Name: Extractie van diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T13:10:00.000+00:00
Duration: 4 min 20 s
Description: Leer een eenvoudige diatomeeën-DNA-extractiemethode voor forensisch onderzoek naar verdrinking. Dit protocol gebruikt een gemodificeerde kit om betrouwbaar DNA te isoleren uit watermonsters en weefsels.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82060341,81560304) en door het Academician Innovation Platform Scientific Research Project van de provincie Hainan (YSPTZX202134).

Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Hainan Medical University. De weefselmonsters die in dit onderzoek zijn gebruikt, worden niet beschouwd als studies met menselijke proefpersonen. Deze monsters werden verkregen met het oog op forensische pathologische diagnose en de rest werd gebruikt voor de extractie van diatomeeën-DNA in dit experiment. Onderzoekers kunnen niet gemakkelijk individuen identificeren om geïnformeerde toestemming van relevante belanghebbenden te verkrijgen.
OPMERKING: Om de algemene toepasbaarheid van de onderzoeksmethode die in dit experiment wordt gerapporteerd te garanderen, volgde dit experiment in principe de gebruiksaanwijzing van de gebruikte kit en werden slechts enkele stappen gewijzigd. De watermonsters die in dit experiment werden gebruikt, werden willekeurig genomen uit vijvers in de buurt van het laboratorium (aanvullende figuur 1A). In dit experiment werd het longweefsel van het verdronken lichaam bevestigd als het onderzoeksweefsel om het extractieprotocol te demonstreren (aanvullende figuur 1B). In de forensische praktijk is het soms ook nodig om andere organen en weefsels van verdronken lichamen (zoals lever, milt, nieren, beenmerg, enz.) te gebruiken om diatomeeën-DNA te extraheren, wat kleine overeenkomstige verbeteringen aan deze experimentele methode vereist, die zullen worden uitgelegd in het overeenkomstige deel van het experiment. De longweefselmonsters die in dit experiment werden gebruikt, waren afkomstig van lijken die duidelijk waren verdronken in forensische gevallen. Morfologische tests zijn uitgevoerd om aan te tonen dat het longweefsel diatomeeën bevat (aanvullende figuur 2).
1. Voorbehandeling van monsters
<ol><li>Voorbehandeling van watermonsters<ol><li>Neem 10 ml watermonster in de centrifugebuis en centrifugeer gedurende 5 minuten op 13.400 x g . Gooi 9,8 ml supernatans voorzichtig weg met een pipetpistool en breng ongeveer 200 μl verrijkt diatomeeënwatermonster dat op de bodem achterblijft over in een centrifugebuisje van 2 ml. OPMERKING: Pre-experiment kan eerst worden uitgevoerd en de initiële hoeveelheid kan worden verhoogd als een watermonster van 10 ml niet voldoende is voor verrijking.</li>
	</ol></li>
	<li>Voorbehandeling van weefselmonsters<ol><li>Neem 0,5 g van het longrandweefsel uit het verdronken lichaam, hak of maal het longweefsel volledig totdat het modderig wordt. Het voorkomen van contaminatie van exogene diatomeeën is de kern van deze stap. Knip het weefsel herhaaldelijk in stukjes met een schaar.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DNA-extractie
