Name: Herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier naar pluripotentie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer hoe je ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier herprogrammeert naar pluripotente stamcellen met behulp van lentivirale transductie. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van kankerprogressie en heterogeniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S en J.K willen Cancer Research UK en OHSU bedanken voor de financiering (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S wordt ondersteund door een MRC career development award (MR/N024028/1). AA wordt gefinancierd door een Ph.D. beurs (Scholarship ref. 1078107040) van King Abdulaziz City for Science and Technology. JK wordt gefinancierd door MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) en Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Wij danken Prof. Keisuke Kaji voor het beschikbaar stellen van de herprogrammeervector pSIN4-EF1a-O2S en pSIN4-CMV-K2M. Ten behoeve van open access heeft de auteur een Creative Commons Attribution (CC BY)-licentie toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortkomt uit deze inzending.

Herprogrammering van PDAC- en pancreascellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Om het gebruik van iPSC-herprogrammering voor het bestuderen van kankerprogressie te vergemakkelijken, is een robuust protocol opgesteld voor het herprogrammeren van alvleesklierkankercellen. Het herprogrammeren van kankercellen tot pluripotentie is tot nu toe een grote uitdaging gebleken, aangezien slechts enkele onderzoeken met succes iPSC's hebben gegenereerd uit kankercellen 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46. De meeste van deze onderzoeken gebruikten onsterfelijke kankercellijnen om iPSC-lijnen te genereren, geen primaire van patiënten afgeleide cellen 36,37,38,40,42,43,44,46. Er werd bijvoorbeeld geprobeerd vier verschillende leverkankercellijnen te herprogrammeren met behulp van de retrovirale introductie van OSKM-factoren, maar slechts één cellijn werd met succes geherprogrammeerd41. De gegenereerde iPSC-lijn voor leverkanker vertoonde echter een verlies van stamheid na een paar passages, wat de hoge weerstand van kankercellen tegen OSKM-herprogrammering benadrukte41. Eerder werden pogingen ondernomen om PDAC-cellen te herprogrammeren met behulp van lentivirale toediening van OSKM individueel; er werd echter slechts één iPSC-lijn gegenereerd, afhankelijk van exogene OSKM-expressie en daarom niet volledig geherprogrammeerd37. Een andere studie gebruikte episomale vectoren om OSKM-factoren af te leveren zonder genomische integratie, maar slaagde er slechts in om een enkele iPSC-kloon van PDAC39 te genereren. Het beperkte succes bij het herprogrammeren van kankercellen draagt bij aan de vele uitdagingen die het gebruik van iPSC-technologie in kankeronderzoek belemmeren.
Hier wordt het genereren van iPSC's uit primaire PDAC-monsters afkomstig van twee verschillende patiënten en één gevestigde PDAC-cellijn (BxPc3) uitgelegd. Bovendien zijn er ook iPSC's gegenereerd uit H6c7, een ductale epitheelcellijn van de pancreas. Voor zover wij weten, is dit het eerste rapport van succesvol afgeleide stabiele iPSC-lijnen van BxPc3 en H6c7. Volgens dit protocol zijn iPSC's ook met succes gegenereerd uit primaire menselijke fibroblasten die zijn afgeleid van gezonde individuen, waardoor de toepasbaarheid van de methode verder gaat dan kankeronderzoek.
Een van de belangrijkste elementen achter het succes van het protocol is het gebruik van bicistronische lentivirale vectoren om OS- en KM-factoren samen tot expressie te brengen. Deze vectoren bevatten de interne ribosoomingangsplaats 2 (IRES2) om OCT4 en SOX2 in de ene vector tot expressie te brengen en KLF4 en cMYC in de andere. Meerdere studies waarbij monocistronische vectoren werden gebruikt, waarbij elke herprogrammeringsfactor afzonderlijk werd geleverd, hebben aangetoond dat de opname van elke vector anders is, wat van invloed is op de OSKM-stoichiometrie en de efficiëntie van herprogrammering47. Het gebruik van bicistronische vectoren kan dit probleem helpen verminderen. Bovendien heeft het gebruik van IRES in lentivirale vectoren een aanzienlijke toename van de herprogrammeringsefficiëntie laten zien48. In dit lentivirussysteem wordt de OS-expressie aangestuurd door de EF1a-promotor, terwijl de KM-expressie onder controle staat van een CMV-promotor. Het is bekend dat de CMV-promotor kan worden onderworpen aan zeer efficiënte uitschakeling door DNA-methylering en histondeacetylering, in tegenstelling tot EF1a49,50. Daarom kan het vroegtijdig tot zwijgen brengen van KM vóór het besturingssysteem tijdens het herprogrammeren een sleutelfactor zijn voor het succes van het protocol. Dit komt overeen met eerdere studies die het belang van OSKM-expressiedynamiek aantonen tijdens het herprogrammeren van 51,52,53,54,55. De bicistronische vector is dus ook voordeliger dan de polycistronische vector, waarbij alle OSKM-factoren worden uitgedrukt vanuit een enkele promotor56. Andere factoren die bijdragen aan het succes van het protocol zijn onder meer de doses lentivirusinfectie en het aantal geïnfecteerde cellen dat wordt gebruikt voor herprogrammering, die voor elk celtype zijn aangepast.
Samengevat wordt een geoptimaliseerde methode gepresenteerd voor het herprogrammeren van primaire PDAC-cellen samen met andere cellijnen en normale cellen. Deze methode zal helpen het gebruik van iPSC-herprogrammering uit te breiden om kankerprogressie te modelleren en, in dit geval, vroege PDAC-biomarkers te ontdekken.

Ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) is een van de meest fatale maligniteiten en een vroege diagnose blijft een uitdaging vanwege de asymptomatische aard van de ziekte. De meerderheid van de PDAC-patiënten wordt gediagnosticeerd in het gevorderde gemetastaseerde stadium wanneer zeer beperkte behandelingsopties beschikbaar zijn 1,2. Dit is voornamelijk te wijten aan het gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de vroege stadia, zoals die welke gemakkelijk kunnen worden gedetecteerd als eiwitten die in de bloedbaan vrijkomen.
PDAC kan zich zeer vroeg tijdens de progressie verspreiden en een betere prognose is in verband gebracht met vroege detectie van kanker wanneer PDAC is gelokaliseerd in de alvleesklier3. Minder dan een tiende van de PDAC-patiënten wordt echter gediagnosticeerd met een gunstige prognose, waardoor chirurgische resectie mogelijk is. Desalniettemin zijn die weinigen met resectabele tumoren ook vatbaar voor tumorrecidief binnen 12 maanden4.
In de afgelopen vijf decennia zijn opmerkelijke verbeteringen aangebracht in chirurgische technieken, patiëntenzorg en behandelingsmodaliteiten 5,6. De 5-jaarsoverleving bij chirurgisch verwijderde PDAC-patiënten is echter nauwelijks gestegen tot 17%. Dit is echter nog steeds beter dan dat bij niet-gereseceerde patiënten, dat vrijwel onveranderd is gebleven (0,9%)4,7. Chemotherapie is de enige andere alternatieve PDAC-behandeling. Toch is deze optie zeer beperkt, aangezien de overgrote meerderheid van de PDAC-patiënten een sterke resistentie vertoont tegen chemotherapiemedicijnen zoals Gemcitabine 7,8. Andere geneesmiddelen, zoals erlotinib, zijn alleen beschikbaar voor een kleine groep PDAC-patiënten met specifieke mutaties, van wie de meesten erlotinib-resistentie vertonen9. De nadelige bijwerkingen die gepaard gaan met chemotherapie bij de meeste PDAC-patiënten zijn nog een ander nadeel van dezebehandeling10. Onlangs hebben veelbelovende strategieën aangetoond dat immuuncheckpointremmers (ICI's) en small molecule kinaseremmers (SMKI's) effectief kunnen zijn bij de behandeling van PDAC, maar duurzame reacties op deze gerichte therapieën blijven beperkt tot een minderheid van de patiënten11,12. Over het algemeen kan de ontdekking van PDAC-specifieke vroege biomarkers nieuwe wegen effenen voor vroege diagnose en behandeling.
PDAC ontwikkelt zich uit voorloperlaesies van intra-epitheliale neoplasmata van de pancreas (PanIN) die het gevolg zijn van niet-invasieve proliferaties van het epitheel van de ductus pancreaticus13,14. Hoewel de vorming van PanIN wordt geïnitieerd door oncogenmutaties zoals KRAS, zijn aanvullende genetische en epigenetische veranderingen vereist voor de progressie naar PDAC. Er is voorspeld dat de progressie van PanIN door de verschillende stadia naar invasieve PDAC ongeveer 10 jaar duurt 13,15,16,17. Dit tijdsbestek biedt een geweldige kans om te profiteren van een vroege PDAC-diagnose. Daarom is er uitgebreid onderzoek gedaan om tumor-xenotransplantaatdiermodellen en organoïdeculturen vast te stellen om PDAC-progressie 18,19,20,21 te bestuderen. Deze modellen zijn zeer nuttig geweest voor het bestuderen van de invasieve stadia van PDAC, hoewel niet de overgang van de vroege PanIN-fasen. Het is daarom belangrijk om experimentele modellen te ontwikkelen die de vroege progressie van PanIN-stadia kunnen samenvatten om de ontdekking van biomarkers voor vroege detectie mogelijk te maken.
