Name: Multiplex-immunohistochemische analyse van het ruimtelijke immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-08-18T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Leer multiplex-immunohistochemie om immuuncellen in het tumor-micro-milieu te karakteriseren met behulp van FFPE-weefsels en digitale beeldanalyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het begrijpen van immuunresponsen en therapie-uitkomsten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De PhenoImager HT is aangeschaft met financiering van het Radboud Universitair Medisch Centrum en het Radboud Technologiecentrum voor Microscopie. CF wordt financieel ondersteund door een KWF Kankerbestrijdingsfonds (10673) en ERC Adv subsidie ARTimmune (834618). JT wordt financieel ondersteund door een NWO Vidi-subsidie (VI.Vidi.192.084). De auteurs willen Eric van Dinther en Ankur Ankan bedanken voor hun hulp bij het creëren van workflows om multiplex IHC-gegevens op te slaan en Bengt Phung wordt bedankt voor instructies over het implementeren van multiplex IHC-gegevens in QuPath voor ROI-tekening.

Het tumor-immuunlandschap in kaart brengen: een diepgaand multiplex IHC-analyseprotocol

<ol><li>Dunn, G. P., Bruce, A. T., Ikeda, H., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+immunoediting%3A+from+immunosurveillance+to+tumor+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cancer immunoediting: from immunosurveillance to tumor escape.</a> Nature Immunology. 3 (11), 991-998 (2002).</li>
<li>van der Woude, L. L., Gorris, M. A. J., Halilovic, A., Figdor, C. G., de Vries, I. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migrating+into+the+tumor%3A+a+roadmap+for+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Migrating into the tumor: a roadmap for T cells.</a> Trends in Cancer. 3 (11), 797-808 (2017).</li>
<li>Fridman, W. H., Pages, F., Sautes-Fridman, C., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+contexture+in+human+tumours%3A+impact+on+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome.</a> Nature Reviews. Cancer. 12 (4), 298-306 (2012).</li>
<li>Fridman, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+of+human+tumors%3A+general+significance+and+clinical+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Microenvironment%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment of human tumors: general significance and clinical impact.</a> Cancer Microenvironment. 6 (2), 117-122 (2013).</li>
<li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+validation+of+the+consensus+Immunoscore+for+the+classification+of+colon+cancer%3A+a+prognostic+and+accuracy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">International validation of the consensus Immunoscore for the classification of colon cancer: a prognostic and accuracy study.</a> Lancet. 391 (10135), 2128-2139 (2018).</li>
<li>Angell, H. K., Bruni, D., Barrett, J. C., Herbst, R., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immunoscore%3A+colon+cancer+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The Immunoscore: colon cancer and beyond.</a> Clinical Cancer Research. 26 (2), 332-339 (2020).</li>
<li>Angell, H., Galon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+the+immune+contexture+to+the+Immunoscore%3A+the+role+of+prognostic+and+predictive+immune+markers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">From the immune contexture to the Immunoscore: the role of prognostic and predictive immune markers in cancer.</a> Current Opinion in Immunology. 25 (2), 261-267 (2013).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+classification+using+the+Immunoscore%3A+a+worldwide+task+force%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer classification using the Immunoscore: a worldwide task force.</a> Journal of Translational Medicine. 10, 205(2012).</li>
<li>Galon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World-wide+Immunoscore+Task+Force%3A+meeting+report+from+the+34%3BMelanoma+Bridge%26%2334%2C+Napoli%2C+November+30th-December+3rd%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">World-wide Immunoscore Task Force: meeting report from the 34;Melanoma Bridge&#34, Napoli, November 30th-December 3rd, 2016.</a> Journal of Translational Medicine. 15 (1), 212(2017).</li>
<li>Tumeh, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+induces+responses+by+inhibiting+adaptive+immune+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immune resistance.</a> Nature. 515 (7528), 568-571 (2014).</li>
<li>Creemers, J. H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tipping+point+in+cancer-immune+dynamics+leads+to+divergent+immunotherapy+responses+and+hampers+biomarker+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A tipping point in cancer-immune dynamics leads to divergent immunotherapy responses and hampers biomarker discovery.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (5), e002032(2021).</li>
<li>Blank, C. U., Haanen, J. B., Ribas, A., Schumacher, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CANCER+IMMUNOLOGY.+The+%26%2334%3Bcancer+immunogram%26%2334%3B%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CANCER IMMUNOLOGY. The &#34;cancer immunogram&#34;.</a> Science. 352 (6286), 658-660 (2016).</li>
<li>Teruya-Feldstein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunohistochemistry+laboratory+looking+at+molecules+and+preparing+for+tomorrow%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">The immunohistochemistry laboratory looking at molecules and preparing for tomorrow.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 134 (11), 1659-1665 (2010).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+tissue+antigens+and+antibodies+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry--the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When tissue antigens and antibodies get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry--the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clinical Cancer Research. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Parra, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+platforms+of+multiplexed+immunofluorescence+for+study+of+paraffin+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer+Treatment+and+Diagnosis%22%5BJournal%5D)">Novel platforms of multiplexed immunofluorescence for study of paraffin tumor tissues.</a> Journal of Cancer Treatment and Diagnosis. 2 (1), 43-53 (2018).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eight-color+multiplex+immunohistochemistry+for+simultaneous+detection+of+multiple+immune+checkpoint+molecules+within+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Eight-color multiplex immunohistochemistry for simultaneous detection of multiple immune checkpoint molecules within the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunology. 200 (1), 347-354 (2018).</li>
<li>Roelofsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+regression+of+ovarian+carcinoma+after+septic+peritonitis%3B+a+unique+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Spontaneous regression of ovarian carcinoma after septic peritonitis; a unique case report.</a> Frontiers in Oncology. 8, 562(2018).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-mediated+delivery+of+therapeutic+mRNA+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Peptide-mediated delivery of therapeutic mRNA in ovarian cancer.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 141, 180-190 (2019).</li>
<li>van den Brand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpCAM-binding+DARPins+for+targeted+photodynamic+therapy+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">EpCAM-binding DARPins for targeted photodynamic therapy of ovarian cancer.</a> Cancers. 12 (7), 1762(2020).</li>
<li>Di Blasio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+shapes+dendritic+cell+plasticity+in+a+human+organotypic+melanoma+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment shapes dendritic cell plasticity in a human organotypic melanoma culture.</a> Nature Communications. 11 (1), 2749(2020).</li>