NOTITIE: Alle centrifugeerstappen worden voltooid bij kamertemperatuur. Met behulp van een desktopcentrifuge met een middelpuntvliedende kracht van 14.500 x g; een tot 70 °C voorverwarmd waterbad (of metaalbad) moet worden voorbereid voordat het experiment begint. Alle stappen moeten strikt de principes van aseptische werking volgen.
<ol><li>Assemblage van watermonsters en weefsels OPMERKING: De DNA-extractiemethode van het watermonster en de DNA-extractiemethode van weefseldiatomeeën zijn hetzelfde.<ol><li>Voeg glasparels toe aan een centrifugebuis van 2 ml met daarin het voorbehandelde watermonster. Keer 10x-15x om om goed te mengen. De toegevoegde glaskralen zijn samengesteld uit grote en kleine glaskralen gemengd in een massaverhouding van 1:1. De diameter van grote glaskralen is 1,5-2,0 mm en van de kleine glaskralen is 0,4-0,6 mm.</li>
		<li>Neem 0,5 g fijngehakt weefsel, voeg glasparels toe aan een centrifugebuisje van 2 ml met het weefsel zoals hierboven beschreven. Keer 10x-15x om om te mengen.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg 40 μL proteïnase K (20 mg/ml) toe aan de buisjes. Zet 15 minuten op kamertemperatuur, keer in deze periode om en meng 10x om de 3 minuten. OPMERKING: Als het weefsel niet volledig wordt verteerd, kan de hoeveelheid proteïnase K op de juiste manier worden verhoogd totdat de oplossing helder wordt.</li>
	<li>Voeg 200 μL bindingsbuffer toe aan de centrifugebuizen, onmiddellijk vortex, en meng gedurende 4 minuten (oscillatiemengfrequentie: 3000 tpm). NOTITIE: In deze stap moeten de intensiteit en tijd van het schudden strikt worden gecontroleerd om voldoende mengintensiteit en -tijd te garanderen.</li>
	<li>Leg de centrifugebuisjes gedurende 10 minuten in een waterbad van 70 °C en de oplossing wordt helder.</li>
	<li>Voeg 100 μL isopropanol toe aan de centrifugebuisjes, vortex en meng gedurende 15 s, op dit moment kan er vlokkige neerslag optreden. OPMERKING: Het is erg belangrijk om goed te mengen met de juiste sterkte in de bovenstaande bedieningsstappen, maar krachtig schudden moet worden vermeden om DNA-afschuiving te voorkomen.</li>
	<li>Breng de in de vorige stap verkregen oplossing samen met het vlokkige neerslag in de adsorptiekolom (de adsorptiekolom wordt in de opvangbuis geplaatst). De lengte van de adsorptiekolom is 3,0 cm, de diameter is 1,0 cm en de adsorptiematrix is een membraan van een siliciummatrix.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 30 s bij 8.000 x g , gooi de afvalvloeistof in de opvangbuis en plaats de adsorptiekolom terug in de opvangbuis.</li>
	<li>Voeg 500 μL inhibitorverwijderingsbuffer toe aan de adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.</li>
	<li>Voeg 700 μL wasbuffer toe aan de adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis. NOTITIE: Voeg voor het eerste gebruik de gespecificeerde hoeveelheid absolute ethanol toe aan de wasbufferfles.</li>
	<li>Voeg 500 μL wasbuffer toe aan de adsorptiekolom. Centrifugeer gedurende 30 s bij 13.400 x g en gooi de afvalvloeistof weg in de opvangbuis.</li>