Het herprogrammeren van somatische cellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van de vier transcriptiefactoren OCT4, SOX2, KLF4 en c-MYC (OSKM) heeft de mate van cellulaire plasticiteit geïllustreerd22. De plasticiteit van kankercellen is goed gedocumenteerd en het herprogrammeren van menselijke kankercellen in iPSC's is met succes gebruikt om cellen terug te zetten naar hun oorspronkelijke cellulaire toestand, waardoor veel van de epigenetische beledigingen die zich tijdens de progressie van kanker hebben opgehoopt, zijn verwijderd 23,24,25,26,27,28,29. De mogelijkheid om deze herprogrammeringsstrategie te gebruiken om de identiteit van kankercellen te manipuleren, is daarom veelbelovend bij de behandeling van kanker30,31. We hebben inderdaad eerder aangetoond dat de differentiatie van iPSC's afgeleid van PDAC's de PDAC-progressie door de vroege PanIN-stadia kan recapituleren32. Door genen en routes te identificeren die specifiek zijn voor de vroege tot intermediaire stadia van PDAC, werden kandidaat-biomarkers geïdentificeerd die klinisch kunnen worden gebruikt voor vroege PDAC-diagnose32,33. De biomarkers die werden ontdekt met behulp van een enkele iPSC-lijn vertoonden echter een beperkte dekking bij de meerderheid van de PDAC-patiënten32. De uitdagingen van het genereren van iPSC-lijnen van andere PDAC-patiënten hebben het vermogen om betrouwbaardere biomarkers te ontdekken tot stilstand gebracht. Dit is te wijten aan vele technische factoren, waaronder de heterogeniteit van OSKM-afgifte, aangezien slechts een klein deel van de menselijke primaire PDAC-cellen alle vier de factoren bevatte en met succes reageerde op herprogrammering. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het herprogrammeren van primaire PDAC-cellen met behulp van een efficiëntere en consistentere dubbele lentivirale toediening van OSKM.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td><td>BioLegend</td><td>330613</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td><td>Thermo Fisher</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BxPc3</td><td>ATCC</td><td>CRL-1687</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Collagen, Type I solution from rat tail</td><td>Merck&nbsp;</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>Completed Defined K-SFM</td><td>Thermo Fisher</td><td>&nbsp;10744-019</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td><td>Merck&nbsp;</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Corning syringe filters</td><td>Merck&nbsp;</td><td>CLS431231</td><td></td></tr><tr><td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td><td>Merck&nbsp;</td><td>CLS430599</td><td></td></tr><tr><td>Day Impex&nbsp;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td><td>Thermo Fisher</td><td>12328667</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Fugene HD Transfection Reagent&nbsp;</td><td>Promega&nbsp;</td><td>&nbsp;E2312</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>G5154</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF Recombinant Protein</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td><td>Thermo Fisher</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td><td>Kerafast</td><td>ECA001-FP</td><td></td></tr><tr><td>iMEF feeder cells&nbsp;</td><td>iXcells Biotechnologies</td><td>10MU-001-1V</td><td></td></tr><tr><td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>17005-042</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut serum Replacement&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HP 0.45 &mu;M syringe Filter Unit (Sterile)</td><td>Merck&nbsp;</td><td>SLHP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>pMDG&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>187440</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&nbsp;</td><td>Merck&nbsp;</td><td>H9268-5G</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-CMV-K2M&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21164</td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF2-O2S&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>21162</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>AddGene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pWPT-GFP&nbsp;</td><td>AddGene</td><td>12255</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1049101</td><td></td></tr><tr><td>Sodym Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15899152</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td><td>Thermo Fisher</td><td>12605036</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Thermo Fisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td></td></tr></tbody></table>

herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier naar pluripotentie

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

De generatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van transcriptiefactoren is bereikt uit bijna elk gedifferentieerd celtype en is zeer waardevol gebleken voor onderzoek en klinische toepassingen. Interessant is dat iPSC-herprogrammering van kankercellen, zoals ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC), is aangetoond dat het het invasieve PDAC-fenotype omkeert en het kankerepigenoom opheft. De differentiatie van PDAC-afgeleide iPSC's kan PDAC-progressie recapituleren van de vroege voorloper van intra-epitheliale neoplasie (PanIN) van de pancreas, waardoor de moleculaire en cellulaire veranderingen worden onthuld die vroeg optreden tijdens PDAC-progressie. Daarom kunnen PDAC-afgeleide iPSC's worden gebruikt om de vroegste stadia van PDAC te modelleren voor de ontdekking van diagnostische markers voor vroege detectie. Dit is vooral belangrijk voor PDAC-patiënten, die doorgaans worden gediagnosticeerd in de late metastatische stadia vanwege een gebrek aan betrouwbare biomarkers voor de eerdere PanIN-stadia. Het herprogrammeren van kankercellijnen, waaronder PDAC, in pluripotentie blijft echter een uitdaging, arbeidsintensief en zeer variabel tussen verschillende lijnen. Hier beschrijven we een consistenter protocol voor het genereren van iPSC's uit verschillende menselijke PDAC-cellijnen met behulp van bicistronische lentivirale vectoren. De resulterende iPSC-lijnen zijn stabiel en vertonen geen afhankelijkheid van de exogene expressie van herprogrammerende factoren of induceerbare geneesmiddelen. Over het algemeen vergemakkelijkt dit protocol het genereren van een breed scala aan PDAC-afgeleide iPSC's, wat essentieel is voor het ontdekken van vroege biomarkers die specifieker en representatiever zijn voor PDAC-gevallen.

Representatieve afbeeldingen van de morfologie van iPSC-kolonies afgeleid van PDAC-, BXPc3-, H6C7- en hFib-cellen worden weergegeven in figuur 1. PDAC-iPSC-kolonies begonnen zich te vormen op dag 25 van de herprogrammering. Robuuste iPSC-kolonies met een meer gevestigde ESC-achtige morfologie werden geïdentificeerd op dag 40 van de herprogrammering (Figuur 1). Evenzo begon de vorming van BxPc3-iPSC's op dag 23 en werd meer ingeburgerd op dag 35. De vorming van H6C7-iPSC was vergelijkbaar met PDAC-iPSC's en begon zich op dag 45 te vestigen. hFib-iPSC-kolonies begonnen zich te vormen op dag 15 van de herprogrammering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;"> Figuur 1: Representatieve beelden van iPSC-kolonies. De afbeeldingen tonen een vastgestelde hESC-achtige morfologie die is afgeleid van (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 en (D) hFib. De dagen van herprogrammering staan boven elke afbeelding aangegeven. Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> 
Klonale iPSC-lijnen werden vastgesteld op basis van elke herprogrammering van PDAC-, BxPc3-, H6C7- en hFib-cellen. Alle gevestigde iPSC-lijnen kleurden positief voor TRA-1-60, een ongedifferentieerde hESC-celoppervlaktemarker, wat hun herprogrammering tot pluripotentie bevestigt (Figuur 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65811/65811fig2.jpg"> Figuur 2: Representatieve beelden van klonale iPSC-lijnen. De afbeeldingen zijn afgeleid van (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 en (D) hFib met ESC-achtige morfologie (bovenste panelen) en positieve kleuring voor TRA-1-60 (onderste paneel). Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65811/65811fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het huidige protocol beschrijft de herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de pancreas (PDAC) en normale ductale epitheelcellen van de pancreas tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). We bieden een geoptimaliseerde en gedetailleerde, stapsgewijze procedure, van het bereiden van lentivirus tot het opzetten van stabiele iPSC-lijnen.

Herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier naar pluripotentie

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Alvleesklierstamcellen (CSC's) kunnen worden uitgebreid in vitro met behulp van de verankeringsonafhankelijke sfeercultuurtechniek, wat een krachtig hulpmiddel is om CSC-biologie te bestuderen en kan dienen als de eerste stap om nieuwe CSC-gerichte therapieën te ontwikkelen. Hier wordt de methodologie voor het uitbreiden, analyseren en targeten van pancreas-CSC's geboden.

