Name: Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-10-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Leer gerichte metabolomics van koraalholobionten met gaschromatografie-massaspectrometrie. Deze methode scheidt gastweefsel en Symbiodiniaceae voor nauwkeurige metabolietanalyse en ondersteunt onderzoek naar koraalresistentie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

J.L.M. werd ondersteund door een UTS Chancellor's Research Fellowship.

Metabolietprofilering van harde koraalmonsters met behulp van GC-MS

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling om bekend te maken.

De scheiding van de gastheer en de symbiont is gemakkelijk en snel haalbaar via eenvoudige centrifugatie, en de resultaten hier laten zien dat het scheiden van de fracties waardevolle informatie kan opleveren die wijst op specifieke bijdragen van holobiont-leden, die kunnen bijdragen aan de functionele analyse van de gezondheid van koraal. Bij volwassen koralen wordt de lipidensynthese voornamelijk uitgevoerd door de residente algensymbiont40, die lipiden levert (bijv. triacylglycerol en ...

Metabolieten vertegenwoordigen de eindproducten van cellulaire processen, en metabolomics - de studie van de reeks metabolieten die door een bepaald organisme of ecosysteem worden geproduceerd - kan een directe maatstaf zijn voorhet functioneren van het organisme. Dit is met name van cruciaal belang voor het verkennen van ecosystemen, symbiotische interacties en herstelinstrumenten, aangezien het doel van de meeste beheerstrategieën is om specifieke ecosysteemdienstfuncties te behouden (of te herstellen)2. Koraalriffen zijn een aquatisch ecosysteem dat de potentiële waarde van metabolomics aantoont voor het ophelderen van symbiotische interacties en het koppelen van fysiologische reacties van koraal aan effecten op gemeenschaps- en ecosysteemniveau3. De toepassing van high-throughput gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) wordt vooral gewaardeerd vanwege het vermogen om snel een breed scala aan metabolietklassen gelijktijdig te analyseren met een hoge selectiviteit en gevoeligheid, een snelle identificatie van verbindingen te bieden wanneer spectrale bibliotheken beschikbaar zijn, en een hoge mate van reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid te bieden, met relatief lage kosten per monster.
Koralen zijn holobionten die bestaan uit het koraaldier, fotosynthetische dinoflagellaat-endosymbionten (familie: Symbiodiniaceae4) en een complex microbioom 5,6. Over het algemeen wordt de fitheid van de holobiont voornamelijk gehandhaafd door de uitwisseling van kleine moleculen en elementen om het metabolisch functioneren van elk lid te ondersteunen 7,8,9,10. Metabolomische benaderingen zijn bijzonder krachtig gebleken voor het ophelderen van de metabole basis van symbiosespecificiteit9,11, de bleekreactie op thermische stress 7,8,12,13, ziektereacties 14, blootstellingsreacties aan vervuiling 15, fotoacclimatisatie 16 en chemische signalering 17 bij koralen, evenals bij het helpen ontdekken van biomarkers 18,19. Bovendien kan metabolomics een waardevolle bevestiging bieden van de conclusies die worden afgeleid uit DNA- en RNA-gebaseerde technieken 9,20. Er is daarom een aanzienlijk potentieel voor het gebruik van metabolomics voor het beoordelen van de gezondheid van riffen en het ontwikkelen van instrumenten voor het behoud van riffen3, zoals door de detectie van metabole biomarkers van stress18,19 en voor het onderzoeken van het potentieel van actieve beheerstrategieën zoals voedingssubsidies21.
Het scheiden van de gastheer- en symbiontecellen en het onafhankelijk analyseren van hun metabolietprofielen, in plaats van samen als de holobiont, kan meer informatie opleveren over de partnerinteracties, onafhankelijke fysiologische en metabole statussen en mogelijke moleculaire mechanismen voor aanpassing 11,12,22,23,24. Zonder het koraal en de Symbiodiniaceae te scheiden, is het bijna onmogelijk om de bijdrage en het metabolisme van koraal en/of Symbiodiniaceae onafhankelijk van elkaar op te helderen, behalve met complexe genoomreconstructie en metabole modellering25, maar dit moet nog worden toegepast op de symbiose tussen koraal en dinoflagellaat. Bovendien kan een poging om informatie over het individuele metabolisme van de gastheer of algensymbiont uit het metabolietprofiel van de holobiont te halen, leiden tot verkeerde interpretatie.
Tot voor kort werd bijvoorbeeld gedacht dat de aanwezigheid van C18:3n-6, C18:4n-3 en C16 meervoudig onverzadigde vetzuren in extracten van koraal- en holobiontweefsels afkomstig was van de algensymbiont, omdat werd aangenomen dat koralen niet de ωx-desaturaten bezitten die essentieel zijn voor de productie van omega-3 (ω3) vetzuren; recent genoombewijs suggereert echter dat meerdere cnidarians het vermogen hebben om ω3 PUFA de novo te produceren en ω3 PUFA met lange keten verder te biosynthetiseren26. Het combineren van GC-MS met stabiele isotopenetikettering (bijv. 13 C-bicarbonaat, NaH 13CO3) kan worden gebruikt om het lot van fotosynthetisch gefixeerde koolstof te volgen via koraalholobiont-metabole netwerken onder zowel controleomstandigheden als als reactie op externe stressoren27,28. Een cruciale stap in het volgen van het lot van 13 C is echter de scheiding van het koraalweefsel van de algencellen - alleen dan kan de aanwezigheid van een 13C-gelabelde verbinding in de koraalgastheerfractie ondubbelzinnig worden toegewezen als een van Symbiodiniaceae afgeleide metaboliet die naar hetkoraal wordt verplaatst of een stroomafwaarts product van een getransloceerde gelabelde verbinding. Deze techniek heeft zijn kracht bewezen door de lang gekoesterde veronderstelling uit te dagen dat glycerol de primaire vorm is waarin fotosynthese wordt verplaatst van symbiont naar gastheer29, en door op te helderen hoe de voedingsflux tussen partners verandert tijdens het bleken27,28 en als reactie op incompatibele Symbiodiniaceae species11.
Hoewel de beslissing om weefsels te scheiden voornamelijk wordt gedreven door de onderzoeksvraag, zijn de bruikbaarheid, betrouwbaarheid en potentiële metabole effecten van deze aanpak belangrijk om te overwegen. Hier bieden we gedetailleerde, gedemonstreerde methoden voor de extractie van metabolieten uit de holobiont, evenals de afzonderlijke gastheer- en symbiontenfracties. We vergelijken de metabolietprofielen van de gastheer en symbiont onafhankelijk van elkaar en hoe deze profielen zich verhouden tot het holobiontmetabolietprofiel.