	<li>Plaats de adsorptiekolom terug in de lege opvangbuis. Centrifugeer op 14.500 x g gedurende 2 minuten en verwijder de wasbuffer zoveel mogelijk, om te voorkomen dat de resterende ethanol in de wasbuffer de stroomafwaartse reacties remt.</li>
	<li>Haal de adsorptiekolom eruit en plaats deze in een schone centrifugebuis. Voeg 100 μL elutiebuffer toe aan het middelste deel van het adsorptiemembraan.</li>
	<li>Plaats de adsorptiekolom 3-5 minuten op kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1 minuut op 13.400 x g .</li>
	<li>Voeg de in de vorige stap verkregen oplossing opnieuw toe aan de centrifugale adsorptiekolom. Plaats de centrifugale adsorptiekolom gedurende 2 minuten op kamertemperatuur en centrifugeer gedurende 1 minuut op 13.400 x g . OPMERKING: De elutiebuffer moet ongeveer 10 minuten worden voorverwarmd in een waterbad van 70 °C. Het elutievolume mag niet minder zijn dan 50 μL; anders wordt de DNA-opbrengst verminderd.</li>
	<li>Bewaar het geëxtraheerde diatomeeën-DNA bij 2-8 °C voor toekomstig gebruik. Als de DNA-oplossing lange tijd moet worden bewaard, bewaar deze dan bij -20 °C.</li>
</ol>3. PCR-test
OPMERKING: Aangezien het gehalte aan diatomeeën in forensische monsters vaak laag is, kunnen de weefselmonsterextracten van de verdronken lichamen ook verschillende gradaties van weefsel en organen (zoals de longen in dit experiment) met hun eigen DNA bevatten. Daarom weerspiegelt directe detectie van totaal DNA in DNA-extracten niet de situatie van diatomeeën-DNA-extractie. In dit experiment werden diatomeeënspecifieke primers geselecteerd en werden PCR-producten gebruikt om de diatomeeën-DNA-extractie in het extract te evalueren. De producten kunnen worden waargenomen en geanalyseerd door middel van agarosegelelektroforese en kunnen ook worden geanalyseerd door middel van een real-time fluorescerende kwantitatieve PCR-smeltcurve, die een hogere gevoeligheid heeft.
<ol><li>Voeg 2 μL van het geëxtraheerde DNA uit watermonsters en weefsels toe als sjabloon. Kies een van de volgende twee inspectiemethoden.</li>
	<li>Conventionele PCR-test<ol><li>Gebruik primers22 die specifiek diatomeeën 18S rDNA-fragmenten kunnen versterken. Zie tabel 1 voor nadere bijzonderheden.</li>
		<li>Stel het PCR-reactiesysteem en de amplificatievoorwaarden vast volgens de kenmerken van de primers. Zie tabel 2 voor nadere bijzonderheden.</li>
		<li>Voer de producten van PCR-amplificatie uit op 2% agarosegel. Observeer en analyseer de beeldvorming met een gelimager.</li>
	</ol></li>
	<li>Fluorescerende kwantitatieve PCR-test<ol><li>Gebruik de bovenstaande primers die specifiek diatomeeën 18S rDNA-fragmenten kunnen amplificeren om een real-time fluorescerend kwantitatief PCR-reactiesysteem voor te bereiden. Zie tabel 3 voor nadere bijzonderheden.</li>
		<li>Voer PCR-amplificatie uit en analyseer de verkregen amplificatiecurve en Ct-waarden. Stel tegelijkertijd een programma in, smelt de dubbele strengen van de geamplificeerde producten geleidelijk in enkele strengen door middel van fluorescerende kwantitatieve PCR-smeltcurvetechnologie en analyseer vervolgens de verkregen smeltcurves.</li>
	</ol></li>
</ol>

