Name: Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 36 s
Description: Leer darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing. Deze methode identificeert epitheliale, stromale, bloed-, spier-, immuuncellen en enterische neurale ganglia om gastro-intestinale ontwikkeling en ziekte te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd door de Vrienden van de Sophia Stichting (SSWO WAR-63).

Alle zebraviskweek en experimenten zijn uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen van het Erasmus MC en de wetgeving inzake dierenwelzijn. Het gebruik van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting valt onder de categorie experimenten waarvoor geen formele ethische goedkeuring vereist is, zoals uiteengezet in de Nederlandse regelgeving.
1. Het verkrijgen van 5 dagen na bevruchting (dpf) wildtype en tg (phox2bb: GFP) larven
<ol><li>Kweek van wildtype zebravissen en verzamel 50 eitjes in HEPES-gebufferd E3-medium (hierna E3 genoemd) in een petrischaaltje van 15 cm. Gebruik deze vissen als negatieve controle voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FAC's).</li>
	<li>Kweek van tg(phox2bb:GFP) zebravissen en verzamel ongeveer 300 eitjes in E3 in een petrischaaltje van 15 cm.</li>
	<li>Bewaar bevruchte eicellen in E3 (maximaal 50 eieren/schaaltje) in een licht/donkercyclus van 14 uur/10 uur, in een broedmachine bij 28,5 °C.</li>
	<li>Verwijder bij 1 dpf onbevruchte eieren en laat de bevruchte eieren zich ontwikkelen tot 5 dpf.</li>
	<li>Selecteer tg(phox2bb:GFP) larven bij 1 dpf.</li>
</ol>2. Dissociatie van hele larven van wildtype
<ol><li>Verdoof 5 dpf-larven met 0,016% tricaïne.</li>
	<li>Snijd 30 zebravissen in kleine stukjes met behulp van een scheermesje in een petrischaal met 1 ml 10x trypsine-EDTA-oplossing.</li>
	<li>Breng de gehakte zebravis over in een microcentrifugebuis met een totaal volume van 2 ml 10x trypsine-EDTA-oplossing en laat 3 uur op ijs staan. Pipeteer elk uur op en neer met een P1000-pipet om dissociatie te stimuleren.</li>
</ol>3. Isolatie van de darmen
<ol><li>Plaats 6-10 larven van 5 dpf, verdoofd met 0,016% tricaïne op een rij, op een 1,8% agaroseplaat (0,45 g agarose in 25 ml E3), onder een dissectiemicroscoop</li>
	<li>Zet een insectenspeld in de kop van de zebravis.</li>
	<li>Verwijder alle resterende E3 met behulp van een tissue.</li>
	<li>Isoleer de darm met behulp van een andere insectenpin, zonder andere organen te verstoren. Zorg ervoor dat de dooier is verwijderd (aanvullende afbeelding S1A).</li>
	<li>Eenmaal geïsoleerd, inspecteert u de darm en verwijdert u indien nodig al het niet-intestinale materiaal (bijv. huid, vet, lever).</li>
	<li>Verzamel de darm met een pincet en plaats deze in een microcentrifugebuis, met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met 10% foetaal kalfsserum (FCS), op ijs. OPMERKING: Er moeten minimaal 244 darmen worden geïsoleerd, waarbij de totale dissectietijd op 3 uur wordt gehouden. Dit is haalbaar met twee mensen die parallel werken.</li>
</ol>4. Darm dissociatie
<ol><li>Centrifugeer onmiddellijk na de dissectie van alle darmen de microcentrifugebuis op volle snelheid (13.800 × g) gedurende 30 s.</li>
	<li>Verwijder de PBS/10% FCS maar laat een kleine hoeveelheid (~100 μL) achter om uitdroging van de darmen te voorkomen. Voeg 500 μL 2,17 mg/ml papaïne toe aan HBSS met CaCl2 en MgCl2 om de cellen te dissociëren.</li>
	<li>Activeer papaïne met 2,5 μL cysteïne (1 M).</li>
	<li>Incubeer de ingewanden in een waterbad van 37 °C gedurende 10 min. Pipetteer halverwege (na 5 min) op en neer om de vertering van enzymatisch weefsel te stimuleren.</li>
	<li>Breng cellen over in een FACS-buis met behulp van een celzeef van 35 μm, vooraf bevochtigd met 0,5 ml PBS/10% FCS.</li>
	<li>Was de zeef door in totaal 2 ml PBS/10% FCS toe te voegen in stappen van 0.5 ml.</li>
	<li>Centrifugeer bij 700 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder het supernatans en resuspendeer de pellet in 300 μL PBS/10% FCS.</li>
	<li>Voeg 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe om dode cellen te labelen (1:1,000) en incubeer gedurende 5 minuten om hun uitsluiting tijdens FACS mogelijk te maken.</li>
</ol>5. FACS-verrijking
<ol><li>Gebruik het wildtypemonster om de poorten van de gesorteerde celpopulatie in te stellen door 3.000 cellen op de flowcytometer te registreren (aanvullende figuur S1B-E).</li>
	<li>Gebruik een mondstuk van 100 μm, stel de sorteerprecisie in op zuiverheid en plaats de opvangbuis met 200 μL PBS/5% FCS in de FACS-machine.</li>
	<li>Laad de celsuspensie van de ingewanden en sorteer levende (DAPI-negatieve), enkele cellen in de verzamelbuis (Figuur 2C), door doubletten (Figuur 2B) en dode cellen (Figuur 2C) uit te sluiten. OPMERKING: Voor de tg(phox2bb) zebravis wordt het aandeel GFP+- cellen alleen ter referentie gecontroleerd, aangezien alle afzonderlijke levende cellen worden gesorteerd.</li>
	<li>Bewaar de opvangbuis op ijs na het sorteren van de cellen.</li>
	<li>Tel de celsuspensie met een hemocytometer, inclusief een levensvatbaarheidscontrole met trypanblauw. Als de levensvatbaarheid minimaal 80% is, ga dan verder met de volgende stap.</li>
	<li>Cellen zijn nu klaar om te verwerken voor scRNAseq (d.w.z. 10x Genomics Chromium-platform). Gebruik ongeveer 20.000 cellen per monster.</li>
</ol>