<li>van Beek, J. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pDCs+are+superior+to+cDC2s+in+attracting+cytolytic+lymphocytes+in+melanoma+patients+receiving+DC+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pDCs are superior to cDC2s in attracting cytolytic lymphocytes in melanoma patients receiving DC vaccination.</a> Cell Reports. 30 (4), 1027-1038 (2020).</li>
<li>Rodriguez-Rosales, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+aged+neutrophils+are+augmented+in+blood+and+skin+of+psoriasis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory aged neutrophils are augmented in blood and skin of psoriasis patients.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 148 (4), 1030-1040 (2021).</li>
<li>Hoeijmakers, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+cell+composition+in+the+endometrium+of+patients+with+a+complete+molar+pregnancy%3A+Effects+on+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Immune cell composition in the endometrium of patients with a complete molar pregnancy: Effects on outcome.</a> Gynecologic Oncology. 160 (2), 450-456 (2021).</li>
<li>van Ravensteijn, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+and+genomic+analysis+reveals+clinically+relevant+distinctions+between+angiosarcoma+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Immunological and genomic analysis reveals clinically relevant distinctions between angiosarcoma subgroups.</a> Cancers. 14 (23), 5938(2022).</li>
<li>van der Woude, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+shows+an+immunological+abscopal+effect+in+patients+with+NSCLC+treated+with+pembrolizumab-radiotherapy+combination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment shows an immunological abscopal effect in patients with NSCLC treated with pembrolizumab-radiotherapy combination.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (10), e005248(2022).</li>
<li>Graham Martinez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+microenvironment+landscape+shows+treatment-specific+differences+in+rectal+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune microenvironment landscape shows treatment-specific differences in rectal cancer patients.</a> Frontiers in Immunology. 13, 1011498(2022).</li>
<li>Cortenbach, K. R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+of+immune+cell+infiltration+in+different+stages+of+coronary+atherosclerosis+revealed+by+multiplex+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology.+Heart+%26+Vasculature%22%5BJournal%5D)">Topography of immune cell infiltration in different stages of coronary atherosclerosis revealed by multiplex immunohistochemistry.</a> International Journal of Cardiology. Heart & Vasculature. 44, 101111(2023).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+repair+deficient+prostate+cancer+represents+an+immunologically+distinct+subtype%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination repair deficient prostate cancer represents an immunologically distinct subtype.</a> Oncoimmunology. 11 (1), 2094133(2022).</li>
<li>Gorris, M. A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired+primary+and+metastatic+lesions+of+patients+with+ipilimumab-treated+melanoma%3A+high+variation+in+lymphocyte+infiltration+and+HLA-ABC+expression+whereas+tumor+mutational+load+is+similar+and+correlates+with+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+Immunotherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Paired primary and metastatic lesions of patients with ipilimumab-treated melanoma: high variation in lymphocyte infiltration and HLA-ABC expression whereas tumor mutational load is similar and correlates with clinical outcome.</a> Journal for Immunotherapy of Cancer. 10 (5), e004329(2022).</li>
<li>van Wilpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+T+cell+depletion+following+neoadjuvant+chemotherapy+in+patients+with+muscle-invasive+bladder+cancer+is+associated+with+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Intratumoral T cell depletion following neoadjuvant chemotherapy in patients with muscle-invasive bladder cancer is associated with poor clinical outcome.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 72 (1), 137-149 (2023).</li>
<li>Sultan, S., Gorris, M. A. J., Buytenhuijs, F., Lvan de Woude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Segmentation-free+machine+learning+architecture+for+immune+land-scape+phenotyping+in+solid+tumors+by+multichannel+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A Segmentation-free machine learning architecture for immune land-scape phenotyping in solid tumors by multichannel imaging.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-profiling+and+cellular+spatial+analysis+using+five+immune+oncology+multiplex+immunofluorescence+panels+for+paraffin+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Immuno-profiling and cellular spatial analysis using five immune oncology multiplex immunofluorescence panels for paraffin tumor tissue.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8511(2021).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+multiplex+immunofluorescence+panels+using+multispectral+microscopy+for+immune-profiling+of+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+human+tumor+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues.</a> Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).</li>
<li>Sun, Z., Nyberg, R., Wu, Y., Bernard, B., Redmond, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+an+enhanced+7-color+multiplex+IHC+protocol+to+dissect+immune+infiltration+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Developing an enhanced 7-color multiplex IHC protocol to dissect immune infiltration in human cancers.</a> PLoS One. 16 (2), e0247238(2021).</li>
<li>LeicaBiosystems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BOND+RX+Fully+Automated+Research+Stainer+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">BOND RX Fully Automated Research Stainer Protocols.</a> , https://www.leicabiosystems.com/en-nl/ihc-ish/ihc-ish-instruments/bond-rx/ (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Ruimtelijke analyse van de TME is een gewilde techniek om meer te weten te komen over het immuuncelcompartiment en nieuwe prognostische en voorspellende biomarkers te ontdekken, met name op het gebied van immuno-oncologie16. Hiervoor worden veel verschillende technieken ontwikkeld, waarbij eiwitten, mRNA-transcripten of een combinatie van beide worden gedetecteerd, met schattingen tot 100-1.000 doelen. Een hogere multiplexing gaat echter ten koste van minder high-throughput experimenten, hogere experimentele kosten en technische uitdagingen, en vaak kan slechts een klein deel van de TME worden geanalyseerd. Multiplex IHC met behulp van de op TSA gebaseerde methode die we hier beschrijven, detecteert zes verschillende markers + DAPI tegelijkertijd, is relatief goedkoper om uit te voeren en hele weefselsecties worden in minder dan 20 minuten in beeld gebracht, klaar om volledig te worden geanalyseerd. Deze techniek is minder complex geworden met de automatisering van het kleuringsproces. Verbeteringen in de multispectrale microscoop, waaronder de toevoeging van twee extra filters, hebben de spectrale ontmengings- en scantijden enorm verbeterd. Het is mogelijk om tot acht verschillende markers + DAPI tegelijkertijd te detecteren. Door de multiplexing uit te breiden met meer markers, verdwijnen de bovengenoemde voordelen echter omdat spectrale ontmenging een grotere uitdaging wordt en de scantijden voor hele objectglaasjes aanzienlijk toenemen. Er wordt gewerkt aan het standaardiseren van multiplex IHC tussen verschillende instellingen om de implementatie in de diagnostische setting gemakkelijker te maken. Voor deze standaardisatie van multiplex IHC adviseren we gebruikers om zich te houden aan het meer toegankelijke protocol met zes verschillende markers + DAPI. Toch is er nog heel wat technische kennis nodig en kan downstream analyse een uitdaging zijn, waarvoor we methodologieën hebben ontwikkeld die in dit protocol worden beschreven.