<table><tbody><tr><td>100% LC-grade methanol</td><td>Merck</td><td>439193</td><td>LC grade essentieel</td></tr><tr><td>2 mL microcentrifugebuizen, PP</td><td>Eppendorf</td><td>30121880</td><td>Polypropyleen biedt hoge weerstand tegen chemicaliën, mechanische stress en extreme temperaturen</td></tr><tr><td>2030 Shimadzu gaschromatograaf</td><td>Shimadzu</td><td>GC-2030</td><td></td></tr><tr><td>710-1180 &micro;m zuurgewassen glazen kralen</td><td>Merck</td><td> G1152</td><td>Deze maat is optimaal voor het breken van de Symbiodiniaceae-cellen</td></tr><tr><td>AOC-6000 Plus Multifunctionele autosampler</td><td>Shimadzu</td><td>AOC6000</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagens</td><td>Merck</td><td>B6916</td><td>Elk proteïne colorimetrisch reagens is acceptabel</td></tr><tr><td>Persluchtpistool</td><td>Ozito</td><td>6270636</td><td>Soortgelijk ontwerp acceptabel. Het hebben van een fitting om een 1 mL tip over te passen is cruciaal.</td></tr><tr><td>&nbsp;DB-5 kolom met 0,25 mm interne diameter kolom en 1 &micro;m filmdikte</td><td>Agilent</td><td>122-5013</td><td></td></tr><tr><td>DMF</td><td>Merck</td><td>RTC000098</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol-6-13C en/of 13C5&ndash;15N Valine</td><td>Merck</td><td>605514/ 600148</td><td>Een of beide interne standaarden kunnen aan het methanol worden toegevoegd.</td></tr><tr><td>Vlakbodem 96-well plate</td><td>Merck</td><td>CLS3614</td><td></td></tr><tr><td>Glazen scintillatiebuisjes</td><td>Merck</td><td>V7130</td><td>20 mL, met niet-plastic afdichting</td></tr><tr><td>Immunoglogin G</td><td>Merck</td><td>56834</td><td>Als niet beschikbaar, Bovine Serum Albumin is acceptabel</td></tr><tr><td>Primer</td><td></td><td>v4</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td></td><td>v4.1.2</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu LabSolutions Insight software</td><td></td><td>v3.6</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Merck</td><td>S5881</td><td>Pellets om 1 M oplossing te maken</td></tr><tr><td>tidyverse</td><td></td><td>v1.3.1</td><td>R-pakket</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>Qiagen</td><td>85600</td><td>Of vergelijkbaar</td></tr><tr><td>TQ8050NX triple quadrupole massaspectrometer</td><td>Shimadzu</td><td>GCMS-TQ8050 NX</td><td></td></tr><tr><td>UV-96 well plate</td><td>Greiner</td><td>M3812</td><td></td></tr><tr><td>Whirl-Pak monsterzak</td><td>Merck</td><td>WPB01018WA</td><td>Monsterverzamelzak; Maat: groot genoeg om een ~5 cm koraalfragment te huisvesten, maar niet te groot dat het water te verspreid is</td></tr></tbody></table>

gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters

Gas Chromatography-Mass Spectrometry-Based Targeted Metabolomics of Hard Coral Samples

Op gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) gebaseerde benaderingen hebben bewezen krachtig te zijn voor het ophelderen van de metabole basis van de symbiose tussen cnidarian en dinoflagellaat en hoe koraal reageert op stress (d.w.z. tijdens temperatuurgeïnduceerde bleking). Steady-state metabolietprofilering van het koraalholobiont, dat de cnidarian-gastheer en de bijbehorende microben (Symbiodiniaceae en andere protisten, bacteriën, archaea, schimmels en virussen) omvat, is met succes toegepast onder omgevings- en stressomstandigheden om de holistische metabole status van het koraal te karakteriseren.
Om vragen over de symbiotische interacties te beantwoorden, is het echter noodzakelijk om de metabolietprofielen van de koraalgastheer en zijn algensymbionten onafhankelijk te analyseren, wat alleen kan worden bereikt door fysieke scheiding en isolatie van de weefsels, gevolgd door onafhankelijke extractie en analyse. Hoewel de toepassing van metabolomics relatief nieuw is in het koraalveld, hebben de aanhoudende inspanningen van onderzoeksgroepen geresulteerd in de ontwikkeling van robuuste methoden voor het analyseren van metabolieten in koralen, inclusief de scheiding van het koraalgastheerweefsel en algensymbionten.
Dit artikel presenteert een stapsgewijze handleiding voor holobiont-scheiding en de extractie van metabolieten voor GC-MS-analyse, inclusief belangrijke optimalisatiestappen ter overweging. We laten zien hoe, eenmaal onafhankelijk geanalyseerd, het gecombineerde metabolietprofiel van de twee fracties (koraal en Symbiodiniaceae) vergelijkbaar is met het profiel van het geheel (holobiont), maar door de weefsels te scheiden, kunnen we ook belangrijke informatie verkrijgen over het metabolisme van en interacties tussen de twee partners die niet alleen uit het geheel kan worden verkregen.

Alle gegevens die tijdens deze werkzaamheden zijn geproduceerd, zijn beschikbaar in de aanvullende informatie.
Scheiding van gastheer en symbiont
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65628/65628fig01.jpg"> Figuur 1: Opzet en validatie van de scheiding van koraalgastheerweefsels en Symbiodiniaceae cellen. (A) De opstelli...

