Name: Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Leer hoe je monolayer grafeen-gecoate roosters maakt voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol minimaliseert achtergrondruis en verbetert de beeldkwaliteit van biologische monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken Dr. Xiao Fan voor nuttige discussies bij het vaststellen van deze methoden bij Scripps Research. B.B. werd ondersteund door een postdoctoraal onderzoeksbeurs van de Hewitt Foundation for Medical Research. W.C. wordt ondersteund door een predoctorale beurs van de National Science Foundation. D.E.P wordt ondersteund door de subsidie van de National Institutes of Health (NIH) NS095892 aan GCL. Dit project werd ook ondersteund door NIH-subsidies GM142196, GM143805 en S10OD032467 aan GCL.

TEM-roosters coaten met een monolaag van grafeen

<ol><li>Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+electron+dose+rate+on+electron+counting+images+recorded+with+the+K2+camera%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera.</a> Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).</li>
<li>Tang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMAN2%3A+An+extensible+image+processing+suite+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).</li>
<li>Zivanov, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+automated+high-resolution+cryo-EM+structure+determination+in+RELION-3%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3.</a> eLife. 7, 1-22 (2018).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CryoSPARC%3A+Algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).</li>
<li>Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-atomic+resolution+reconstructions+of+icosahedral+viruses+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-particle+cryo-EM+at+atomic+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-particle cryo-EM at atomic resolution.</a> Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).</li>
<li>Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+individual+atoms+of+protein+complex+by+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy.</a> Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+protein+structure+determination+by+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM.</a> Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).</li>
<li>Schultz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+blot-and-plunge+freezing+of+biological+specimens+for+single-particle+cryogenic+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteins%2C+interfaces%2C+and+cryo-em+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Colloid+%26+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Proteins, interfaces, and cryo-em grids.</a> Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).</li>
<li>Glaeser, R. M., Han, B. -G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+hazards+faced+by+macromolecules+when+confined+to+thin+aqueous+films%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films.</a> Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).</li>
<li>Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer-crystal+streptavidin+support+films+provide+an+internal+standard+of+cryo-EM+image+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality.</a> Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+CryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, 1-42 (2018).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).</li>
<li>Liu, N., Wang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Better+cryo-EM+specimen+preparation%3A+how+to+deal+with+the+air-water+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface.</a> Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+effects+of+particle+adsorption+to+the+air-water+interface+in+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM.</a> Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).</li>
<li>Palovcak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+robust+procedure+for+preparing+graphene-oxide+cryo-EM+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids.</a> Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Pantelic, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene%3A+substrate+preparation+and+introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene: substrate preparation and introduction.</a> Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).</li>
<li>Russo, C. J., Passmore, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+an+optimal+specimen+support+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy.</a> Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).</li>
<li>Passmore, L. A., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specimen+preparation+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Specimen preparation for high-resolution cryo-EM.</a> Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+monolayer+graphene+grids+for+near-atomic+resolution+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+ultraclean+atomically+thin+membranes+for+atomic-resolution+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy.</a> Nature Communications. 11 (1), 541(2020).</li>
<li>Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhn%2C+E+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. (Cvd), (2021).</li>
<li>Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+graphene+supports+for+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).</li>
<li>Fan, H., Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+graphene+grids+for+cryoelectron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Developing graphene grids for cryoelectron microscopy.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).</li>
<li>D'Imprima, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+denaturation+at+the+air-water+interface+and+how+to+prevent+it%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it.</a> eLife. 8, e42747(2019).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+copper+step+beams+during+graphene+growth+by+CVD+method%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Surface+Science%22%5BJournal%5D)">Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method.</a> Applied Surface Science. 610, 155518(2023).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+thin+ice+on+ultraflat+graphene+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM.</a> Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).</li>