Standaardisatie begint met de ontwikkeling van multiplex IHC-panelen. Het belang van de keuze van primaire antilichamen die bepaalde eiwitdoelen detecteren, is al eerder benadrukt17. Onze multiplex IHC-panelen zijn meestal ontwikkeld met klonen van primaire antilichamen die ook op onze diagnostische afdeling worden gebruikt en gevalideerd voor IHC. In het geval van het dendritische cel multiplex IHC-panel werden de meeste antilichamen echter niet gebruikt in de diagnostische setting (van der Hoorn et al., manuscript in inzending). Om specificiteit te garanderen en batchverschillen te minimaliseren, hebben we ervoor gekozen om monoklonale antilichamen te gebruiken in plaats van polyklonale antilichamen en hebben we ook de meeste antilichamen gevalideerd met behulp van getransfecteerde cellijnen en primaire cellen. In de loop der jaren zijn in tal van onderzoeken verschillende versies van multiplex IHC-panelen gebruikt met behulp van het Vectra 3-systeem 18,21,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Om deze multiplex IHC-panelen optimaal te implementeren op het PhenoImager HT-systeem, moesten er enkele aanpassingen worden gedaan in de combinaties van primaire antilichamen en fluoroforen. Om te profiteren van een betere spectrale ontmenging en snellere scantijden van hele weefselsecties, is de implementatie van de nieuwste Opal480- en Opal780-fluoroforen en het vermijden van het gebruik van Opal540- en Opal650-fluoroforen in zevenkleurige multiplex IHC-panelen noodzakelijk. De scantijden zijn ~3-10 keer sneller, afhankelijk van de grootte van het weefselgedeelte. Multiplex IHC-paneelaanpassingen waren vrij eenvoudig te realiseren, maar er moeten enkele overwegingen in gedachten worden gehouden. Het fluorescerende spectrum van Opal480 overlapt veel met het autofluorescentiespectrum en interfereert daarom met de spectrale ontmenging van erytrocyten en andere autofluorescerende structuren. Het gebruik van een verhoogde concentratie van het primaire antilichaam in combinatie met Opal480 loste dit probleem in de meeste gevallen op. De implementatie van het gepatenteerde Sample AF-filter op de PhenoImager HT vergemakkelijkt het ontmengen van Opal480 en autofluorescentie. Het is echter het beste om een primair antilichaam te gebruiken dat een duidelijk signaal afgeeft bij gebruik met Opal480, zodat het signaal hoger is dan de autofluorescentie.
Hoewel deze multiplex IHC-panelen zijn ingeburgerd, is variatie van batch tot batch iets dat moet worden overwogen. Door monoplex IHC-controles uit te voeren voordat het volledige multiplex IHC-experiment werd gestart, zagen we soms dat primaire antilichamen van experiment tot experiment sterker of zwakker presteerden. De redenen hiervoor kunnen pipetteerfouten, suboptimale opslagcondities voor reagentia en houdbaarheid zijn. We hebben dit opgelost door de primaire antilichaamoplossing aan te passen op basis van onze ervaring. Zelfs als geen van de bovengenoemde aanpassingen hoefde te worden gemaakt, is het bij elk multiplex IHC-batchexperiment belangrijk om belichtingstijden in te stellen op basis van monoplex IHC-gekleurde controleglaasjes.
Omdat ons onderzoek in eerste instantie gericht was op verschillende soorten carcinomen en melanoom, moesten multiplex IHC-panels met minimale aanpassingen uitwisselbaar zijn tussen tumortypes. Daarom hebben we altijd meerdere (tumor)weefseltypen meegenomen in het optimalisatieproces en hebben we gezien dat verdunningen voor primaire antilichamen voor immuuncelmarkers vergelijkbaar kunnen worden gehouden tussen verschillende tumortypes. Voor de detectie van tumorweefsel tussen carcinomen en melanoom zijn echter verschillende tumormarkers nodig. Dienovereenkomstig is de tumormarker altijd geoptimaliseerd om aan het einde van elk multiplex IHC-paneel te werken en wordt hij momenteel altijd gebruikt in combinatie met Opal780, dat toevallig ook op de laatste fluorofoor moet zijn in een multiplex IHC-kleuringsprocedure. Door de tumormarker consequent aan het einde van de multiplex IHC te gebruiken, kunnen deze multiplex IHC-panels gemakkelijk worden verwisseld voor andere tumortypes, zoals glioblastoom (d.w.z. GFAP) en Hodgkin-lymfoom (d.w.z. CD30). Voor angiosarcoom gebruikten we dit lymfocyt multiplex IHC-panel met erytroblasttransformatie-specifiek-gerelateerd gen (ERG) als tumormarker met slechts tweeoptimalisatie-experimenten 25. De optimalisatie omvatte titratie van het primaire ERG-antilichaam en het testen van het multiplex IHC-panel met ERG aan het einde.
Andere aanpassingen aan deze multiplex IHC-panelen kunnen ook worden gemaakt door een bepaalde immuuncelmarker te vervangen door een andere immuun- of functionele marker. Elke verandering vraagt om optimalisatie. Het protocol voor optimalisatie kan worden gevolgd zoals eerder beschreven17. Bepaalde wijzigingen aan de voorgestelde multiplex IHC-panelen zullen interfereren met de ImmuNet-algoritmen die we hebben gemaakt. Er moeten voldoende gegevens worden gegenereerd en er moet tijd worden besteed aan het implementeren van deze wijzigingen in het algoritme (ten minste 750 annotaties voor elke nieuwe marker en/of celfenotypes, en 150 annotaties voor validatie van eerder getrainde markers). De hier gepresenteerde panels bevatten geen functionele markers, hoewel de implementatie van immuuncheckpointmarkers zoals PD-1 en PD-L1 in multiplex IHC-panels in ons laboratorium wordt uitgevoerd. De analyse van markers die minder binair zijn in negatieve en positieve signalen is echter moeilijker gebleken en is een gebied van actief onderzoek in onze groep.
Het aantal markers dat gelijktijdig met multiplex IHC kan worden beoordeeld, is beperkt in vergelijking met andere nieuwe technieken. Hoewel dit kan worden omzeild door verschillende panelen op opeenvolgende plakjes van een FFPE-blok te analyseren, zal het moeilijk zijn om deze plakjes ruimtelijk te vergelijken. Oriëntatie en gevouwen artefacten zijn waarschijnlijk niet hetzelfde na de voorbereiding van de objectglaasjes. Toch is multiplex IHC vrij toegankelijk, wat het een aantrekkelijk hulpmiddel maakt voor meer instellingen en onderzoekers en daarom meer geschikt is voor toekomstige implementatie in een diagnostische setting. Met de standaardisatie van multiplex IHC-immuuncelpanels voor meerdere tumortypen en stroomafwaartse analysepijplijnen kon meer kennis worden opgedaan over verschillen in TME tussen patiënten en tumortypes. Dit kan bijvoorbeeld leiden tot meer inzicht in de rol van de TME in de antitumorrespons op specifieke behandelingen. Dit kan zelfs aanleiding geven tot nieuwe biomarkers om factoren zoals respons op behandeling en verwachte overleving te voorspellen. Over het algemeen kan dit multiplex IHC in staat stellen een klinisch hulpmiddel te worden om te helpen bij klinische besluitvorming, in een gepersonaliseerde geneeskundebenadering. Toegegeven, meer stappen van de analyseprocedure moeten waarschijnlijk worden geautomatiseerd en gestandaardiseerd om haalbaar te zijn voor gebruik in een dagelijkse diagnostische omgeving, dus tot nu toe is het vooral een futuristisch perspectief.
Analyse van meerdere markers op een enkel voorbeeldglaasje kan een zeer krachtig hulpmiddel zijn, ondanks de technische uitdagingen. Met gestandaardiseerde experimentele protocollen en een robuuste analysemethode, zoals we hier hebben beschreven met behulp van ImmuNet, maakt de kwantificering van meerdere markers het informatiever dan klassieke IHC, terwijl multiplex IHC een relatief hoge doorvoer blijft in vergelijking met nieuwe experimentele methoden met een hogere plex.