Hier presenteren we de extractie en bereiding van polaire en semi-polaire metabolieten uit een koraalholobiont, evenals gescheiden koraalgastheerweefsel en Symbiodiniaceae celfracties, voor gaschromatografie-massaspectrometrie-analyse.

Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters

Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)-based approaches have proven to be powerful for elucidating the metabolic basis of the ...

Zoals bij elk organisme, zijn koralen afhankelijk van superieure voeding om te groeien en riffen te bouwen voor immuniteit en voortplanting en om veranderende omgevingsomstandigheden te weerstaan. Maar we weten heel weinig over optimale voeding voor koralen onder normale of veranderende omstandigheden, en hoe elk lid van de koraalholobiont bijdraagt aan deze voedingsstatus. Koralen zijn holobionten die bestaan uit de gastheer en verschillende symbiotische micro-organismen.Deze omvatten Symbiodiniaceae, protisten, bacteriën, virussen en schimmels. De geschiktheid van de holobiont hangt af van de metabole interacties tussen deze leden. Symbiodiniaceae leveren bijvoorbeeld fotosynthese om het metabolisme van de gastheer te ondersteunen en deze te helpen zich aan te passen aan veranderende omstandigheden.Om dit cruciale partnerschap te begrijpen, moeten we de chemische en metabolische samenstelling van elke partner afzonderlijk bestuderen. Deze bevindingen toonden aan dat meer informatie kon worden verkregen door gastheer- en symbiontenfracties te scheiden voor metabole analyse. De beslissing om afzonderlijke breuken versus de holobiont te analyseren, wordt echter uiteindelijk bepaald door de onderzoeksvraag.Dus in gevallen waarin analyse van de holobiont de voorkeur heeft, hebben we een methodologie gegeven voor holobiont-metabolietextracties en suggesties om zoveel mogelijk informatie te verkrijgen tijdens de analyse. De methoden die in dit onderzoek zijn gebruikt, openen nieuwe wegen voor onderzoek. Deze omvatten het onthullen van potentiële biomarkers, het identificeren van belangrijke metabolieten tijdens specifieke levensfasen of stressomstandigheden, het begrijpen van de voordelen van associatie met bepaalde soorten en het onderzoeken van interacties binnen de holobiont.Toekomstig onderzoek zal zich richten op het toepassen van de protocollen die hier zijn vastgesteld op verschillende onderzoeksgebieden, waaronder de detectie van biomarkers met toepassingen bij het behoud en herstel van koraalriffen. Deze methodologie kan ook worden toegepast wanneer de scheiding van fracties niet mogelijk is voor andere fysiologische metingen. Bijvoorbeeld bij het analyseren van vluchtige metabolietemissies van koraalkolonies.

gas-chromatography-mass-spectrometry-based-targeted-metabolomics-hard

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Non-gerichte metabolietprofilering door ultra-prestatie vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (UPLC-MS) is een krachtige techniek om metabolisme te onderzoeken. Dit artikel schetst een typische werkstroom die wordt gebruikt voor non-gerichte metabolietprofilering van serum, inclusief monsterorganisatie en -voorbereiding, dataverwerving, data-analyse, kwaliteitscontrole en metabolietidentificatie.

Large Scale Niet-gerichte metaboloom profilering van Serum door Ultra Performance Liquid Chromatography-massaspectrometrie (UPLC-MS)

Ongerichte metabolomics biedt een hypothese genererende momentopname van een metabool profiel. Dit protocol zal de extractie en analyse van metabolieten uit cellen, serum of weefsel tonen. Een reeks van metabolieten worden onderzocht met behulp van vloeistof-vloeistof fase-extractie, microflow UltraPerformance vloeistofchromatografie / hoge-resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS) gekoppeld aan differentiële analyse software.

Ongerichte Metabolomics uit biologische grondstoffen gebruiken UltraPerformance Liquid Chromatography-hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-HRMS)

Metaboliet profilering is waardevol geweest in de studie van het metabolisme in gezondheid en ziekte. Gebruik te maken van de normale fasen vloeistofchromatografie gekoppeld aan een hoge resolutie massaspectrometrie met polariteit schakelen en een snelle duty cycle, beschrijven we een protocol bij de polaire metabole samenstelling van biologisch materiaal met een hoge gevoeligheid, nauwkeurigheid en resolutie te analyseren.