<li>Fujita, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epoxidized+graphene+grid+for+highly+efficient+high-resolution+cryoEM+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis.</a> Scientific Reports. 13, 2279(2023).</li>
<li>Lu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionalized+graphene+grids+with+various+charges+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM.</a> Nature Communications. 13, 6718(2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Het bewaren van biologische monsters in een dunne laag glasachtig ijs is een uiterst belangrijke stap voor de bepaling van de cryoEM-structuur met hoge resolutie. Onderzoekers stuiten echter vaak op problemen die voortvloeien uit interacties met de AWI, die voorkeursoriëntatie, complexe demontage, denaturatie en aggregatie introduceert. Bovendien kunnen monsters niet altijd voldoende worden geconcentreerd om het dunne ijs te vullen dat over de gaten van een gefenestreerde film hangt. Verschillende onderzoeksgroepen hebben methoden ontwikkeld om EM-roosters te coaten met een monolaag van grafeen om enkele van deze beperkingen te helpen overwinnen 24,25,26,27,28,29,30, en grafeenroosters zijn met groot succes gebruikt. Hier geven we stap-voor-stap instructies voor het effectief intern voorbereiden van batches grafeenroosters en het onderzoeken van de kwaliteit van de grafeenroosters door TEM. We benadrukken dat bijzondere voorzichtigheid moet worden betracht tijdens enkele van de kritieke stappen, die we hieronder schetsen.
Grafeen heeft een sterke neiging om verontreinigingen in de lucht aan te trekken. Daarom is het tijdens het fabricageproces van grafeenroosters belangrijk om ervoor te zorgen dat alle gereedschappen die in contact komen met de grafeen/Cu-plaat of de roosters schoon en stofvrij zijn. Glazen dekglaasjes die worden gebruikt om grafeen over te brengen, kunnen worden gereinigd door te spoelen met ethanol en gedistilleerd water of met een air-duster. Het is ook aan te raden om onder een zuurkast te werken en grafeenplaten en roosters te allen tijde af te dekken met folie of een schone glasplaat. Stof of verontreinigingen op de roosters kunnen ervoor zorgen dat grafeen zich niet goed hecht aan de EM-roosters. Bij het hanteren van grafeen of met grafeen gecoate roosters is het belangrijk om elektrisch geaard te zijn om schade aan de grafeenfilm door statische ontlading te voorkomen. Statische ontlading kan worden voorkomen door een aardingsband aan de pols te gebruiken, een geaard metalen voorwerp aan te raken telkens wanneer grafeen of grafeenroosters worden gehanteerd, en/of geen handschoen te dragen aan de hand die het pincetvasthoudt 24.
Aangezien een monolaag van grafeen erg dun is (de breedte van een koolstofatoom), is het belangrijk om grafeen te ondersteunen met een organische laag zoals MMA of poly-MMA (PMMA) tijdens de overdracht van grafeen naar roosters. PMMA is het meest gebruikte materiaal voor grafeenoverdracht. PMMA heeft echter een sterke affiniteit met grafeen en kan vaak leiden tot polymeerverontreiniging op de grafeenfilm. MMA wordt in dit protocol gebruikt, omdat het minder restverontreiniging achterlaat25. Zowel PMMA als MMA hebben echter het nadeel dat ze rimpels en scheuren vormen die in sommige delen van de grafeenfilm kunnen worden waargenomen (Figuur 3B). Het kan een uitdaging zijn om deze rimpels te vermijden, omdat ze vaak voorkomen tijdens de groei van grafeen door de CVD-methode31. Recent is een methode ontwikkeld voor het kweken van ultraplat grafeen zonder rimpels, waarbij de koperfolie wordt vervangen door een Cu(111)/saffierwafer als groeisubstraat32.
Op basis van onze ervaring is het beter om grafeen/Cu-platen aan te schaffen en het grafeen met MMA in eigen huis te ondersteunen dan met polymeer bedekte Cu-grafeenplaten van fabrikanten te kopen, die broos worden na het etsen van koper en moeilijk te hanteren zijn in volgende stappen. De spincoater die we gebruikten voor MMA-coating kan goedkoop worden gebouwd met onderdelen van een lokale computer/bouwmarkt, zoals eerder beschreven25.
Tijdens de stap van MMA-coating is het belangrijk om het volledige grafeenoppervlak op de Cu-grafeenplaat met MMA te bedekken. Nadat de Cu is weggeëtst, wordt MMA-grafeen semi-transparant en zien gebieden zonder MMA-dekking eruit als lege gaten. Om MMA-coating aan de koperzijde te voorkomen, is het belangrijk om er tijdens het coaten een klein stukje vloeipapier onder te leggen, zodat het overtollige MMA opneemt dat uit de CVD-film spint.
Na het etsen en spoelen is de MMA/grafeenplaat klaar om te worden overgebracht naar EM-roosters met behulp van een commercieel of zelfgemaakt trogsysteem met een spuit of peristaltische pomp om het waterniveau te regelen. Voorafgaand aan de overdrachtsstap is het belangrijk om de roosters grondig voor te spoelen in opeenvolgende baden met chloroform, aceton en IPA. Het bakken van met grafeen gecoate roosters op 65 °C helpt de integriteit van grafeen te behouden en bevordert de adsorptie van grafeen aan de roosters. Tot slot is het belangrijk om MMA contaminatie op de roosters te voorkomen en MMA grondig te verwijderen in een aceton bad en de roosters schoon te maken in IPA. Eventuele ongewassen MMA-resten worden waargenomen op EM-roosters en verminderen de signaal-ruisverhouding van de beelden (Figuur 3C). Het aceton-IPA-wasproces kan worden herhaald om de grafeenoppervlakken verder te reinigen.
Om grafeenroosters hydrofiel te maken, hebben we de roosters blootgesteld aan UV/Ozon. Verschillende modellen UV/ozonreinigers kunnen geoptimaliseerd moeten worden om de grafeenlaag voldoende zuurstof te geven voor de voorbereiding van cryoEM-monsters zonder het grafeen te beschadigen. Ongeacht het systeem is het van cruciaal belang om deze roosters onmiddellijk na de UV/Ozon-behandeling te gebruiken voor het aanbrengen van cryoEM-monsters. Alternatieve methoden om grafeenroosters hydrofiel te maken worden beschreven in andere studies33,34.

