Vereenvoudigde intrafemorale injecties met levende muizen maken continue beenmerganalyse mogelijk

Deze techniek is bedoeld om ons te helpen de biologie van normale hematopoëse en ziekte in het beenmerg beter te begrijpen door waardevolle patiëntmonsters veilig intraoraal in de muizen te injecteren en te transplanteren, gevolgd door aspiratie van het beenmerg. Het is al lang bekend dat het efficiënter is om kleine hoeveelheden waardevolle monsters rechtstreeks in het beenmerg van muizen te transplanteren voor experimenten die worden uitgevoerd door middel van intraveneuze injectie. Er zijn echter geen echte technische video's, dus het werd over het algemeen beschouwd als een techniek met een hoge hindernis.

Ons protocol maakt het mogelijk om elk waardevol monster gemakkelijk en veilig in de muis te transplanteren met een klein aantal cellen. Er is veel vraag naar deze technologie en met behulp van deze video kan iedereen het snel leren. We hopen dat iedereen deze technologie onder de knie kan krijgen en een belangrijke bijdrage kan leveren aan de vooruitgang van de wetenschap.

Bereid om te beginnen celsuspensies voor met maximaal 3 miljoen monstercellen met behulp van 20 microliter FACS-buffer of dooimedium. Bewaar deze op ijs voor injectie. Desinfecteer het been met het te injecteren dijbeen met drie sets afwisselende scrubs met behulp van een povidonjodium- of chloorhexidinescrub en met 70% ethanol doordrenkte gaassponzen.

Stabiliseer het been door met duim en wijsvinger in het dijbeen te knijpen. Duw met de ring of de vijfde vinger op het scheenbeen om het scheenbeen gebogen te houden ten opzichte van het dijbeen. Zorg voor de juiste positionering voor een succesvolle injectie.

Gebruik de rand van een lege steriele 27G-naald om de patellapees bovenop het dijbeen te pikken. Om het beste inbrengpunt te garanderen, brengt u de 27G-naald met een bevestigde spuit net onder de patellapees in. Bevestig het stevig tussen de twee condylen van het dijbeen en draai de naald naar buiten en omhoog om het evenwijdig uit te lijnen met de schacht van het dijbeen.

Draai de naald in cirkels terwijl u deze in de beenmergholte brengt. Steek de naald in totdat er een merkbare vermindering van de weerstand is. Bevestig de juiste plaatsing van de naald door zijwaartse beweging.

Creëer onderdruk door de naaldzuiger naar achteren te trekken terwijl de naald in de beenmergholte beweegt. Controleer of er bloed of merg in de spuit zit om er zeker van te zijn dat de naald in de beenmergholte zit. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat de naald correct is geplaatst, verwijdert u deze langzaam en brengt u de celhoudende spuit door dezelfde wortel.

Het is belangrijk om de wortel en hoek van de eerste injectie te onthouden wanneer u overschakelt op een nieuwe naald. Zodra de cellen met succes in het dijbeen zijn geïnjecteerd, verwijdert u voorzichtig de naald en spuit en houdt u druk op de spuit. Haal vervolgens de muis uit de neuskegel en leg deze op een schone papieren handdoek om opzuigen van beddengoed te voorkomen.

Houd voor herstel de muis op een verwarmingskussen of een ander gecontroleerd oppervlak. Zorg voor herstel van de anesthesie voordat u ze terug op het muizenrek plaatst. Observeer muizen op tekenen van angst of infectie in de komende 24 uur.

Begin met de voorbereiding op de procedure voordat u het beenmerg opzuigt, maak een spuit van 27 G van 0.5 milliliter nat met CSM door CSM twee tot drie keer te vullen en te verdrijven. Zuig vervolgens voorzichtig het beenmerg van de verdoofde muis op, wat 20 tot 50 microliter beenmerg oplevert. Verwijder vervolgens de naald volledig uit het dijbeen en suspendeer het aangezogen monster in 500 microliter CSM.

Haal de muis uit de neuskegel en leg deze op een schone papieren handdoek om te voorkomen dat beddengoed tijdens het herstel wordt opgezogen. Controleer alle muizen om het herstel van de anesthesie te controleren voordat u ze op de achterkant van het muizenrek plaatst. Pelletcellen uit het beenmerg met een spin van vijf minuten bij 300G bij vier graden Celsius.

Zuig het bovenstaande op en voeg ACK-lysisbuffer toe aan elke buis. Draai de cellen om ze opnieuw te suspenderen en plaats ze 5 tot 10 minuten op ijs. Filtreer de celsuspensie door nylon gaas in een nieuwe buis.

Spoel de originele buis af met FACS-buffer en leid deze opnieuw door het nylon gaas, pelletcellen door vijf minuten te draaien op 300 G bij vier graden Celsius. Zuig het bovenstaande uit de gepelleteerde cellen en voeg de kleuringsoplossing met de gewenste antilichamen toe. Houd de tubes 20 minuten op ijs.

Was de cellen en ga verder met het analyseren ervan volgens de experimentele opstelling. Transplantatietechnieken kunnen eenvoudig worden geëvalueerd met minimale invasie van muizen met behulp van een bioluminescentiebeeld. Hier werd transplantatie van een van mensen afgeleide K562-cellijn met Acalook waargenomen in een xenotransplantaatmuismodel aan de zijkant van het geïnjecteerde dijbeen.

Transplantatie van CD34-positieve HSPC's resulteerde in meer dan 10 tot 20% van de implantatie van menselijke cellen acht weken na de transplantatie. Evenzo resulteerde het transplanteren van van navelstrengbloed afgeleide HSC's in tot 10% menselijke implantatie acht weken na de transplantatie. Met behulp van deze procedure werd verdere succesvolle transplantatie van volwassen beenmerg-afgeleide HSPC's, leukemie-stamcellen, CRISPR Cas9-bewerkte HSPC's uit navelstrengbloed en van de patiënt afgeleide AML-iPSC's bereikt.