Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie
8 september 2023
Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.
Momenteel is het optimaal bewaren van biologische monsters een grote uitdaging bij het verkrijgen van CryoEM-structuren met een hoge resolutie. Tijdens het monstervoorbereidingsproces worden monsters blootgesteld aan hydrofobe lucht-waterinterface, die denaturerende effecten heeft op de monsters en ervoor kan zorgen dat stabiele monsters een voorkeursoriëntatie in het ijs aannemen, wat structuurbepaling met hoge resolutie verhindert. Het coaten van CryoEM-roosters met een dunne laag koolstof van zacht grafeenoxide, wordt vaak gebruikt om problemen aan te pakken die verband houden met interacties met het grensvlak tussen lucht en water.
Deze lagen verhogen echter vaak de achtergrondruis in onze afbeeldingen, wat de resoluties van onze structuur in gevaar brengt. Door het raster te coaten met een monolaag grafeen wordt een vergelijkbare bescherming bereikt zonder noemenswaardige achtergrondruis te introduceren. Het gebruik van met grafeen gecoate CryoEM-roosters kan helpen bij het oplossen van problemen met betrekking tot interacties met lucht-waterinterfaces, maar commerciële grafeenroosters zijn duur en veel laboratoria beschouwen grafeenroosters als te ingewikkeld om intern te bereiden.
Onderzoekers op het gebied van CryoEM kunnen dit stap-voor-stap protocol nu gebruiken om op één dag volledig geproduceerde tientallen grafenen van hoge kwaliteit te reproduceren.
Overzicht
Deze studie richt zich op de uitdaging om biologische monsters optimaal te preserveren voor cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) met een hoge resolutie. De auteurs presenteren een protocol voor het coaten van EM-grids met een enkele monolaag grafeen om achtergrondruis te minimaliseren en de integriteit van het monster tijdens de beeldvorming te verbeteren.
Belangrijkste studiecomponenten
Onderzoeksgebied
- Cryo-elektronenmicroscopie
- Monsterconservering bij biologische beeldvorming
- Grafeentoepassingen in de microscopie
Achtergrond
- Het behouden van biologische monsters is cruciaal voor cryo-EM-structuren met een hoge resolutie.
- Traditionele koolstofcoatings kunnen de achtergrondruis bij beeldvorming verhogen.
- Grafeen biedt een beschermende laag zonder de beeldkwaliteit in gevaar te brengen.
Gebruikte methoden
- Toepassing van een monolaag grafeen op EM-grids
- Cryo-EM-beeldvormingstechnieken
- Gebruik van zelfgebouwde spin-coaters en diverse reinigingsmiddelen
Belangrijkste resultaten
- Met grafeen gecoate grids vertonen een verminderde achtergrondruis bij beeldvorming.
- De methode maakt massaproductie van hoogwaardig grafeen binnen één dag mogelijk.
- EM-grids tonen een effectieve preservering en concentratie van biologische monsters.
Conclusies
- Het protocol biedt een eenvoudige methode voor laboratoria om met grafeen gecoate EM-grids te produceren.
- Deze vooruitgang vergroot de potentie voor verbeterde cryo-EM-beeldvorming in biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Hoge-resolutie cryo-EM is essentieel voor de structurele biologie en geneesmiddelenontwikkeling, maar denaturatie van monsters en oriëntatiebias op het lucht-watergrensvlak beperken de datakwaliteit en de doorvoer. Grids gecoat met een monolaag grafeen lossen deze knelpunten op door de macromoleculaire integriteit te behouden en de achtergrondruis te verminderen, wat een directe impact heeft op vroege ontdekking en targetvalidatie. Schaalbare in-house fabricage van grafeengrids maakt een bredere adoptie mogelijk, waardoor structurele studies over het gehele portfolio worden ondersteund en mechanistische risicoreductie wordt versneld.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt hoogwaardige structurele analyse van macromoleculaire complexen mogelijk voor targetvalidatie.
- Vermindert denaturatie en aggregatie, wat bijdraagt aan mechanistische risicoreductie in de vroege ontdekkingsfase.
- Verbetert de diversiteit in oriëntatie, waardoor het voorspellend vertrouwen in structurele modellen wordt vergroot.
Screening & Assayontwikkeling
- Faciliteert de bereiding van reproduceerbare cryoEM-grids met een lage achtergrond voor daaropvolgende screening.
- Ondersteunt kwantitatieve beeldvorming door ruis en concentratie-artefacten te minimaliseren.
- Maakt een betrouwbare evaluatie van proteïnecomplexen bij lagere monsterconcentraties mogelijk.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Verbetert de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door de generatie van robuuste structurele data te ondersteunen.
- Sluit aan bij de ontwikkeling van translationele biomarkers door een verbeterde structurele resolutie.
- Vermindert het risico op mislukkingen in een laat stadium als gevolg van ambigue of gecompromitteerde structurele data.
Integratie van Pipeline & Workflow
Met een monolayer grafeen-coating integreren grids in de cryoEM-workflow, van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van hypothese-gestuurde structurele studies en ter facilitering van reproduceerbare, hoogwaardige beeldvorming.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking door inheemse macromoleculaire conformaties te behouden.
- Screening: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare grids voor kwantitatieve cryoEM-assays.
- Analytiek: Levert ruisarme beelden met een hoge resolutie voor robuuste comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Verbetert de preklinische continuïteit door betrouwbare structurele karakterisering van therapeutische kandidaten mogelijk te maken.
- Bedrijfsvoering en hergebruik: Vestigt een schaalbaar, kostenefficiënt platform voor herhaalde structurele studies over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanische ambiguïteit in de structurele biologie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de rasterpreparatie, verbetert de reproduceerbaarheid en maakt schaalbaarheid in batches mogelijk.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen en vermindert biologische risico's in een laat stadium door data van hogere kwaliteit.
- Impact op de portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in de hantering van cryo-EM-roosters en de manipulatie van grafeen.
- Toegang tot spincoaters, zuurkasten en standaardinfrastructuur voor de preparatie van EM-roosters is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare roosterkwaliteit en beeldvormingsresultaten.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende proteïneklassen of monster-typen.
- Potentiële beperkingen omvatten de gevoeligheid bij de hantering en de initiële training voor de stappen bij de grafeenoverdracht.