Single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) is een steeds meer toepasbare technologie die wordt gebruikt om de 3D-structuren van biomacromoleculen te onderzoeken. Technologische vooruitgang op het gebied van elektronenmicroscoopoptica, directe elektronendetectie1 en computeralgoritmen 2,3,4 in het afgelopen decennium hebben cryoEM-gebruikers in staat gesteld de structuren van biochemisch stabiele macromoleculaire complexen te bepalen tot een bijna atomaire resolutie 5,6,7,8 . Ondanks deze vooruitgang blijven er opmerkelijke barrières bestaan voor het bewaren van monsters voor cryoEM-beeldvorming, waardoor de meerderheid van de biologische monsters niet met zulke hoge resoluties kan worden opgelost.
Monstervoorbereiding voor cryoEM-analyse met hoge resolutie omvat het vangen van macromoleculen die gelijkmatig verdeeld zijn in een breed scala aan oriëntaties in een dunne laag verglaasd ijs. De "blot and plunge"-methoden voor invriezen zijn de meest gebruikte methoden die worden gebruikt om dunne films van biologische monsters op roosters te genereren voor cryoEM-onderzoeken 9,10. Deze methoden omvatten het aanbrengen van een paar microliter monsteroplossing op een EM-rooster met een gefenestreerde film die hydrofiel is gemaakt en vervolgens het grootste deel van het monster wegvegen met filtreerpapier voordat het rooster snel in een cryogeen van vloeibaar ethaan of ethaan-propaanmengsel wordt gedompeld9.
Hoewel deze methode met succes is gebruikt om structuren van een breed scala aan biologische monsters te bepalen, stellen alle veelgebruikte cryoEM-monstervoorbereidingsmethoden monsters bloot aan de hydrofobe lucht-waterinterface (AWI), wat vaak problemen met zich meebrengt die de structuurbepaling met hoge resolutie beperken. Het is vastgesteld dat biologische monsters een hoge neiging hebben om te denatureren wanneer ze worden blootgesteld aan de AWI, wat kan leiden tot complexe aggregatie en demontage11,12,13,14. Bovendien zorgen hydrofobe vlekken op het oppervlak van biologische monsters ervoor dat deeltjes hun voorkeursoriëntaties in het ijs aannemen12. In veel scenario's dwingt een enkel hydrofoob gebied van het monster alle deeltjes om een enkelvoudige oriëntatie in het ijs aan te nemen, waardoor het vermogen om een betrouwbare reconstructie te genereren wordt opgeheven. Naast problemen met de AWI, kunnen monsters een affiniteit vertonen voor het oppervlak van de gefenestreerde filmlaag, waardoor het aantal deeltjes dat in het ijs in de gaten is gesuspendeerd, wordt beperkt15.
Er zijn verschillende methodologische en technologische oplossingen ontwikkeld om deze problemen die voortvloeien uit interacties met het AWI of de filmste verminderen 16,17. Een populaire aanpak is om de gefenestreerde film van de EM-roosters te coaten met een dunne (tientallen nanometers) laag amorfe koolstof. Deze coating zorgt voor een doorlopend oppervlak over de gaten waaraan deeltjes kunnen adsorberen, met als voordeel dat het monster gedeeltelijk wordt afgeschermd van interacties met de AWI15,18,19,20. De extra koolstoflaag verhoogt echter de hoeveelheid achtergrondsignaal in de afgebeelde gebieden, waardoor ruis ontstaat die de haalbare resolutie in gevaar kan brengen, met name voor kleine (<150 kDa) exemplaren. In de afgelopen jaren is aangetoond dat het gebruik van grafeenoxide (GO)-vlokken om ondersteunende films op cryoEM-roosters te produceren, voordelen heeft ten opzichte van traditionele amorfe koolstof. GO-vlokken worden geproduceerd door de oxidatie van grafietlagen, wat resulteert in pseudo-kristallijne vellen van monolaags grafiet die hydrofiel zijn vanwege hun substantiële zuurstofgehalte in de vorm van carboxyl-, hydroxyl- en epoxygroepen op de oppervlakken en randen. Commerciële GO-vlokken in waterige suspensies zijn niet duur en er zijn tal van gepubliceerde methoden voor het aanbrengen van GO-vlokken op EM-roosters18,21. Deze methoden resulteren echter vaak in roosters die slechts gedeeltelijk bedekt zijn met GO-vlokken, evenals regio's die meerdere lagen GO-vlokken bevatten. Verder dragen GO-vlokken een merkbaar achtergrondsignaal bij aan cryoEM-beelden dat dicht in de buurt komt van het signaal dat wordt waargenomen met dunne amorfe koolstof22,23.
Ongerept monolaaggrafeen, dat bestaat uit een enkele 2D-kristallijne reeks koolstofatomen, onderscheidt zich van GO doordat het geen fasecontrast produceert in de elektronenmicroscoop. Monolayer grafeen kan dus worden gebruikt om een onzichtbare ondersteuningslaag te genereren voor het in beeld brengen van biologische monsters. Monolaag grafeen is ook sterker dan GO en kan worden aangebracht als een enkele monolaag op een EM-raster, en recente ontwikkelingen in de fabricage van met grafeen gecoate EM-rasters hebben het mogelijk gemaakt om monolaagse grafeenroosters met een hoge dekking in eigen huis te bereiden 24,25,26,27,28,29,30. Ondanks de voordelen van het gebruik van met grafeen gecoate roosters voor het bepalen van de cryoEM-structuur, worden ze echter niet veel gebruikt vanwege de onbetaalbare kosten van commerciële opties en de complexiteit van interne productie. Hier beschrijven we een stap-voor-stap handleiding voor het effectief produceren van EM-roosters bedekt met een monolaag grafeen voor cryoEM-structuurbepaling van biologische monsters (Figuur 1). Door dit gedetailleerde protocol te volgen, kunnen cryoEM-onderzoekers op één dag tientallen hoogwaardige grafeen-ondersteuningsroosters reproduceerbaar voorbereiden. De kwaliteit van de met grafeen gecoate roosters kan gemakkelijk worden onderzocht met behulp van een low-end transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) die is uitgerust met een LaB6-filament.