Voordelige diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste kit

<ol><li>Liu, C., Cong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+prospect+of+diagnosis+of+drowning+deaths+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).</li>
<li>Frisoni, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+diagnosis+of+freshwater+or+saltwater+drowning+using+the+marker+aquaporin+5%3A+An+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study.</a> Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458(2022).</li>
<li>Mann, D. G., Vanormelingen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inordinate+fondness%3F+The+number%2C+distributions%2C+and+origins+of+diatom+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Eukaryot+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species.</a> J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).</li>
<li>Pfister, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terrestrial+diatoms+as+tracers+in+catchment+hydrology%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22WIREs+Water%22%5BJournal%5D)">Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review.</a> WIREs Water. 4, 1241(2017).</li>
<li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+automated+diatom+detection+method+based+on+YOLOv5+framework+and+its+preliminary+study+for+taxonomy+recognition+in+the+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test.</a> Front Microbiol. 13, 963059(2022).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+length+and+width+of+diatoms+in+drowning+cases+as+the+evidence+of+diatoms+penetrating+the+alveoli-capillary+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier.</a> Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).</li>
<li>Kihara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+water+injection+into+lungs+using+an+animal+model%3A+Verification+of+the+diatom+concentration+test+to+diagnose+drowning%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning.</a> Forensic Sci Int. 327, 110983(2021).</li>
<li>Shen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+false-positive+results+of+diatom+test+in+the+diagnosis+of+drowning-would+not+be+an+impediment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment.</a> Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).</li>
<li>Manoylov, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+identification+of+algae+%28morphological+and+molecular%29%3A+species+concepts%2C+methodologies%2C+and+their+implications+for+ecological+bioassessment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phycol%22%5BJournal%5D)">Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment.</a> J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).</li>
<li>Uchiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+molecular+approach+to+help+conclude+drowning+as+a+cause+of+death%3A+simultaneous+detection+of+eight+bacterioplankton+species+using+real-time+PCR+assays+with+TaqMan+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes.</a> Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).</li>
<li>Kakizaki, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+diverse+aquatic+microbes+in+blood+and+organs+of+drowning+victims%3A+first+metagenomic+approach+using+high-throughput+454-pyrosequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing.</a> Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).</li>
<li>Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Progress+of+High-Throughput+Sequencing+Technology+in+Forensic+Diatom+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).</li>
<li>Xiao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+a+multiplex+PCR+system+for+drowning+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis.</a> Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).</li>
<li>Yarimizu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+absolute+quantification+method+for+ribosomal+RNA+gene+copy+numbers+per+eukaryotic+single+cell+by+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Harmful+Algae%22%5BJournal%5D)">Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR.</a> Harmful Algae. 103, 102008(2021).</li>
<li>Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+shell+incorporated+PHBV%2FPCL-pullulan+co-electrospun+scaffold+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).</li>
<li>Malviya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+global+diatom+distribution+and+diversity+in+the+world%27s+ocean%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).</li>
<li>Brunner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+studies+of+silica+biomineralization%3A+towards+an+understanding+of+silica+processing+by+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).</li>
<li>Annunziata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimised+method+for+intact+nuclei+isolation+from+diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms.</a> Sci Rep. 11 (1), 1681(2021).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnostic+value+of+quantitative+assessment+of+diatom+test+for+drowning%3A+An+analysis+of+128+water-related+death+cases+using+microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy.</a> J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).</li>
<li>Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microwave+digestion-vacuum+filtration-automated+scanning+electron+microscopy+as+a+sensitive+method+for+forensic+diatom+test%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Legal+Med%22%5BJournal%5D)">Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test.</a> Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+glass+bead-vortex+oscillation+method+for+DNA+extraction+from+diatom%5BTitle%5D)+AND+%22Fa+Yi+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom.</a> Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).</li>
<li>Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+diatoms%3A+evaluation+of+the+V4+subregion+on+the+18S+rRNA+gene%2C+including+new+primers+and+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Divers+Evol%22%5BJournal%5D)">Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols.</a> Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).</li>
<li>Vinayak, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chloroplast+gene+markers+detect+diatom+DNA+in+a+drowned+mice+establishing+drowning+as+a+cause+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death.</a> Electrophoresis. , (2020).</li>
<li>Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+and+Spatial+Influences+on+Biogeography+and+Community+Structure+of+Saltmarsh+Benthic+Diatoms%5BTitle%5D)+AND+%22Estuaries+and+Coasts%22%5BJournal%5D)">Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms.</a> Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).</li>
<li>Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Real time quantitative PCR.</a> Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).</li>
<li>Ben Amor, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+TaqMan+qPCR+assay+for+rapid+detection+and+quantification+of+Gymnodinium+catenatum+for+application+to+harmful+algal+bloom+monitoring+in+coastal+areas+of+Tunisia%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia.</a> Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).</li>
<li>Doddaraju, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+and+early+diagnosis+of+bacterial+blight+in+pomegranate+caused+by+Xanthomonas+axonopodis+pv.+punicae+using+sensitive+PCR+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques.</a> Sci Rep. 9 (1), 10097(2019).</li>
<li>Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False-positive+diatom+test%3A+a+real+challenge%3F+A+post-mortem+study+using+standardized+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Leg+Med+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols.</a> Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).</li>
<li>Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+carbon+availability+in+benthic+diatom+communities%3A+photosynthesis+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398(2017).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzyme+digestion+time+on+the+detection+of+diatom+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pak+J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species.</a> Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diatom+DNA+barcodes+for+forensic+discrimination+of+drowning+incidents%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents.</a> FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145(2020).</li>
<li>Mizushima, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+heart-specific+RING+finger+protein+207+is+involved+in+energy+metabolism+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes.</a> J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).</li>
<li>Zimmermann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+reference+libraries+for+environmental+barcoding%3A+a+best+practice+example+from+diatom+research%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research.</a> PLoS One. 9 (9), 108793(2014).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Diatomeeëncellen worden beschermd door harde kiezelhoudende celwanden17, en deze structuur moet worden vernietigd om diatomeeën-DNA te extraheren. Gewone kits vernietigen niet gemakkelijk de kiezelhoudende schil van diatomeeën; dus het is moeilijk om diatomeeën-DNA21 met succes te extraheren. Ons laboratorium verbeterde de meest gebruikte bloed-DNA-extractiekit door glasparels met verschillende diameters en verschillende massaverhoudingen toe te voegen tijdens het proces va...