Verwerking van darmcellen van zebravislarven voor single-cell RNA-sequencing

<ol><li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system%2C+immune+system%2C+and+epithelium+eesponses%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li>
<li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitrin%2C+M+%22The+Gastrointestinal+System%22">The Gastrointestinal System</a>. , (2014).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system%3A+peripheral+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Autonomic+Neuroscience%3A+Basic+and+Clinical%22%5BJournal%5D)">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li>
<li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li>
<li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li>
<li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li>
<li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li>
<li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+neuromyopathies%3A+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849(2022).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+human+disease%3A+zebrafish+swim+into+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li>
<li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li>
<li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg%28-8.3bphox2b%3AKaede%29+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li>
<li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073(2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li>
<li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070(2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290(2022).</li>
<li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li>
<li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311(2022).</li>
<li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKline%2C+M+%22Fishing+for+answers%3A+Isolating+enteric+neurons+and+identifying+putative+ENS+mutants%22">Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants</a>. , Iowa State University. https://doi.org/10.31274/etd-180810-5368 (2016).</li>
<li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li>
<li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Hier presenteren we een methode voor isolatie en dissociatie van de darm van 5 dpf zebravislarven met behulp van FACS. Met deze methode werden verschillende darmceltypen met succes verzameld en geanalyseerd door scRNA-seq, met behulp van het 10x Genomics Chromium-platform. We selecteerden de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, omdat we een indicatie wilden dat levensvatbare ENS-cellen ook geïsoleerd zouden worden (Figuur 2D). Het is echter belangrijk op te merken dat deze methode gemakkel...

