worden gevormd door een additiereactie van het Michael-type23. PEG is een synthetische, niet-afbreekbare en biocompatibele hydrogel die inert is en dient als steiger en fysieke celondersteuning, maar geen celhechting ondersteunt23. Celadhesie kan afzonderlijk worden toegevoegd via tethering van hele eiwitten of adhesieve liganden24, en afbreekbaarheid kan worden toegevoegd via chemische modificaties van de PEG-polymeerketen of hydrolytisch of enzymatisch afbreekbare crosslinkers 25,26. Hierdoor kunnen biochemische eigenschappen onafhankelijk van mechanische of fysische hydrogeleigenschappen worden afgestemd, wat voordelig zou kunnen zijn bij het bestuderen van cel-matrixinteracties. De geleringschemie van het Michael-type is selectief en vindt plaats onder fysiologische omstandigheden; Daarom maakt het sferoïde inkapseling mogelijk door de sferoïden eenvoudig te mengen met de hydrogel-precursoroplossing.
Over het algemeen heeft de hier gepresenteerde methodologie een aantal opvallende kenmerken. Ten eerste is het vervaardigen van tumorsferoïden in een multiwell-assemblage efficiënt, snel en zijn de kosten van de benodigde materialen laag. Ten tweede worden de sferoïden in grote batches geproduceerd in verschillende maten met een lage polydispersiteit. Ten slotte zijn alleen in de handel verkrijgbare materialen nodig. Het nut van de methodologie wordt geïllustreerd door het effect van substraateigenschappen op de levensvatbaarheid, circulariteit en celstamheid van sferoïde cellen te onderzoeken.

<table><tbody><tr><td>70% Ethanol</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>LC22210-4</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conicals</td><td>FALCON</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Plate Ultra Low Attachment plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petri Dish</td><td>Amazon</td><td>706011</td><td></td></tr><tr><td>4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-10K-5g</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conicals</td><td>Fisher Scinetific</td><td>3181345107</td><td></td></tr><tr><td>6-well AggreWell 400&nbsp;</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td><td>34421</td><td>Vierzijdig piramidale microputjes&nbsp;</td></tr><tr><td>anti-adherence rinsing solution</td><td>StemCell Technologies, Vancouver, Canada</td><td>Cat #: 07010</td><td></td></tr><tr><td>Aspartic Acid-Arginine-Cysteine-Glycine-Valine-Proline-Methionine-Serine-Methionine-Arginine-Glycine-Cysteine-Arginine- Aspartic Acid (DRCG-VPMSMR-GCRD) peptide</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td>Aangepaste synthese</td></tr><tr><td>Chemical Fume Hood</td><td>KEWAUNEE</td><td>99151</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV Free&nbsp;</td><td>Corning</td><td>356234</td><td>Basale membraanmatrix</td></tr><tr><td>Detergent - Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>Niet-ionogene oppervlakteactieve stof</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Pipettes (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH30073-03</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde 37% Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Glass Plates</td><td>Slumpys</td><td>GBS4100SFSL</td><td></td></tr><tr><td>Glass Transfer Pipettes</td><td>Fisher Scinetific</td><td>5 3/4": 1367820A, 9":136786B</td><td></td></tr><tr><td>Glycine-Arginine-Cysteine-Aspartic Acid-Arginine-Glycine-Aspartic Acid-Serine (GRCD-RGDS) peptide</td><td>Genic Bio, Shanghai, China</td><td>n/a</td><td>Aangepaste synthese</td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Bright-Line</td><td>383684</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic solution - Repel Silane&nbsp;</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-1332-01</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE</td><td>NU-8500</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope (Axiovert 25)</td><td>Zeiss</td><td>663526</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-Dihexadecyloxacarbocyanine Perchlorate)</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D1125</td><td></td></tr><tr><td>Leica Confocal SP8</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M)</td><td>Zeiss</td><td>3820005619</td><td></td></tr><tr><td>Micro centrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>2 mL: 02681258</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Zeiss</td><td>AxioVision Rel. 4.8.2</td><td></td></tr><tr><td>Nestin Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-23927</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM&nbsp;</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x), pH 7.4</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>MP Biomedicals</td><td>1670046</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Aid</td><td>Drummond Scientific Co.</td><td>P-76864</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Tips (1&ndash;200 &micro;L, 101&ndash;1000 &micro;L)</td><td>Fisher Scinetific</td><td>2707509</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-9D</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Weigh Boats (100 mL)</td><td>Amazon&nbsp;</td><td>mdo-azoc-1030</td><td></td></tr><tr><td>poly(ethylene glycol)-dithiol (PEG-diSH; 3.4 kDa)</td><td>Laysan Bio</td><td>SH-PEG-SH-3400-5g</td><td></td></tr><tr><td>Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit]</td><td>Elsworth Adhesives</td><td>3097358-1004</td><td>Polydimethylsiloxaan</td></tr><tr><td>Powder Free Examination Gloves</td><td>Quest</td><td>92897</td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide, 1 mg/mL aqueous soln.&nbsp;</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AAJ66584AB</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30027-02</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacers - Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>JTR-S-0.5</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365823</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Culture Hood</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-600</td><td></td></tr><tr><td>Triethanolamine, &ge;99.0% (GC)&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>U-87 MG human glioblastoma cells</td><td>American Type Culture Collection&nbsp;</td><td>HTB-14</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Tumor Spheroid Fabrication and Encapsulation in Polyethylene Glycol Hydrogels for Studying Spheroid-Matrix Interactions