In de forensische praktijk is het essentieel voor de goede afwikkeling vande zaak om vast te stellen of een lijk dat in het water is gevonden, te verdrinken of na de dood in het water is gegooid. Het is ook een van de moeilijke kwesties die dringend moeten worden opgelost in de forensische praktijk2. Diatomeeën zijn overvloedig aanwezig in de natuurlijke omgeving (vooral in water)3,4. Tijdens het verdrinkingsproces, als gevolg van hypoxie en stressreactie, zullen mensen intense ademhalingsbewegingen hebben en een grote hoeveelheid verdrinkingsvloeistof inademen. Daarom komen de diatomeeën in het water de longen binnen met de verdrinkingsvloeistof, en sommige diatomeeën kunnen via de alveolair-capillaire barrière in de bloedcirculatie terechtkomen en zich verspreiden naar inwendige organen met de bloedstroom 5,6. De detectie van diatomeeën in inwendige weefsels en organen zoals longen, lever en beenmerg is een sterk bewijs van verdrinking voor de dood 7,8. Momenteel is forensisch diatomeeënonderzoek voornamelijk gebaseerd op morfologische testmethoden. Na een reeks voorvertering van het weefsel worden de morfologische kwalitatieve en kwantitatieve schattingen van onverteerde diatomeeën onder de microscoop uitgevoerd. Gedurende deze periode moeten gevaarlijke en milieuonvriendelijke reagentia zoals salpeterzuur worden gebruikt. Dit proces is tijdrovend en vereist dat onderzoekers beschikken over solide taxonomische expertise en uitgebreide ervaring. Dit alles brengt bepaalde uitdagingen met zich mee voor het forensisch personeel9. Diatomeeën-DNA-testtechnologie is een nieuwe technologie voor diatomeeëntesten die de afgelopen jaren is ontwikkeld 10,11,12. Deze technologie realiseert de soortidentificatie van diatomeeën door de specifieke DNA-sequentiesamenstelling van diatomeeënte analyseren 13,14. PCR-technologie en sequencing-technologie zijn veelgebruikte technische methoden, maar hun basis is de succesvolle extractie van DNA uit diatomeeën. Diatomeeën hebben echter een speciale structuur die verschilt van andere organismen, waardoor hun DNA-extractietechnieken ook anders zijn.
De celwand van diatomeeën heeft een hoge mate van verkiezeling en het hoofdbestanddeel is siliciumdioxide 15,16,17. De kiezelcelwand is erg hard en moet worden vernietigd voordat het DNA wordt geëxtraheerd. Gewone DNA-extractiekits zijn vaak moeilijk direct te gebruiken voor de extractie van diatomeeën-DNA, omdat ze de kiezelhoudende schil van diatomeeën niet kunnen vernietigen18. Daarom is het vernietigen van de kiezelhoudende schil van diatomeeën een van de belangrijkste technische problemen die moeten worden opgelost bij het extraheren van diatomeeën-DNA.
Tegelijkertijd, aangezien het aantal diatomeeën in forensische onderzoeksmonsters, of het nu gaat om watermonsters of organen en weefsels van verdronken lichamen, vaak beperkt is, is het noodzakelijk om diatomeeën te verrijken. De essentie van verrijking is het scheiden van stoffen. Terwijl u diatomeeën probeert te verzamelen, minimaliseert u het gehalte aan andere materiële componenten (storende componenten). Bij forensisch werk gebruiken laboratoria vaak centrifugatie- of membraanfiltratieverrijkingsmethoden om diatomeeëncellen te scheiden19. Omdat vacuümpompapparatuur echter niet veel wordt gebruikt, wordt de membraanverrijkingsmethode niet vaak gebruikt in gewone primaire forensische laboratoria. De centrifugatiemethode is dus nog steeds gebruikelijk diatomeeënverrijking in forensische laboratoria20.
DNA-extractie uit diatomeeën wordt momenteel voornamelijk gebruikt in de forensische praktijk en er zijn aanzienlijke beperkingen aan de toepassing ervan. Op dit moment zijn er maar weinig diatomeeën-DNA-extractiekits op de markt die in de forensische wetenschap worden gebruikt en ze zijn over het algemeen duur21. Dit artikel biedt een verbeterde diatomeeën-DNA-extractiemethode, waardoor diatomeeën-DNA-extractie eenvoudig, handig en kosteneffectief wordt. Dit verhoogt de toepassing van latere moleculair-biologische tests van diatomeeën en kan problemen met betrekking tot verdrinking in de forensische geneeskunde beter oplossen door middel van diatomeeëntesten. Deze methode breekt de kiezelhoudende celwanden van diatomeeën door glasparels toe te voegen en een geschikte tijd voor vortex in te stellen. Op deze manier lyseren het proteïnase K en de bindingsoplossing de cellen snel en inactiveren ze verschillende enzymen in de cellen. Het genomische DNA wordt geabsorbeerd in het matrixmembraan in de adsorptiekolom en uiteindelijk geëlueerd door de elutiebuffer. Zo'n verbeterde volbloed genextractiekit verbetert het diatomeeën-DNA-extractie-effect van de bloedkit in forensisch onderzoeksmateriaal, verlaagt de kosten van diatomeeën-DNA-extractie in de forensische praktijk en kan beter worden toegepast op forensisch onderzoek aan de basis.