<table><tbody><tr><td>70% EtOH</td><td>Pharmco (190 pf EtOH)</td><td>241000190CSGL</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650501-4L</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215589-500g</td><td>Gevaarlijk; extreme voorzichtigheid</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2432-1L</td><td></td></tr><tr><td>Klem TEM Grid Holder Blok voor 45 Grids</td><td>PELCO</td><td>16830-45</td><td></td></tr><tr><td>Computer ventilator</td><td>Amazon (Noctua)</td><td>B07CG2PGY6</td><td></td></tr><tr><td>Dekglas</td><td>Bellco Glass</td><td>1203J71</td><td>Standaard dekglazen</td></tr><tr><td>Kristallisatie schotel</td><td>Pyrex</td><td>3140-100</td><td></td></tr><tr><td>Elektronica stofafzuiger</td><td>Falcon Safety Products</td><td>75-37-6</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Dust-off Lucht Spuitbus</td><td>Staples</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapieren</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Fijne punt pincet</td><td>Dumont</td><td>0508-L4-PO</td><td></td></tr><tr><td>Kolf</td><td>Pyrex</td><td>4980-500</td><td></td></tr><tr><td>Vork</td><td>Supermarkt</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glazen pasteur pipet</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>Grafeen/Cu</td><td>Graphenea</td><td>N/A</td><td>CVD monolaag grafeen cu</td></tr><tr><td>Grid Coating Trog</td><td>Ladd Research Industries</td><td>10840</td><td>Breekbaar</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Kapton Tape</td><td>Amazon (MYJOR)</td><td>MY-RZY001</td><td>Polyimide tape</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Lange pincet</td><td>Cole Parmer Essentials</td><td>UX-07387-15</td><td></td></tr><tr><td>Metalen grid holder</td><td>Ted Pella</td><td>16820-81</td><td></td></tr><tr><td>MMA(8.5)MMA EL 6</td><td>KAYAKU Advanced Materials</td><td>M31006 0500L 1GL</td><td>Ontvlambaar</td></tr><tr><td>Model 10 Lab Oven</td><td>Quincy Lab, Inc.</td><td>FO19013</td><td></td></tr><tr><td>Petri schotel</td><td>Pyrex</td><td>3610-102</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner (Solarus 950)</td><td>Gatan, Inc.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fiskars</td><td>194813-1010</td><td></td></tr><tr><td>Standaard Analog Orbital Shaker</td><td>VWR</td><td>89032-088</td><td></td></tr><tr><td>UltrAuFoil R1.2/1.3 - Au300</td><td>Quantifoil</td><td>N/A</td><td>Gatjes gouden roosters</td></tr><tr><td>Ultraviolet Ozon Reinigingssystemen</td><td>UVOCS</td><td>model T10X10/OES</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Fabrication of Monolayer Graphene-Coated Grids for Cryoelectron Microscopy

Cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM) is naar voren gekomen als een krachtige techniek om de atomaire structuur van macromoleculaire complexen te onderzoeken. Monstervoorbereiding voor cryoEM vereist het bewaren van monsters in een dunne laag glasachtig ijs, meestal gesuspendeerd in de gaten van een gefenestreerde steunfilm. Alle veelgebruikte benaderingen voor monstervoorbereiding voor cryoEM-onderzoeken stellen het monster echter bloot aan het lucht-watergrensvlak, waardoor een sterk hydrofoob effect op het monster wordt geïntroduceerd dat vaak resulteert in denaturatie, aggregatie en complexe dissociatie. Verder beïnvloeden geprefereerde hydrofobe interacties tussen regio's van het monster en de lucht-waterinterface de oriëntaties van de macromoleculen, wat resulteert in 3D-reconstructies met anisotrope directionele resolutie. 
Het is aangetoond dat adsorptie van cryoEM-monsters op een monolaag grafeen helpt de interacties met het lucht-watergrensvlak te verminderen en tegelijkertijd de introductie van achtergrondgeluid te minimaliseren. Grafeenondersteuningen bieden ook het voordeel dat ze de vereiste concentratie van eiwitten die nodig zijn voor cryoEM-beeldvorming aanzienlijk verlagen. Ondanks de voordelen van deze ondersteuningen, worden met grafeen gecoate roosters niet veel gebruikt door de cryoEM-gemeenschap vanwege de onbetaalbare kosten van commerciële opties en de uitdagingen die gepaard gaan met grootschalige in-house productie. Dit artikel beschrijft een efficiënte methode voor het bereiden van batches cryoEM-roosters die bijna volledig bedekt zijn met monolaag grafeen.