Immuuncellen spelen een cruciale rol bij de bescherming tegen ziekteverwekkers zoals virussen en bacteriën, maar ook tegenkankercellen1. Daarom is het immuunsysteem binnen de tumormicro-omgeving (TME) veelbelovend voor het ontdekken van prognostische en voorspellende biomarkers2. Immuuncelinfiltraten zijn gecorreleerd met de prognose bij verschillende soorten kanker, hoewel dit nog niet is geïmplementeerd in de klinische zorg 3,4. Bij de meeste tumortypen zijn hoge aantallen cytotoxische T-cellen en T-helper 1-cellen en/of lage aantallen regulerende T-cellen gekoppeld aan goede prognoses. Er worden inspanningen geleverd om een zogenaamde "Immunoscore" op te nemen in de TNM-stadiëring van colorectale kanker, waardoor het wordt omgezet in TNM-I-stadiëring 5,6. De Immunoscore wordt afgeleid van het totale aantal T-cellen (gedetecteerd met CD3) en cytotoxische T-cellen (gedetecteerd met CD8) in twee verschillende tumorregio's: de tumorkern versus de invasieve marge (IM) van tumoren. Er is ook voorgesteld dat de Immunoscore van prognostische waarde is bij andere soorten kanker, zoals melanoom, longkanker en borstkanker 6,7,8,9. Bovendien kunnen immuuncelinfiltraten ook correleren met de respons op immunotherapie met checkpointblokkade10. Deze voorspellende biomarkers moeten echter worden gevalideerd in prospectieve studies voordat ze routinematig in de klinische praktijk kunnen worden geïmplementeerd. Bovendien is ook gesuggereerd dat een enkele biomarker onvoldoende zal zijn voor een zinvolle voorspelling11. Daarom is het maken van een volledige kaart van een patiëntmonster door het combineren van verschillende biomarkers voorgesteld als een uitgebreidere voorspellende biomarker in een zogenaamd "kankerimmunogram"12.
Van de methoden voor het bestuderen van immuuncellen binnen de TME is de oudste en meest bekende techniek immunohistochemie (IHC), die routinematig wordt gebruikt voor diagnostische tests bij verschillende ziekten, met namekanker13. Deze techniek was lange tijd beperkt tot het gebruik van één of slechts enkele markers14 en werd daarom in onderzoeksomgevingen weggeconcurreerd door andere technieken zoals flowcytometrie en genexpressieprofilering (GEP). De met formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde (FFPE) tumorweefsels die doorgaans worden gebruikt in routinediagnostiek en onderzoek zijn echter niet (optimaal) geschikt voor flowcytometrie en GEP. Hoewel GEP en flowcytometrie veel inzicht geven in het fenotype en de functie van cellen, is het gebrek aan ruimtelijke informatie een groot nadeel. Daarom kan heterogeniteit binnen een steekproef, zoals verschillen in door immuuncellen geïnfiltreerde versus immuuncel-uitgesloten gebieden van een tumor, onopgemerkt blijven15. Er zijn nieuwe platforms ontwikkeld voor multiplexanalyse van FFPE-weefsels, zoals multiplex IHC, beeldvormende massacytometrie en CO-detectie door indEXing (CODEX) die kunnen worden gebruikt om meerdere markers tegelijkertijd te detecteren binnen een weefselsectie16. Immuuncellen in de TME worden uitgebreid bestudeerd om de beste biomarkers voor immunotherapie te vinden. Multiplextechnieken en geautomatiseerde beeldanalyse vormen echter hun eigen hindernissen.
Ons laboratorium heeft uitgebreide ervaring met multiplex IHC-kleuring met behulp van de Opal/Tyramide signaalversterking (TSA) methode en heeft dit geautomatiseerd op een IHC-platform (zie de Materiaaltabel)17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, 29,30,31. We hebben immuuncelpanels geoptimaliseerd voor de detectie van verschillende subsets van lymfocyten, myeloïde cellen en dendritische cellen (DC's). Weefsels die dichte immuuncelgebieden bevatten - voor lymfocyten of complexe celmorfologieën (d.w.z. myeloïde cellen en DC's) - zijn bijzonder moeilijk te analyseren, met het risico dat het aantal aanwezige immuuncellen wordt over- of onderschat. Om dit probleem op te lossen, werd ImmuNet-analysesoftware ontwikkeld door onze groep32, en deze machine-learningpijplijn verbeterde de kwaliteit van de detectie van deze verschillende soorten immuuncellen enorm. Een gedetailleerd protocol van het verkrijgen van het FFPE-materiaal tot de analyse van immuunceldichtheden in verschillende weefselcompartimenten en afstanden tussen immuunceltypen wordt hier beschreven.
Dit protocol schetst hoe de multiplex IHC-panelen worden uitgevoerd in het Radboud Universitair Medisch Centrum sinds de implementatie van de digitale pathologiebeeldvormer in 2022. De beschreven multiplex IHC-panels kunnen worden gebruikt voor verschillende carcinomen (bijv. long, prostaat, colorectaal, blaas, borst) met behulp van een pancytokeratine-antilichaam als tumormarker of voor melanoom met het gebruik van melanocyt-geassocieerde antilichamen als tumormarkers. Deze multiplex IHC-protocollen zijn zorgvuldig geoptimaliseerd wat betreft de concentratie van primaire antilichamen, fluorofoorcombinaties en de volgorde van de kleuringsprocedure. Wij en anderen hebben multiplex IHC-paneeloptimalisatie eerder beschreven 17,33,34,35. Multiplex IHC-panelen kunnen worden aangepast, maar de beschreven analysepijplijnen moeten worden geëvalueerd en mogelijk dienovereenkomstig worden aangepast of opnieuw worden getraind. De beschreven zevenkleurige multiplex IHC-protocollen maken gebruik van de Opal-fluoroforen Opal480, Opal520, Opal570, Opal620, Opal690, Opal780 en 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), zodat eenvoudig ontmengen en snel scannen op de imager mogelijk is met "Multispectral One Touch ImmunoFluorescence" (MOTiF). Kleuring en scannen met negen kleuren wordt in dit protocol niet beschreven, omdat dit nog meer fijnafstemming van de experimentele opstelling vereist en een andere scanmodus op de imager die gebruik maakt van het afstembare filter met vloeibare kristallen.

```html