<table><tbody><tr><td>Binding Buffer</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>snel lytische cellen</td></tr><tr><td>ChemoHS qPCR Mix</td><td>Monad</td><td>00007547-120506</td><td>qPCR Mix</td></tr><tr><td>D2000 DNA ladder</td><td>Real-Times(Beijing) Biotechnology</td><td>RTM415</td><td>Meet de positie van elektroforetische banden</td></tr><tr><td>D512</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109196</td><td>voorwaartse primer</td></tr><tr><td>D978</td><td>Taihe Biotechnology</td><td>TW21109197</td><td>achterwaartse primer</td></tr><tr><td>Elution buffer</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Een lage zout elutie buffer spoelt het DNA af</td></tr><tr><td>Glass bead</td><td>Yingxu Chemical Machinery(Shanghai)&nbsp;</td><td>70181000</td><td>Speciale glazen kralen voor verspreiden en malen</td></tr><tr><td>Import adsorptiekolom</td><td>BioTeke</td><td>B2008006022</td><td>Adsorptiekolom met silica matrix membraan</td></tr><tr><td>Inhibitor Removal Buffer</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Verwijdering van remmers in DNA-extractie</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Precipitatie of isolatie van DNA</td></tr><tr><td>MIX-30S Mini Mixer</td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td><td>oscillerende actie</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Inactivatie van intracellulaire nucleasen en andere eiwitten</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q 5plex HRM</td><td>Qiagen</td><td>R1116175</td><td>real-time fluorescentie kwantificering PCR</td></tr><tr><td>Speed Micro-Centrifuge</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td>centrifuge</td></tr><tr><td>Tanon 3500R Gel Imager</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>gel beeldvorming</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Mix</td></tr><tr><td>Thermo Cycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>gewone PCR</td></tr><tr><td>Wash Buffer</td><td>BioTeke</td><td>B010006022</td><td>Verwijder onzuiverheden zoals celmetabolieten</td></tr></tbody></table>