Een strategie voor de gevoelige, Large Scale Quantitative Metabolomics

Dit protocol is voor de extractie en concentratie van eiwitten en DNA uit microbiële biomassa die is verzameld uit zeewater, gevolgd door de generatie van tryptische peptiden die geschikt zijn voor proteomische analyse op basis van tandem massaspectrometrie.

Een Aquatic Microbial MetaProteomics Workflow: Van cellen tot Tryptic Peptiden geschikt voor Tandem massaspectrometrie-gebaseerde Analyse

Een tweedimensionale gaschromatografie-tijd-van-vlucht-massaspectrometrie methode wordt beschreven voor de karakterisering van de waterige fractie van bio-crude geproduceerd uit hydrothermale liquefactie van algen. Dit protocol kan ook worden gebruikt om de waterige fractie van vloeibare producten te analyseren van snelle pyrolyse, katalytische snelle pyrolyse, katalytische deoxygenatie en hydro-behandeling.

Kwalitatieve Karakterisering van de waterfractie van hydrothermale liquefactie van algen gebruiken 2D gaschromatografie met Time-of-flight massaspectrometrie

Een verbeterde polymerasekettingreactie-restrictiefragment lengte polymorfisme werkwijze voor genotyperen kogelvis soorten van vloeistofchromatografie / massaspectrometrie beschreven. Een omgekeerde-fase-silica monoliet kolom wordt toegepast voor het scheiden van geknipt amplicons. Deze methode kan de mono-isotopische massa van oligonucleotiden, die bruikbaar is voor het identificeren basissamenstelling helderen.

Verbeterde Polymerase Chain Reaction-restrictiefragmentlengtepolymorfisme Genotypering van Toxic Pufferfish door vloeistofchromatografie / massaspectrometrie

Dit protocol wordt beschreven hoe voor te bereiden Drosophila larven op basis van GC-MS metabolomic analyse.

Voorbereiding van Drosophila larvale monsters van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)-gebaseerd metabolomica

Dit protocol beschrijft een interne doorvoer voor aanvullende analytische en omics technieken, culminerend in een volledig gekoppeld karakterisering van natuurlijke organische stof en microbiële proteomics in verschillende ecosystemen. Deze aanpak maakt robuuste vergelijkingen voor het identificeren van de metabolische banen en het transformaties die belangrijk zijn voor het beschrijven van de gasproductie van broeikasgassen en het voorspellen van reacties op veranderingen in het milieu.

Single-doorvoer complementaire High-resolution analytische technieken voor het karakteriseren van complexe natuurlijke organische stof mengsels

Een methode voor de ongerichte analyse van tarwekorrels metabolieten en lipiden wordt gepresenteerd. Het protocol omvat een acetonitril metabolietextractiemethode en omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometriemethodologie, met acquisitie in positieve en negatieve elektrospray ionisatiemodi.

Ongerichte vloeibare chromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde metabolomics analyse van tarwekorrel

Het manuscript presenteert on-site bemonstering van menselijke hersentumoren met vaste fase microextractie, gevolgd door hun biochemische profilering naar de ontdekking van biomarkers.

On-Site bemonstering en extractie van hersentumoren voor metabolomics en lipidomics analyse

Er wordt een methode voor metabolomicse analyse van gerst gepresenteerd. De methode omvat fractievorming en derivatisatie van metabolieten en analyse daarvan door gaschromatografie/massaspectrometrie (GC/MS). Metabolomicse analyse kan worden gebruikt om het effect van gemengde teelten en droogtestress op het graan te bepalen.

Metabolomicse analyse van gerst door middel van gaschromatografie/massaspectrometrie

Leer gerichte metabolomics van koraalholobionten met gaschromatografie-massaspectrometrie. Deze methode scheidt gastweefsel en Symbiodiniaceae voor nauwkeurige metabolietanalyse en ondersteunt onderzoek naar koraalresistentie.

Gaschromatografie-massaspectrometrie-gebaseerde gerichte metabolomics van harde koraalmonsters

Meer video's verkennen