Geoptimaliseerde kernisolatie van verse en diepgevroren solide tumormonsters voor multioomsequencing
13 oktober 2023
Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.
Naarmate onze kennis van tumorbiologie groeit en onze interesse om de fijne kneepjes te begrijpen van hoe cellen in de tumor interageren en de resultaten van de patiënt beïnvloeden, is ook het belang van het analyseren van heterogene cellen in de micro-omgeving van de tumor toegenomen. Multioomsequencing, die het mogelijk maakt om op een gepaarde celmanier RNA van één cel en aanvalssequencing van dezelfde cel te verwerven, biedt een belangrijke vooruitgang in de richting van dit doel. De kwaliteit van de gegevens die uit deze experimenten worden verkregen, is echter sterk afhankelijk van de kwaliteit van de experimentele omstandigheden en het ingevoerde biologische materiaal.
Dit protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform. Dit protocol is betrouwbaar bij gebruik van verse of diepgevroren eencellige suspensies. We geven aanbevelingen voor weefseldissociatiecondities, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.
In dit protocol gebruikten we menselijke ductaal adenocarcinoommonsters van de pancreas, die in ons laboratorium een primaire weefselfocus zijn. Alvleesklierkanker vertegenwoordigt een zeer desmoplastisch tumortype, dat zowel relatief kleverig weefsel als cellen voorspelt. Bovendien, aangezien pancreastumorspecimens die beschikbaar zijn voor onderzoek ook relatief klein zijn, worden inspanningen geleverd om de hoeveelheid gevangen cellen te maximaliseren.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een betrouwbare en geoptimaliseerde methode voor het isoleren van kernen uit vaste tumorspecimens voor multi-om sequencing met behulp van het 10x Genomics platform. Het bevat aanbevelingen voor weefseldissociatiecondities en cryoconservatie van enkele-cel suspensies.
Belangrijke Studie Componenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Oncologie
- Genomics
Achtergrond
- Begrip van tumorbiologie is cruciaal voor het verbeteren van patiëntresultaten.
- Analyseren van heterogene cellen in de tumor micro-omgeving is steeds belangrijker.
- Multi-om sequencing maakt gepaarde acquisitie van enkele-cel RNA en ATAC sequencing mogelijk.
- De kwaliteit van gegevens is sterk afhankelijk van experimentele condities en biologisch materiaal.
Doel van Studie
- Om een betrouwbaar protocol te bieden voor het isoleren van kernen uit vaste tumoren.
- Om de kwaliteit van multi-om sequencing gegevens te verbeteren.
- Om de analyse van tumor micro-omgevingen te vergemakkelijken.
Gebruikte Methoden
- Isoleren van kernen uit vaste tumorspecimens.
- Gebruik van verse of ingevroren enkele-cel suspensies.
- Aanbevelingen voor weefsel dissociatie condities.
- Cryoconservatie technieken voor enkele-cel suspensies.
Belangrijkste Resultaten
- Geoptimaliseerde aanpak voor kernen isolatie werd vastgesteld.
- Betrouwbare resultaten verkregen van zowel verse als ingevroren monsters.
- Verbeterde gegevenskwaliteit voor multi-om sequencing.
- Richtlijnen voor weefsel verwerking en cryoconservatie werden verstrekt.
Conclusies
- Het protocol verbetert de betrouwbaarheid van kernen isolatie uit tumoren.
- Het ondersteunt de vooruitgang van multi-om sequencing technieken.
- Toekomstige studies kunnen profiteren van verbeterde experimentele condities.
Veel Gestelde Vragen
Executive Industry Relevance
Optimized nuclei isolation from solid tumor specimens is critical for generating high-quality multiome sequencing data, directly impacting the reliability of tumor heterogeneity analyses in translational oncology. This protocol addresses the challenge of extracting intact nuclei from both fresh and frozen desmoplastic tumor tissues, supporting robust single-cell multiomic profiling. Reliable nuclei preparation at this stage enhances predictive confidence in downstream discovery and biomarker development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-fidelity interrogation of tumor cell heterogeneity at the single-cell level.
- Supports functional target validation by preserving diverse cell populations during isolation.
- Facilitates mechanistic de-risking through accurate representation of the tumor microenvironment.
Screening & Assay Development
- Provides standardized nuclei preparations for reproducible multiome sequencing assays.
- Ensures quantitative and qualitative consistency in input material for downstream workflows.
- Improves assay readiness by accommodating both fresh and cryopreserved tumor samples.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling paired RNA and chromatin accessibility profiling.
- Maintains disease relevance by capturing the complexity of solid tumor microenvironments.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by standardizing input quality.
Pipeline & Workflow Integration
This nuclei isolation protocol is positioned at the interface of tissue processing and multiomic data generation, bridging early discovery and translational research workflows.
- Discovery Biology: Maximizes hypothesis testing power by preserving cell diversity and integrity.
- Screening: Delivers reproducible, high-quality nuclei for scalable multiome sequencing assays.
- Analytics: Enables robust quantitative readouts for comparing tumor cell states and chromatin landscapes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by supporting paired single-cell RNA and ATAC-seq analyses.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, adaptable protocol for diverse solid tumor types and sample conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in tumor biology and target validation studies.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability across fresh and frozen tumor samples.
- Strategic Value: Reduces risk of data loss or artifact introduction at the sample preparation stage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement of oncology discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissociation and nuclei handling for optimal yield and quality.
- Demands access to specialized reagents, cell strainers, and quantitative assessment tools.
- Necessitates cross-team standardization of digestion and lysis conditions for reproducibility.
- Must be adapted for varying tumor types and sample sizes, especially for desmoplastic tissues.
- Careful monitoring of nuclear integrity is essential to avoid downstream sequencing artifacts.