extractie van diatomeeën-dna uit watermonsters en weefsels

Extraction of Diatom DNA from Water Samples and Tissues

Diatomeeënonderzoek is een essentieel hulpmiddel in de forensische praktijk om te bepalen of het lijk in water is verdronken en om de verdrinkingslocatie af te leiden. Diatomeeëntesten is ook een belangrijke onderzoeksinhoud op het gebied van milieu en plankton. De diatomeeën moleculair biologische testtechnologie, die zich richt op diatomeeën-DNA als primair onderzoeksobject, is een nieuwe methode voor het testen van diatomeeën. Diatomeeën-DNA-extractie is de basis van moleculair testen van diatomeeën. Op dit moment zijn de kits die vaak worden gebruikt voor diatomeeën-DNA-extractie duur, wat de kosten van het uitvoeren van gerelateerd onderzoek verhoogt. Ons laboratorium verbeterde de algemene volbloed genomische DNA-snelextractiekit en verkreeg een bevredigend diatomeeën-DNA-extractie-effect, waardoor een alternatieve economische en betaalbare DNA-extractieoplossing wordt geboden op basis van glasparels voor gerelateerd onderzoek. Het diatomeeën-DNA dat met behulp van dit protocol wordt geëxtraheerd, zou kunnen voldoen aan veel stroomafwaartse toepassingen, zoals PCR en sequencing.

Aangezien de DNA-oplossing die met de momenteel gebruikte DNA-extractiemethode wordt geëxtraheerd, alle DNA-componenten uit verschillende bronnen in het monster bevat, was het DNA dat door dit protocol werd verkregen geen uitzondering. De DNA-oplossing was dus niet alleen een oplossing van diatomeeën-genoom-DNA. De primers die specifiek diatomeeën 18S rDNA-fragmenten kunnen versterken, zijn geselecteerd door de literatuur te raadplegen 22,23,24.<sup cl...

Dit artikel beschrijft een protocol voor diatomeeën-DNA-extractie met behulp van een aangepaste gemeenschappelijke DNA-extractiekit.

Extractie van diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels

Diatom testing is an essential auxiliary means in forensic practice to determine whether the corpse drowned in water and to infer the drowning location. ...

Ons onderzoek richt zich vooral op het onderwerp verdrinking. We wilden de vraag beantwoorden of het lichaam dat in het water werd gevonden stierf door verdrinking, maar ook een andere vraag beantwoorden over waar de persoon in het water viel. Dat betekent dat je de locatie van de verdrinking moet kennen.In vergelijking met andere technologieën bieden we een eenvoudig, handig en economisch diatomeeën-DNA-extractieprotocol dat we beter kunnen gebruiken in forensisch onderzoek, vooral in de forensische basispraktijk. Ons laboratorium zal zich verder richten op de verdrinkingsgerelateerde problemen op basis van het patroon in het water, zoals de doodsoorzaak, het postmorteminterval enzovoort. Daarnaast zetten we het onderzoek ook voort via de forensische entomologie en een aantal bijzondere fenomenen in de tropische forensische geneeskunde.

extraction-of-diatom-dna-from-water-samples-and-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We beschrijven een methode voor de extractie van een hoog moleculair gewicht genomische DNA van plankton biomassa geconcentreerd op 0,22 micrometer Sterivex filters, gevolgd door een cesium chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie voor zuivering.