Driedimensionale (3D) inkapseling van sferoïden is cruciaal om de micro-omgeving van de tumor adequaat na te bootsen voor optimale celgroei. Hier ontwierpen we een in vitro 3D-glioblastoommodel voor sferoïde inkapseling om de extracellulaire micro-omgeving van de tumor na te bootsen. Eerst vormden we vierkante piramidale microtimidale microtiolmallen met behulp van polydimethylsiloxaan. Deze microtitermallen werden vervolgens gebruikt om tumorsferoïden te fabriceren met streng gecontroleerde groottes van 50-500 μm. Zodra sferoïden waren gevormd, werden ze geoogst en ingekapseld in hydrogels op basis van polyethyleenglycol (PEG). PEG-hydrogels zijn een veelzijdig platform voor sferoïde inkapseling, omdat hydrogeleigenschappen zoals stijfheid, afbreekbaarheid en celkleefkracht onafhankelijk kunnen worden afgestemd. Hier gebruikten we een representatieve zachte (~8 kPa) hydrogel om glioblastoomsferoïden in te kapselen. Ten slotte werd een methode ontwikkeld om sferoïden te kleuren en af te beelden om beelden van hoge kwaliteit te verkrijgen via confocale microscopie. Vanwege de dichte sferoïde kern en de relatief schaarse periferie kan beeldvorming moeilijk zijn, maar het gebruik van een klaringsoplossing en confocale optische doorsnede helpt deze beeldvormingsproblemen te verlichten. Samenvattend tonen we een methode om uniforme sferoïden te fabriceren, ze in te kapselen in PEG-hydrogels en confocale microscopie uit te voeren op de ingekapselde sferoïden om sferoïde groei en verschillende cel-matrixinteracties te bestuderen.

Op sferoïden gebaseerde platforms voor het screenen van geneesmiddelen om chemotherapeutische effecten te bestuderen, zijn steeds meer gewild vanwege de nadruk op het moduleren van de micro-omgeving van de tumor bij sferoïde inkapseling in biomaterialen die natief weefsel repliceren. Hier ontwikkelden we een methode voor meercellige tumorsferoïde voorbereiding en daaropvolgende inkapseling en beeldvorming in een 3D-hydrogel. De sferoïden worden bereid in microtitermallen (figuur 3A,B), wat r...

Hier presenteren we een protocol dat snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsferoïden mogelijk maakt, gevolgd door hydrogel-inkapseling. Het is breed toepasbaar omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is. Het zou met name nuttig zijn voor het onderzoeken van sferoïde-matrixinteracties en het bouwen van in vitro weefselfysiologische of pathologiemodellen.

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Three-dimensional (3D) encapsulation of spheroids is crucial to adequately replicate the tumor microenvironment for optimal cell growth.  Here, we ...

Ons laboratorium richt zich op het ontwerpen van in vitro hydrogelmodellen voor inkapseling van glioblastoomsteroïden om de extracellulaire micro-omgeving van de tumor na te bootsen. De effectieve substraat-, mechanische en biochemische eigenschappen op de levensvatbaarheid, circulariteit, stamheid en verspreiding van steroïdecellen worden met dergelijke modellen onderzocht. De huidige experimentele uitdagingen bij de ontwikkeling van tumormodules draaien om een verlangen naar complexiteit om alle aspecten van de tumormicro-omgeving na te bootsen voor fysiologische relevantie, en ook een verlangen naar eenvoud om het model toegankelijk, robuust, goedkoop en gebruiksvriendelijk te maken, en compatibel met multiplex-screeningbenaderingen.We presenteren een protocol dat een snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsteroïden en inkapseling in hydrogels mogelijk maakt die zijn gemaakt om de micro-omgeving van de tumor na te bootsen. Het model vereist geen gespecialiseerde apparatuur. Het zal met name nuttig zijn voor het onderzoeken van steroïde matrixinteracties bij het bouwen van in vitro weefselfysiologie of pathologiemodellen.Inzicht in de interacties tussen glioblastoomkankercellen en hun micro-omgeving kan de ontwikkeling van nieuwe therapieën stimuleren om deze kanker beter te behandelen. Bovendien kan de ontwikkeling van een in vitro model voor glioblastoomkanker de ontwikkeling van dit model voor andere kankerziekten verbeteren.