<table><tbody><tr><td>anti-CD14</td><td>Cell Marque </td><td>114R-16</td><td>sectie 3, clone EPR3653</td></tr><tr><td>anti-CD163</td><td>Cell Marque </td><td>163M-15</td><td>sectie 3, clone MRQ-26</td></tr><tr><td>anti-CD19</td><td>Abcam</td><td>ab134114</td><td>sectie 3, clone EPR5906</td></tr><tr><td>anti-CD1c (BDCA1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>TA505411</td><td>sectie 3, clone OTI2F4</td></tr><tr><td>anti-CD20</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-340-S</td><td>sectie 3, clone L26</td></tr><tr><td>anti-CD3</td><td>Thermo Scientific</td><td>RM-9107</td><td>sectie 3, clone sp7</td></tr><tr><td>anti-CD303/BDCA2</td><td>Dendritics via Enzo Lifesciences/Axxora</td><td>DDX0043</td><td>sectie 3, clone 124B3.13</td></tr><tr><td>anti-CD56</td><td>Cell Marque </td><td>156R-94</td><td>sectie 3, clone MRQ-42</td></tr><tr><td>anti-CD66b</td><td>BD Biosciences</td><td>555723</td><td>sectie 3, clone G10F5</td></tr><tr><td>anti-CD68</td><td>Dako Agilent</td><td>M087601</td><td>sectie 3, clone PG-M1</td></tr><tr><td>anti-CD8</td><td>Dako Agilent</td><td>M7103</td><td>sectie 3, clone C8/144B</td></tr><tr><td>anti-Foxp3</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-4777</td><td>sectie 3, clone 236A/E7</td></tr><tr><td>anti-Gp100</td><td>Dako Agilent</td><td>M063401</td><td>sectie 3, clone HMB45</td></tr><tr><td>anti-HLA-DR, DP, DQ</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-53302</td><td>sectie 3, clone CR3/43</td></tr><tr><td>anti-MART-1</td><td>Thermo Scientific</td><td>MS-799</td><td>sectie 3, clone A103</td></tr><tr><td>anti-pan cytokeratin</td><td>Abcam</td><td>ab86734</td><td>sectie 3, clone AE1/AE3 + 5D3</td></tr><tr><td>anti-SOX10</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383R</td><td>sectie 3, clone EP268</td></tr><tr><td>anti-Tyrosinase</td><td>Sanbio</td><td>MONX10591</td><td>sectie 3, clone T311</td></tr><tr><td>anti-XCR1</td><td>Cell Signaling Technologies via Bioké</td><td>44665S</td><td>sectie 3, clone D2F8T</td></tr><tr><td>antibody diluent</td><td>Akoya BioSciences</td><td>SKU ARD1001EA</td><td>sectie 3, van Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide (kan optioneel ook worden vervangen door TBST met 10% BSA)</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.0605</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond Aspirating Probe Cleaning</td><td>Leica Biosciences</td><td>CS9100</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond Dewax Solution</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9222</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond Objectglas label + print lint</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4564.A</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond Research Detection System 2</td><td>Leica Biosciences</td><td>DS9777</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond RX autostainer </td><td>Leica Biosciences</td><td>-</td><td>sectie 3, geautomatiseerde platform</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 1 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9961</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond TM Epitope Retrieval 2 - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9640</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond TM Wash Solution 10x - 1 L</td><td>Leica Biosciences</td><td>AR9590</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>BOND Universal Covertile</td><td>Leica Biosciences</td><td>S21.4611</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Bond(TM) Titration Kit</td><td>Leica Biosciences</td><td>OPT9049</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Coverslip 24 x 32 mm #1 (0.13-0.16 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>15717592</td><td>sectie 2</td></tr><tr><td>coverslip 24 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0146</td><td>sectie 2</td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-20</td><td>sectie 3, wanneer monoplex slides snel moeten worden gecontroleerd, niet voor officiële analyse, dan wordt DAPI apart geverfd voor betere resultaten</td></tr><tr><td>Eosine</td><td></td><td></td><td>sectie 2, zelfgemaakt</td></tr><tr><td>Ethanol 99.5%</td><td>VWR</td><td>4099.9005</td><td>sectie 2</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>VWR</td><td>0100-01</td><td>sectie 3 </td></tr><tr><td>haematoxyline</td><td></td><td>-</td><td>sectie 2, zelfgemaakt</td></tr><tr><td>ImmuNet</td><td></td><td>-</td><td>immuunceldetectie en fenotypeerpijplijn</td></tr><tr><td>inForm software 2.4.10</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>sectie 4 &amp; 6</td></tr><tr><td>OPAL 480 reagent pack</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1500001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>OPAL 520 reagent pack</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1487001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>OPAL 570 reagent pack</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1488001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>OPAL 620 reagent pack</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1495001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>OPAL 690 reagent pack</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1497001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>OPAL 780 reagent pack</td><td>Akoya BioSciences</td><td>FP1501001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>Opal 7-Color Automation IHC Kit 50 slide</td><td>Akoya BioSciences</td><td>NEL821001KT</td><td>sectie 3</td></tr><tr><td>PhenoChart 1.1.0</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>sectie 5</td></tr><tr><td>PhenoImagerHT</td><td>Akoya BioSciences</td><td>CLS143455</td><td>sectie 4, digitale pathologie imager met dia-viewer en beeldverwerkingssoftware (voorheen bekend als Vectra Polaris)</td></tr><tr><td>Quick-D mounting medium</td><td>Klinipath</td><td>7280</td><td>sectie 2</td></tr><tr><td>QuPath 0.3.2</td><td></td><td></td><td>softwareplatform voor gehele dia-beeldanalyse</td></tr><tr><td>R 4.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slide boxes</td><td>VWR</td><td>631-0737</td><td>sectie 1</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus</td><td>Thermo Scientific through VWR</td><td>631-9483</td><td>sectie 1</td></tr><tr><td>Vectra Polaris software 1.0.13</td><td>Akoya BioSciences</td><td>-</td><td>sectie 4</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR</td><td>4055-9005</td><td>sectie 2</td></tr></tbody></table>
```