DNA-extractie van 0,22 uM Sterivex Filters en Cesium Chloride dichtheidsgradiënt centrifugatie

Een methodiek om hoog moleculair gewicht en de hoge kwaliteit van genomisch DNA te isoleren uit de bodem microbiële gemeenschap wordt beschreven.

Extractie met een hoog molecuulgewicht Genomic DNA uit bodems en sedimenten

Deze video toont het protocol voor DNA-extractie van formaline gefixeerde in paraffine ingebedde materiaal. Dit is een multi-dagen procedure waarbij weefsel secties worden ontdaan met xyleen, gerehydrateerd met ethanol en behandeld met proteinase K te zuiveren en DNA te isoleren voor latere gen-specifieke of genome-wide analyse.

DNA-extractie van paraffine Embedded materiaal voor genetische en epigenetische Analyses

Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.

Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

Er wordt een protocol gegeven om bacteriële 16S rRNA-genen en transcripten uit kustsedimenten te kwantificeren via real-time PCR. De methodologie omvat de gezamenlijke extractie van DNA en RNA; bereiding van DNA-vrij RNA; en kwantificering van 16S rRNA-genen en transcripten via RT-q-PCR, inclusief de constructie van een standaardcurve.

Gelijktijdig DNA-RNA-extractie uit kustsedimenten en kwantificering van 16S rRNA genen en transcripties van Real-time PCR

De cryosfeer biedt toegang tot bewaarde organismen die bleef onder het verleden omgevingsomstandigheden. Een protocol wordt gepresenteerd te verzamelen en te ontsmetten permafrost kernen van de bodem en ijs. De afwezigheid van exogeen DNA kolonies en suggereren dat microorganismen gedetecteerd vertegenwoordigt de theorie en minder contaminatie door boren of verwerking.

Verwijdering van exogene materialen uit het buitenste gedeelte van Frozen Cores tot de Oude Biologische Gemeenschappen koesterde Inside Onderzoek

We beschrijven een protocol voor het filtreren van watermonsters met een filtercartridge en het extraheren van omgevings-DNA (eDNA) zonder dat het behuizing hoef te worden geopend om de filter te verwijderen. Dit protocol is ontwikkeld voor metabarcoding van eDNA van vissen, maar is ook toepasbaar op eDNA van andere organismen.

Het gebruik van een filter cartridge voor filtratie van watermonsters en Winning van Environmental DNA

Meest voorkomende analyses van de inhoud van de darm van macroinvertebrates zijn visueel. Waarbij intensieve kennis over morfologische diversiteit van organismen van de prooi, ze missen zachte lijf prooi en, als gevolg van de sterke trimventilatoren van de prooi, zijn bijna onmogelijk voor sommige organismen, met inbegrip van vlokreeftjes. Wij bieden gedetailleerde, roman genetische methoden voor macroinvertebrate ten prooi identificatie in het dieet van vlokreeftjes.

Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Het protocol detecteert belangrijke methaancyclusgenen in de wetlands aan de kust van Zuid-Texas en visualiseert hun ruimtelijke verdeling om het begrip van methaanregulatie en de milieueffecten ervan in deze dynamische ecosystemen te vergroten.

Visualisatie van methaan-cyclische microbiële dynamiek in wetlands aan de kust

Betrouwbare en nauwkeurige vormen van veldinzetbare DNA-analyse zijn cruciaal voor veel industrieën. Dit artikel biedt twee methoden voor milieumicrobiële analyse in het veld: 1) de isolatie van microbieel DNA uit omgevingsmonsters met behulp van een biologische extractie-veldkit, en 2) de analyse van DNA via de field qPCR-eenheid.

Microbieel DNA-onderzoek in het veld met behulp van een biologische extractie-veldkit en een veld-qPCR-eenheid

Leer een eenvoudige diatomeeën-DNA-extractiemethode voor forensisch onderzoek naar verdrinking. Dit protocol gebruikt een gemodificeerde kit om betrouwbaar DNA te isoleren uit watermonsters en weefsels.

Extractie van diatomeeën-DNA uit watermonsters en weefsels

Meer video's verkennen