Screening op histonmodificatie met behulp van vloeistofchromatografie, Trapped Ion Mobility Spectrometry en Time-Of-Flight Mass Spectrometry
12 januari 2024
Een analytische workflow op basis van vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie met ingesloten ionen en time-of-flight-massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor een zeer betrouwbare en zeer reproduceerbare "bottom-up"-analyse van histonmodificaties en identificatie op basis van de belangrijkste parameters (retentietijd [RT], botsingsdoorsnede [CCS] en nauwkeurige massa-tot-lading [m/z]-verhouding).
Er wordt een methode voorgesteld met behulp van het histonextractieprotocol met een efficiëntie van 95%. Samen met LC-TIMS-ToF MS/MS is het mogelijk om in korte tijd een screening te verkrijgen op die PTM's die in het histon aanwezig zijn. En vooral de mogelijkheid om isomeren te scheiden.
De scheiding van isomere peptiden is vaak moeilijk met behulp van tandem-massaspectrometrie alleen. Door TIMS op te nemen, introduceren we een extra dimensie van scheiding, waardoor veel positie-isomeeridentificaties worden vereenvoudigd. Bovendien verhoogt passieve technologie de gevoeligheid van deze experimenten, waardoor ons vermogen om epigenetische variaties te analyseren verder wordt verbeterd.
Met het toegenomen vermogen om PTM-posities te identificeren, komt er de mogelijkheid om de correlatie tussen verschillende omgevings- of biologische factoren en hun effecten op het epigenoom verder te bepalen. Methoden die de analyse van histonen verbeteren en vergemakkelijken, kunnen worden toegepast op verschillende onderzoeksgebieden, waaronder medische en milieuchemie. De dynamiek van eiwitbevestiging in inheemse of beschadigde toestanden zal worden vastgesteld op basis van de implementatie van TIMS MS/MS met HDX.
Door middel van LC-TIMS-ToF MS/MS en Nano LC-TIMS-ToF MS/MS zullen de verschillen in PTM in verschillende biologische monsters in kaart worden gebracht.
Overzicht
Deze studie presenteert een analytische workflow die gebruikmaakt van vloeistofchromatografie, trapped ion mobility spectrometry en time-of-flight massaspectrometrie (LC-TIMS-ToF MS/MS) voor de betrouwbare analyse van histonmodificaties. De methode verbetert aanzienlijk de identificatie van posttranslationele modificaties (PTM's) en hun positionele isomeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Epigenetica
Achtergrond
- Histonen spelen een cruciale rol bij de genregulatie via diverse modificaties.
- Het identificeren van deze modificaties is essentieel voor het begrijpen van epigenetische mechanismen.
- Traditionele methoden kennen uitdagingen bij het scheiden van isomeren.
- De integratie van TIMS biedt een nieuwe dimensie voor een verbeterde scheiding.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor efficiënte histonextractie en -analyse.
- Het verbeteren van de identificatie van PTM's en hun isomeren.
- Het correleren van omgevingsfactoren met epigenetische variaties.
Gebruikte methoden
- Histonextractieprotocol met een efficiëntie van 95%.
- LC-TIMS-ToF MS/MS voor analyse met hoge resolutie.
- Passieve technologie om de gevoeligheid in experimenten te verhogen.
- Screening op PTM's in histonen.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle scheiding van isomeerpeptiden met behulp van TIMS.
- Verbeterde identificatie van PTM-posities.
- Versterkte mogelijkheid om epigenetische variaties te analyseren.
- Potentiële correlaties tussen biologische factoren en het epigenoom.
Conclusies
- De voorgestelde methode verbetert de analyse van histonmodificaties aanzienlijk.
- De integratie van TIMS vereenvoudigt de identificatie van isomeren.
- Deze aanpak opent nieuwe wegen voor verder onderzoek naar epigenetische invloeden.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
High-throughput screening van post-translationele modificaties (PTM's) van histonen met behulp van LC-TIMS-ToF MS/MS voorziet in een kritieke behoefte aan nauwkeurige epigenetische mapping tijdens vroege discovery en target-validatie. De mogelijkheid om PTM-posities met zekerheid toe te wijzen en isomere vormen te onderscheiden, vergroot het voorspellend vertrouwen bij het koppelen van epigenetische toestanden aan biologische responsen. Deze workflow ondersteunt risico-gecorrigeerde portfoliobeslissingen door een robuuste, kwantitatieve analyse mogelijk te maken van chromatine-modificaties die relevant zijn voor ziektemechanismen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt onderzoek naar epigenetische regulatiemechanismen mogelijk door middel van betrouwbare PTM-mapping.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door positionele isomeren van histonmodificaties te onderscheiden.
- Faciliteert biologische risicoreductie door PTM-patronen te correleren met omgevings- of genetische factoren.
- Verbetert het voorspellend vertrouwen voor het verder ontwikkelen van epigenetische targets in de discovery pipeline.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde biologische monsters voor voor downstream screening van chromatine-modificerende verbindingen.
- Levert reproduceerbare, kwantitatieve PTM-profielen voor assay-standaardisatie en benchmarking.
- Maakt schaalbare high-throughput analyse mogelijk die geschikt is voor screeningcampagnes.
- Ondersteunt een betrouwbare evaluatie van de effecten van verbindingen op histonmodificatie-landschappen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt PTM-detectie af met ziekterelevante epigenetische biomarkers wanneer dit wordt ondersteund door de context van het monster.
- Biedt continuïteit van epigenetische mapping in de ontdekkingsfase tot validatie in preklinische modellen.
- Maakt risicogestuurde voortgang mogelijk door PTM-veranderingen als reactie op biologische perturbaties te kwantificeren.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie in translationeel onderzoek door middel van gedetailleerde modificatieprofilering.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Dit LC-TIMS-ToF MS/MS-protocol integreert stappen van vroege ontdekking tot lead-identificatie en ondersteunt zowel hypothese-gestuurde als screening-gebaseerde workflows in epigenetica-onderzoek.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door PTM-patronen te koppelen aan biologische uitkomsten.
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve PTM-gegevens voor de evaluatie van verbindingen en de beoordeling van de reproduceerbaarheid.
- Analytica: Biedt resolutiemetingen van PTM-posities, isomeerscheiding en fragmentatiespectra voor vergelijkende analyse.
- Translationeel onderzoek: Maakt het mogelijk om PTM-profielen af te stemmen op ziektegegevens en biomarkerstrategieën indien relevant.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een herbruikbaar analytisch platform voor voortdurende epigenetische studies over meerdere programma's heen.
Operationele en zakelijke impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellingsvertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van epigenetische targets.
- Operationele waarde: Standaardiseert PTM-analyse met een hoge reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid.
- Strategische waarde: Ondersteunt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliobeheer.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van epigenetische targets en programma's mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in massaspectrometrie, chromatografie en proteomics-data-analyse.
- Vereist toegang tot geavanceerde LC-TIMS-ToF MS/MS-instrumentatie en bijbehorende software.
- Maakt standaardisatie van monstervoorbereidings- en datainterpretatieprotocollen tussen teams noodzakelijk.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende biologische matrices of histonbronnen.
- Instrumentkalibratie en methodeoptimalisatie zijn cruciaal voor reproduceerbaarheid en sensitiviteit.