multiplex-immunohistochemische analyse van het ruimtelijke immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor

Multiplex Immunohistochemical Analysis of the Spatial Immune Cell Landscape of the Tumor Microenvironment

Het immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor bevat mogelijk informatie voor de ontdekking van prognostische en voorspellende biomarkers. Multiplex-immunohistochemie is een waardevol hulpmiddel om verschillende soorten immuuncellen in tumorweefsels te visualiseren en te identificeren met behoud van de ruimtelijke informatie. Hier bieden we gedetailleerde protocollen voor het analyseren van lymfocyten-, myeloïde en dendritische celpopulaties in weefselsecties. Beginnend met het snijden van in formaline gefixeerde paraffine ingebedde secties, automatische multiplexkleuringsprocedures op een geautomatiseerd platform, het scannen van de objectglaasjes op een multispectrale beeldmicroscoop, tot de analyse van afbeeldingen met behulp van een in-house ontwikkeld machine learning-algoritme ImmuNet. Deze protocollen kunnen worden toegepast op een verscheidenheid aan tumormonsters door simpelweg tumormarkers te verwisselen om immuuncellen in verschillende compartimenten van het monster te analyseren (tumor versus invasieve marge) en analyse van de dichtstbijzijnde buur toe te passen. Deze analyse beperkt zich niet tot tumormonsters, maar kan ook worden toegepast op andere (niet-)pathogene weefsels. Verbeteringen aan de apparatuur en de workflow in de afgelopen jaren hebben de doorlooptijden aanzienlijk verkort, wat de toekomstige toepassing van deze procedure in de diagnostische setting vergemakkelijkt.