Succesvolle uitvoering van het hier beschreven fabricageprotocol voor grafeenrasters zal resulteren in EM-rasters die volledig zijn gecoat met een enkele monolaag grafeen. De grafeendekking van de roosters kan worden gecontroleerd met behulp van elke TEM. Aangezien een monolaag schoon grafeen bijna onzichtbaar is in de TEM, moet men deze onderzoeken met behulp van de diffractiemodus van de microscoop en Bragg-vlekken observeren die overeenkomen met de zeshoekige organisatie van de koolstofatomen waaruit het grafeen bestaat (Figuur 3A). Het is normaal om af en toe enkele rimpels van monolaag grafeen waar te nemen, die worden geïntroduceerd tijdens MMA-coating (Figuur 3B). Men kan ook de mate van verontreiniging op het grafeen controleren door een sterk vergroot beeld te verkrijgen in het midden van een van de met grafeen bedekte gaten (Figuur 3C). Indien verkregen met een detector met hoge resolutie, zou een Fouriertransformatie van dit beeld Bragg-vlekken moeten bevatten die overeenkomen met een koolstof-koolstofafstand op 2,14 Å (Figuur 4C). Een monolaag van koolstofatomen produceert niet voldoende elektronenverstrooiing om fasecontrast te genereren, en dus zal een afbeelding van schoon grafeen geen Thon-ringen vertonen die verband houden met de contrastoverdrachtsfunctie in een Fouriertransformatie van het beeld. Het is echter erg moeilijk om besmetting van grafeenroosters te voorkomen nadat ze zijn geproduceerd, en onvoldoende wassen van de EM-roosters of het verwijderen van MMA na grafeencoating zal resulteren in opmerkelijke verontreinigingen op de roosters die zichtbaar zijn in de real-space beelden (Figuur 3C). Zoals te zien is in figuur 4, hebben grafeenroosters een concentrerend effect op een monster, zoals waargenomen bij het vergelijken van 0,5 mg/ml apoferritine wordt toegepast op holle goudroosters met (Figuur 4A) en zonder de grafeenondersteuning (Figuur 4B). Soortgelijke grafeenfabricageprotocollen zijn eerder beschreven om cryoEM-structuren van eiwitten zoals apoferritine op te lossen met een hoge resolutie25,27.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig01.jpg"> Figuur 1: Schema voor het maken van met grafeen gecoate cryoEM-roosters. De belangrijkste stappen in het proces van de fabricage van grafeenrasters worden geïllustreerd. Afkortingen: cryoEM = cryogene elektronenmicroscopie; MMA = methylmethacrylaat; APS = ammoniumpersulfaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig02.jpg"> Figuur 2: Benodigde materialen voor het maken van grafeenroosters. (A) Benodigde materialen voor het coaten van cryo-EM-roosters zijn dienovereenkomstig geëtiketteerd. (B) Close-up van de coater met grafeen/Cu-vel geplakt op een vloeipapier op een glasplaatje. De spincoater kan worden geassembleerd door onderdelen te kopen bij een plaatselijke computer/ijzerhandel. (C) Close-up van de roostercoatingtrog die is bevestigd aan een spuit die kan worden gebruikt om het waterpeil te regelen. Roosters worden op een vloeipapier op een roestvrijstalen gaas geplaatst. Het vloeipapier helpt bij het manoeuvreren van de locatie van de rasters, zodat het grafeenvel erop kan worden afgestemd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig03.jpg"> Figuur 3: Een representatief beeld van een diffractiepatroon en heldere veldbeelden van een grafeenraster dat rimpels of MMA-verontreiniging vertoont . (A) EM-roosters bedekt met een monolaag grafeen zullen Bragg-pieken vertonen die overeenkomen met het zeshoekige rooster van het grafeen wanneer ze worden afgebeeld in een TEM in diffractiemodus. De Bragg-piek die overeenkomt met de koolstof-koolstofafstand van 2,14 Å is omcirkeld en aangegeven met een pijl. (B) Een helderveldafbeelding van een monolaag grafeenraster met enkele rimpels (aangeduid met een pijl) in de grafeenmonolaag. (C) Een helderveldbeeld van monolaags grafeen met MMA-verontreiniging (aangeduid met een pijl). Schaalbalken = 100 nm (B,C). Afkortingen: EM = elektronenmicroscopie; MMA = methylmethacrylaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65702/65702fig04.jpg"> Figuur 4: Apoferritine op met grafeen bedekte goudroosters: (A) CryoEM-microfoto van 0,5 mg/ml apoferritine op met grafeen bedekte goudroosters. (B) Apoferritine dat in dezelfde concentratie in beeld is gebracht, is in een aanzienlijk lagere concentratie zichtbaar wanneer het wordt bereid met behulp van holle goudroosters zonder grafeen. (C) FFT van de cryoEM-microfoto van 0,5 mg/ml apoferritine op met grafeen bedekte goudroosters, waarbij de Bragg-pieken overeenkomen met het zeshoekige grafeenrooster. Schaalbalken = 100 nm (A,B). Afkortingen: cryoEM = cryogene elektronenmicroscopie; FFT = snelle Fouriertransformatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65702/65702fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has emerged as a powerful technique for probing the atomic structure of macromolecular complexes. Sample ...