Studeren alvleesklier- Stamcel Kenmerken voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën

Hier beschrijven we een 4-traps protocol om menselijke embryonale stamcellen te differentiëren naar NKX6-1 + alvleesklier voorlopercellen in vitro. Dit protocol kan worden toegepast op een verscheidenheid van humane pluripotente stamcellijnen.

Efficiënte Differentiatie van pluripotente stamcellen tot NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Pancreatic Progenitors

Dit protocol beschrijft de herprogrammering van de primaire vruchtwater vloeistof en membraan mesenchymale stamcellen in geïnduceerde pluripotente stamcellen met gebruikmaking van een niet-integratie van episomal in volledig chemisch gedefinieerde voorwaarden. Procedures van extractie, cultuur, herprogrammering en karakterisering van de resulterende geïnduceerde pluripotente stamcellen door strenge methoden zijn gedetailleerd.

Herprogrammering van de primaire vruchtwater en membraan cellen pluripotent in Xeno-vrij voorwaarden

Dit protocol beschrijft in detail de generatie van voetafdruk-vrije geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van menselijke pancreatic cellen onder feeder-vrije, gevolgd door bewerken met behulp van CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins en karakterisering van de gewijzigde eencellige klonen.

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Hier beschrijven we een klinisch relevante, hoog rendement, feeder-vrije methode om te herprogrammeren menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van gemodificeerde mRNAs codering herprogrammering factoren en volwassen microRNA-367/302 nabootst. Ook inbegrepen zijn methoden om herprogrammering efficiëntie, te beoordelen vouw klonale iPSC kolonies en bevestigen van de expressie van de pluripotent markering TRA-1-60.

RNA gebaseerde herprogrammering van menselijke primaire fibroblasten in geïnduceerde pluripotente stamcellen

Primaire acinaire cel isolatie, eiwit expressie of activiteit modulatie, cultuur en stroomafwaarts toepassingen zijn heel nuttig in de ex vivo studie van acinaire-naar-ductaal metaplasie (ADM), een vroege evenement in de ontwikkeling van alvleesklierkanker.

Nabootsen en manipuleren van de alvleesklier acinaire-naar-ductaal metaplasie in 3-dimensionale celcultuur

Patiënt-afgeleide organoïde culturen van pancreas ductaal adenocarcinoom zijn een snel gevestigde 3-dimensionale model dat epitheliale tumor cel compartimenten met hoge getrouwheid vertegenwoordigen, waardoor translationeel onderzoek naar deze dodelijke maligniteit. Hier bieden we gedetailleerde methoden om organoïden te vestigen en door te geven en om relevante biologische testen uit te voeren met behulp van deze modellen.

Isolatie en karakterisering van patiënt-afgeleide pancreatic Ductal adenocarcinoom Organoid modellen

Het huidige protocol beschrijft een verbeterde methode om de co-expressie van PDX1- en NKX6.1-transcriptiefactoren in pancreasvoorlopercellen afgeleid van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) in planaire monolagen te verhogen. Dit wordt bereikt door de verse matrix aan te vullen, de celdichtheid te manipuleren en de endodermale cellen te dissociëren.

Differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in pancreas bètacelvoorlopers in een 2D-kweeksysteem

Dit artikel presenteert een protocol voor gerichte differentiatie en functionele analyse van β-celachtige cellen. We beschrijven optimale kweekomstandigheden en doorgangen voor menselijke pluripotente stamcellen voordat insulineproducerende pancreascellen worden gegenereerd. De differentiatie in zes fasen vordert van definitieve endodermvorming naar functionele β-celachtige cellen die insuline afscheiden als reactie op glucose.

Geoptimaliseerd protocol voor het genereren van functionele insuline-afscheidende cellen van de alvleesklier uit menselijke pluripotente stamcellen

Wij bieden een minimaal invasief protocol voor de intramusculaire transplantatie van pancreasstamceleilandjes afkomstig van menselijke stamklieren in immunodeficiënte muizen voor in vivo implantatie en downstream analyse.

Intramusculaire transplantatie van menselijke pluripotente stamcel-afgeleide alvleesklierendocriene cellen bij muizen

Leer hoe je ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier herprogrammeert naar pluripotente stamcellen met behulp van lentivirale transductie. Dit protocol helpt onderzoekers bij het bestuderen van kankerprogressie en heterogeniteit.

Herprogrammering van ductaal adenocarcinoom van de alvleesklier naar pluripotentie

Meer video's verkennen