Dit protocol beschrijft in detail hoe immuuncelkarakterisering van de micro-omgeving van de tumor met behulp van multiplex immunohistochemie wordt uitgevoerd.

Multiplex-immunohistochemische analyse van het ruimtelijke immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor

The immune cell landscape of the tumor microenvironment potentially contains information for the discovery of prognostic and predictive biomarkers. ...

Ons doel is om de hoeveelheid, het type en de locatie van immuuncellen in de micro-omgevingen van de tumor te identificeren. Op het gebied van immunochemie is er de afgelopen jaren een grote technologische vooruitgang geboekt. Vooruitgang in multiplex immunochemietechnologie maakt het mogelijk om meer markers betrouwbaar te bestuderen.De huidige experimentele uitdagingen zijn het visualiseren van specifieke soorten immuuncellen in tumormonsters, die zijn overwonnen met behulp van de multiplex immunochemiemethoden. Nauwkeurige automatische analyse van deze beelden is echter nog steeds een uitdaging waar we aan werken. De verschillen tussen het landschap van immuuncellen tussen primaire en gemetastaseerde tumoren roepen vragen op als: welke intrinsieke eigenschappen van de tumor drijven deze verschillen aan, en wat betekenen deze verschillen voor therapieën die zich richten op het immuunsysteem?Naast ons verkennende werk zullen we ons ook richten op klinisch relevante vragen, zoals hoe het immuuncellandschap van de tumor wordt beïnvloed door verschillende soorten antikankertherapieën en of het immuuncellandschap de uitkomst van therapie kan voorspellen.

multiplex-immunohistochemical-analysis-spatial-immune-cell-landscape

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates an in-situ fluorescence multispectral imaging technique to analyze different subpopulations of infiltrating T cells in tumor tissue. A renal cell carcinoma tissue cryosection is treated with antibodies to label CD8+ T cells that express specific inhibitory receptors and exhibit an immunotherapy-resistant phenotype. The labeled section is visualized using a multispectral microscope to identify the distinct CD8+ T cell subpopulations.