Momenteel is het optimaal bewaren van biologische monsters een grote uitdaging bij het verkrijgen van CryoEM-structuren met een hoge resolutie. Tijdens het monstervoorbereidingsproces worden monsters blootgesteld aan hydrofobe lucht-waterinterface, die denaturerende effecten heeft op de monsters en ervoor kan zorgen dat stabiele monsters een voorkeursoriëntatie in het ijs aannemen, wat structuurbepaling met hoge resolutie verhindert. Het coaten van CryoEM-roosters met een dunne laag koolstof van zacht grafeenoxide, wordt vaak gebruikt om problemen aan te pakken die verband houden met interacties met het grensvlak tussen lucht en water.Deze lagen verhogen echter vaak de achtergrondruis in onze afbeeldingen, wat de resoluties van onze structuur in gevaar brengt. Door het raster te coaten met een monolaag grafeen wordt een vergelijkbare bescherming bereikt zonder noemenswaardige achtergrondruis te introduceren. Het gebruik van met grafeen gecoate CryoEM-roosters kan helpen bij het oplossen van problemen met betrekking tot interacties met lucht-waterinterfaces, maar commerciële grafeenroosters zijn duur en veel laboratoria beschouwen grafeenroosters als te ingewikkeld om intern te bereiden.Onderzoekers op het gebied van CryoEM kunnen dit stap-voor-stap protocol nu gebruiken om op één dag volledig geproduceerde tientallen grafenen van hoge kwaliteit te reproduceren.

fabrication-monolayer-graphene-coated-grids-for-cryoelectron

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

De toepassing van steunlagen op cryogene elektronenmicroscopie (cryoEM)-roosters kan de deeltjesdichtheid verhogen, interacties met de lucht-waterinterface beperken, door bundels geïnduceerde beweging verminderen en de verdeling van deeltjesoriëntaties verbeteren. Dit artikel beschrijft een robuust protocol voor het coaten van cryoEM-roosters met een monolaag grafeen voor een betere voorbereiding van cryomonsters.