tumor-spheroid-fabrication-encapsulation-polyethylene-glycol

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Source: Guyon, J., et al. A 3D Spheroid Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2020)The video demonstrates the generation of a three-dimensional spheroid model of tumor cell invasion. Spheroids are formed from human brain tumor cells and embedded in a collagen matrix. The tumor cells at the spheroid periphery adopt an invasive phenotype, secreting proteases to degrade the collagen and advancing to invade the surrounding matrix.

Generation of a Three-Dimensional Spheroid Model of Tumor Cell Invasion

Deeltjes volgen microrheology kunnen worden gebruikt om niet-destructieve kwantificeren en veranderingen in extracellulaire matrix mechanische eigenschappen in 3D tumormodellen ruimtelijk in kaart.

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Hier beschrijven we een snel en flexibel protocol voor de vorming van 3D-celsferoïden door celaggregatie. Dit is gemakkelijk aanpasbaar voor meerdere celtypen en is geschikt voor gebruik in een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder celmigratie, invasie of anoikis-assays, en voor het visualiseren en kwantificeren van cel-matrix interacties.

Een efficiënt en flexibel Cel aggregatie voor 3D Sferoïde Production

Tumor microenvironment is een essentieel onderdeel van kankergroei en invasie. Om kanker progressie na te bootsen, is een biologisch relevante menselijke matrix nodig. Dit protocol introduceert een verbetering voor de drie-dimensionale sferoïde invasie assay in vitro door het toepassen van een menselijke leiomyoma-gebaseerde matrix. Het protocol introduceert ook een computer-based cel invasie analyse.

Volledig menselijke tumor-gebaseerde matrijs in driedimensionele sferoïde invasie assay

Hier beschrijven we een gebruiksvriendelijke invasietest voor glioblastoom. Deze test is geschikt voor glioblastoom stamcellen-achtige cellen. Een Fiji macro voor eenvoudige kwantificering van invasie, migratie en proliferatie wordt ook beschreven.

Een 3D Spheroid Model voor Glioblastoom

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Uitgebreide in vitro modellen die de relevante menselijke ziekte getrouw samenvatten, ontbreken. De huidige studie presenteert driedimensionale (3D) tumor sferoïde creatie en cultuur, een betrouwbaar in vitro hulpmiddel om de tumor-stromale interactie in humaan hepatocellulair carcinoom te bestuderen.

Een driedimensionaal sferoïde model om de tumor-stromale interactie bij hepatocellulair carcinoom te onderzoeken

De huidige studie beschrijft methodologieën voor het kweken, bevriezen, ontdooien, verwerken, kleuren, labelen en onderzoeken van volledige sferoïden en organoïden onder verschillende microscopen, terwijl ze intact blijven in een hydrogel in een multifunctioneel apparaat.

Kweken, invriezen, verwerken en afbeelden van volledige organoïden en sferoïden terwijl ze nog in een hydrogel zitten

Dit artikel demonstreert een gestandaardiseerde methode voor het construeren van driedimensionale tumorsferoïden. Een strategie voor sferoïde observatie en beeldgebaseerde deep-learning analyse met behulp van een geautomatiseerd beeldvormingssysteem wordt ook beschreven.

Generatie van 3D-tumorsferoïden voor geneesmiddelenevaluatiestudies

Er is een kritieke behoefte aan 3D-kankermodellen die heterocellulaire overspraak vastleggen om kankermetastasen te bestuderen. Onze studie presenteert de generatie van heteromulticellulair stromaal-epitheel in een steiger- en steigervrije omgeving die kan worden gebruikt om invasie en cellulaire ruimtelijke verdelingen te bestuderen.

Heteromulticellulaire stromale cellen in steigervrije 3D-culturen van epitheelkankercellen om invasie te stimuleren

Leer een snelle, kosteneffectieve methode voor de fabricage van tumorsferoïden en hun inkapseling in polyethyleenglycolhydrogels. Dit protocol bootst de tumor-micro-omgeving na zonder gespecialiseerde apparatuur.

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Meer video's verkennen