Multiplexed Immunofluorescence Imaging to Analyze Immunotherapy-Resistant T Cell Subpopulations

Bestuderen van tumor communicatie kan identificeren prognostische of voorspellende biomarkers voor klinische respons op immunotherapie. Hier wordt gepresenteerd, is een innovatieve methode op basis van in situ fluorescentie multispectrale imaging te analyseren en automatisch verschillende subpopulaties van CD8 tellen+ T cellen. Deze reproduceerbaar zijn en betrouwbare techniek is geschikt voor grote cohort analyses.

Multiplexed immunofluorescentie analyse en kwantificering van Intratumoral PD-1+ Tim-3+ CD8+ T cellen

Hier beschrijven we een eenvoudige en toegankelijke strategie voor het visualiseren, kwantificeren en in kaart brengen van immuuncellen in formaline-vaste paraffine-ingebedde tumorweefselsecties. Deze methodologie combineert bestaande beeldvormings- en digitale analysetechnieken met als doel de multiplexingcapaciteit en multiparameteranalyse van beeldvormingstesten uit te breiden.

Visualisatie, kwantificering en mapping van immuuncelpopulaties in de tumormicro-omgeving

Multiplexed barcoding beeldanalyse heeft onlangs de karakterisering van de tumormicro-omgeving verbeterd, waardoor uitgebreide studies van celsamenstelling, functionele toestand en cel-celinteracties mogelijk zijn. Hierin beschrijven we een kleurings- en beeldvormingsprotocol met behulp van de barcodering van oligonucleotide-geconjugeerde antilichamen en cyclusbeeldvorming, waardoor het gebruik van een hoogdimensionale beeldanalysetechniek mogelijk is.

Multiplexed Barcoding beeldanalyse voor immunoprofiling en ruimtelijke kartering in de eencellige analyse van paraffineweefselmonsters

In dit artikel wordt een protocol beschreven voor handmatige tyramide signaalversterking (TSA) multiplex immunofluorescentie (mIF) in combinatie met beeldanalyse en ruimtelijke analyse. Dit protocol kan worden gebruikt met formaline-vaste paraffine-ingebedde (FFPE) secties voor de kleuring van twee tot zes antigenen per dia, afhankelijk van de diascanner die beschikbaar is in het laboratorium.

Multiplex immunofluorescentie gecombineerd met ruimtelijke beeldanalyse voor de klinische en biologische beoordeling van de micro-omgeving van de tumor

Multiplex, cyclische immunohistochemie, maakt in situ detectie van meerdere markers tegelijk mogelijk met behulp van herhaalde antigeen-antilichaamincubatie, beeldscanning en beelduitlijning en -integratie. Hier presenteren we het operationele protocol voor het identificeren van immuuncelsubstraten met deze technologie in longkanker en gepaarde hersenmetastasemonsters.

Multiplex cyclische fluorescerende immunohistochemie

We hebben een permeabele microporeuze membraaninzet aangepast om het tumormicro-omgeving (TME) te imiteren. Het model bestaat uit een gemengde celcultuur, maakt een vereenvoudigde generatie van sterk verrijkte individuele celpopulaties mogelijk zonder het gebruik van fluorescente markering of celsortering, en maakt het mogelijk om intercellulaire communicatie binnen het TME te bestuderen onder normale of stressomstandigheden.

Een Mimic van de tumor micro: Een eenvoudige methode voor het genereren van verrijkte celpopulaties en Onderzoeken intercellulaire communicatie

Dit protocol fungeert als een regeling voor de oprichting van een functioneel Tet-ON systeem in cellijnen van kanker en het latere gebruik ervan, in het bijzonder voor de studie van de rol van tumor cel afkomstige eiwitten in de aanwerving van monocyten/macrofagen aan de communicatie van de tumor.

Voorwaardelijke Knockdown van genexpressie in kanker cellijnen te bestuderen van de aanwerving van monocyten/macrofagen naar de Tumor communicatie

Low-veld (L-band, 1,2 GHz) elektron paramagnetisch resonantie met behulp van oplosbare nitroxyl en trityl sondes is voor beoordeling van fysiologisch belangrijke parameters in de communicatie van de tumor in muismodellen van borstkanker aangetoond.

In Vivo EPR beoordeling van pH, pO2, Redox Status, en concentraties van fosfaat en glutathion in de communicatie van de Tumor

Het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige genomic DNA van tumor weefsels is een essentiële eerste stap voor het analyseren van de genetische veranderingen met behulp van de volgende generatie sequencing. In dit artikel presenteren we een eenvoudige en snelle methode om tumorcellen te verrijken en te verkrijgen intact DNA touch Impressum cytologie specimens.

Eenvoudige en snelle methode om kwalitatief hoogwaardige Tumor DNA uit klinisch-pathologische monsters met behulp van Touch Impressum cytologie

Leer multiplex-immunohistochemie om immuuncellen in het tumor-micro-milieu te karakteriseren met behulp van FFPE-weefsels en digitale beeldanalyse. Deze methode helpt onderzoekers bij het begrijpen van immuunresponsen en therapie-uitkomsten.

Multiplex-immunohistochemische analyse van het ruimtelijke immuuncellandschap van de micro-omgeving van de tumor

Meer video's verkennen