Toepassing van monolaag grafeen op cryo-elektronenmicroscopieroosters voor structuurbepaling met hoge resolutie

In deze video laten we zien hoe het neuron microfluïdische apparaat gebruiken zonder plasma-bonding.

Niet-plasma Verlijmen van PDMS voor goedkope Fabricage van microfluïdische apparaten

Dit protocol beschrijft hoe het genereren van carbon fiber elektroden. De elektroden worden vervolgens gebruikt om de catecholamine vrijlating detecteren van blaasjes met koolstofvezel amperometrie.

Fabricage van Amperometrisch Elektroden

Fabricage en validatie van een add-on platform dat betere controle over de ruimtelijke en temporele oxygenatie in een 6-wells plaat biedt. Het apparaat is aan te passen aan een aantal cultuur-systemen en kan worden gebruikt om de effecten van zuurstof op wondgenezing te onderzoeken.

Fabricage en exploitatie van een zuurstof Inzetstuk voor hechtend Cellular Culturen

De aard van de interactie tussen hematopoietische stamcellen en progenitorcellen (HSPCs) en beenmerg nissen wordt slecht begrepen. Aangepaste hardware wijzigingen en een meerstaps overname protocol maken het gebruik van twee-foton en confocale microscopie beeld ex vivo gemerkte HSPCs geadopteerd in beenmerg gebieden volgen interacties en beweging.

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Het verkrijgen van hoogwaardige transmissie-elektronenmicroscoopbeelden is een uitdaging, vooral in het geval van plantencellen, die overvloedige grote watergevulde vacuolen en beluchte ruimtes hebben. Tandem hogedrukvriestechniek en snelle vriessubstitutie verminderen de bereidingstijd van plantenmonsters voor TEM aanzienlijk, terwijl ze monsters produceren met uitstekende ultrastructurele behoud.

Tandem Hogedruk Invriezen en Quick Freeze Vervanging van plantaardige weefsels voor Transmission Electron Microscopy

Hier presenteren we een protocol voor het combineren van twee monster verwerkingstechnieken, hogedruk bevriezing en magnetron-bijgewoonde monster verwerking, gevolgd door minimaal hars inbedding voor het verkrijgen van gegevens met een gerichte ion beam scannende elektronen microscoop (FIB-SEM). Dit is aangetoond door middel van een muis nervus monster en Caenorhabditis elegans.

Bereiding van de biologische monsters door hogedruk bevriezing, magnetron-bijgewoonde contrastverbetering, en minimale hars inbedding voor Volume Imaging

Hier beschrijven we de voorbereiding van van menselijke organoïden afgeleide intestinale epitheliale monolagen voor het bestuderen van de darmbarrièrefunctie, permeabiliteit en transport. Omdat organoïden de oorspronkelijke reactie van epitheelweefsel op externe stimuli vertegenwoordigen, combineren deze modellen de voordelen van uitbreidbaarheid van cellijnen en de relevantie en complexiteit van primair weefsel.

Organoïde-afgeleide epitheliale monolaag: een klinisch relevant in vitro model voor de darmbarrièrefunctie

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

De toenemende vraag naar grootschalige gegevensverzameling in cryogene elektronentomografie vereist routines voor beeldverwerving met hoge doorvoer. Hier wordt een protocol beschreven dat de recente ontwikkelingen van geavanceerde acquisitiestrategieën implementeert die gericht zijn op het maximaliseren van de tijdsefficiëntie en doorvoer van tomografische gegevensverzameling.

Strategieën voor optimalisatie van cryogene elektronentomografiegegevensverwerving

Leer hoe je monolayer grafeen-gecoate roosters maakt voor cryo-elektronenmicroscopie. Dit protocol minimaliseert achtergrondruis en verbetert de beeldkwaliteit van biologische monsters.

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Meer video's verkennen