Het maagdarmkanaal (GI) is een complex systeem dat een vitale rol speelt in de algehele gezondheid en het welzijn. Het is verantwoordelijk voor de vertering en opname van voedingsstoffen, evenals de eliminatie van afvalproducten 1,2. Het maagdarmkanaal bestaat uit meerdere celtypen, waaronder epitheelcellen, gladde spiercellen, immuuncellen en het enterische zenuwstelsel (ENS), die nauw met elkaar communiceren om een goede darmfunctie te reguleren en te behouden 3,4,5. Defecten in de ontwikkeling van het maagdarmkanaal kunnen verstrekkende gevolgen hebben voor verschillende aspecten, zoals de opname van voedingsstoffen, de samenstelling van de microbiota, de darm-hersenas en het ENS, wat leidt tot verschillende enterische neuromusculaire aandoeningen, zoals de ziekte van Hirschsprung en chronische intestinale pseudo-obstructie 6,7. Deze aandoeningen worden gekenmerkt door ernstige darmdysmotiliteit veroorzaakt door veranderingen in verschillende sleutelcellen, zoals de interstitiële cellen van Cajal, gladde spiercellen en de ENS 6,8,9. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal worden echter nog steeds slecht begrepen.
De zebravis is een waardevol modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal vanwege de snelle embryonale ontwikkeling, transparantie tijdens embryonale en larvale stadia en genetische traceerbaarheid 10,11,12,13,14. Er zijn talrijke transgene zebravislijnen beschikbaar die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Een voorbeeld van zo'n lijn is de tg(phox2bb:GFP) zebravis, die vaak wordt gebruikt om het ENS te bestuderen, aangezien alle phox2bb+-cellen, inclusief enterische neuronen, het label15,16 hebben. Hier presenteren we, met behulp van de tg(phox2bb:GFP) zebravislijn, een methode voor darmisolatie van 5 dagen na bevruchting (dpf) larven voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse (Figuur 1).

<table><tbody><tr><td>10x Trypsin (0,5%)-EDTA (0,2%)</td><td>Sigma</td><td>59418C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL buis met ronde bodem en cel-strainer dop</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>BD Falcon Ronde-bodem buis 5 mL (FACS buizen) klikkap</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Cell Ranger v3.0.2</td><td>10X Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#D-9542</td><td></td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus SZX16</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III sorteerapparaat</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS met CaCl2 en MgCl2</td><td>Gibco</td><td>14025050</td><td></td></tr><tr><td>Insectenpinnen</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>MS-222, Tricaine</td><td>Supelco</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Sigma</td><td>P4762</td><td></td></tr><tr><td>Seurat v3</td><td>Stuart et&nbsp;al. (2019)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blauw&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>Cat#T8154</td><td></td></tr></tbody></table>

darmisolatie van zebravislarven voor eencellige rna-sequencing

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

Het maagdarmkanaal (GI) vervult een reeks functies die essentieel zijn voor het leven. Aangeboren afwijkingen die de ontwikkeling beïnvloeden, kunnen leiden tot enterische neuromusculaire aandoeningen, wat het belang benadrukt om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en disfunctie van het maagdarmkanaal. In deze studie presenteren we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting om levende, levensvatbare cellen te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analyse. Dit protocol is gebaseerd op de manuele dissectie van de darm van de zebravis, gevolgd door enzymatische dissociatie met papaïne. Vervolgens worden cellen onderworpen aan fluorescentie-geactiveerde celsortering en worden levensvatbare cellen verzameld voor scRNA-seq. Met deze methode waren we in staat om met succes verschillende darmceltypen te identificeren, waaronder epitheel-, stromale, bloed-, spier- en immuuncellen, evenals enterische neuronen en glia. Daarom beschouwen we het als een waardevolle bron voor het bestuderen van de samenstelling van het maagdarmkanaal in gezondheid en ziekte, met behulp van de zebravis.

Met dit protocol bereikten we succesvolle isolatie en dissociatie van hele darmen van 5 dpf-larven. Door papaïne als dissociatie-enzym te gebruiken, hebben we de levensvatbaarheid van de cellen aanzienlijk verbeterd, waardoor 46.139 gebeurtenissen met enkele, levensvatbare cellen (6,4% van alle cellen) uit 244 geïsoleerde darmen konden worden vastgelegd (Figuur 2A). Wildtype hele larven werden gebruikt als controle om ervoor te zorgen dat het sorteerproces werd geoptimaliseerd, waardoor effe...

Hier beschrijven we een methode voor darmisolatie van zebravislarven 5 dagen na de bevruchting, voor single-cell RNA sequencing analyse.

Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

Ons onderzoek richt zich op het onderzoeken van de transcriptomische veranderingen die optreden tijdens de gastro-intestinale ontwikkeling en disfunctie in zebravislarven. Hier bieden we een nieuw protocol dat isolatie van verschillende celtypen in de darm van de zebravis mogelijk maakt, wat potentiële toepassingen heeft bij het begrijpen van gastro-intestinale gezondheid en ziekte. De laatste jaren is er een groeiende belangstelling voor het onderzoeken van de interactie tussen het enterische zenuwstelsel en andere darmceltypen tijdens ontwikkeling en ziekte.Het begrijpen van deze complexe dynamiek met behulp van geavanceerde technieken zoals single-cell RNA-sequencing, heeft het potentieel om kritische inzichten in enterische neuromyopathieën te onthullen, wat leidt tot nauwkeurigere diagnostiek en behandelingen. Met behulp van dit protocol hebben we met succes verschillende soorten darmcellen geïdentificeerd, waaronder epitheel-, stromale, bloed-, spier-, immuuncellen en zelfs enterische neuronen en glia, die nog niet eerder in deze hoeveelheid zijn vastgelegd met behulp van vergelijkbare benaderingen. Zo bieden we een betrouwbare techniek om de gastro-intestinale samenstelling tijdens ontwikkeling en disfunctie te bestuderen.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

De isolatie van hoge kwaliteit, intact RNA is een essentiële stap in veel laboratoria protocollen. Hier laten we zien RNA-extractie uit hele zebravis embryo's en cDNA synthese voor verdere toepassing in de verschillende experimentele procedures, zoals het gen expressie microarray analyse.

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

This video describes a protocol to isolate neurons, macrophages, and microglia from larval zebrafish brains by mechanically disrupting the brain tissue. The purified cell populations can further be used for genomic analysis.

Brain Cell Isolation from Zebrafish Larvae: A Technique to Obtain Intact Neurons, Macrophages, and Microglia from Zebrafish Brain Tissue

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol voor het isoleren gonadale weefsel van larvale zebravis, die onderzoeken zebravis geslachtsdifferentiatie en het onderhoud vergemakkelijkt.

Dissectie van larvale zebravis Gonadale Tissue

Hier beschrijven we een techniek om de zijkant populatie cellen te isoleren uit een zebravis model van myc-geïnduceerde T-cel acute lymfoblastische leukemie (T-ALL). Deze side population test is zeer gevoelig en beschreven voor zebravis T-ALL, maar kan toepasbaar zijn op andere maligne en niet-maligne types zebravis cel.

Isolatie van de side population in Myc-geïnduceerde T-cel acute lymfatische leukemie in zebravis

Dit protocol biedt een aanpak voor de hele transcriptome analyse van zebravis embryo's, larven, of cellen gesorteerd. Wij omvatten isolatie van RNA, pad analyse van RNASeq gegevens en qRT-PCR-gebaseerde validatie van gen expressie veranderingen.

Bereiding van de monsters en de analyse van de RNASeq gebaseerde gen expressie gegevens uit de zebravis

We presenteren een protocol om te isoleren van neuronen, macrofagen en microglia van larvale zebrafish hersenen onder fysiologische en pathologische omstandigheden. Op isolatie, wordt RNA gewonnen uit deze cellen te analyseren hun genexpressie profiel. Dit protocol voorziet voor de verzameling van kwalitatief hoogwaardige RNA downstream analyse zoals qPCR en transcriptomics uitvoeren.

Isolatie en RNA extractie van neuronen, macrofagen en Microglia van larvale Zebrafish hersenen

We beschrijven een techniek voor het profileren van microRNAs in vroege muisembryo's. Dit protocol overwint de uitdaging van lage celinput en kleine RNA-verrijking. Deze test kan worden gebruikt om veranderingen in miRNA expressie na verloop van tijd te analyseren in verschillende celvormen van het vroege muisembryo.

Voorbereiding van kleine RNA-bibliotheken voor sequencing van vroege muisembryo's

Enkele kernisolatie is afhankelijk van dissociatie en detergent-gebaseerde permeabilisatie van het celmembraan, stappen die optimalisatie nodig hebben en gevoelig zijn voor de invoering van technische artefacten. We demonstreren een wasmiddel- en enzymvrij protocol voor snelle isolatie van intacte kernen rechtstreeks uit hele weefsel, wat kernen oplevert die geschikt zijn voor single-nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) of ATAC-seq.

Nuclei isolatie van hele weefsel met behulp van een wasmiddel en enzym-vrije methode

Hier presenteren we een methode voor het uitlijnen en cryosectieren van meerdere zebravislarvenmonsters (Danio rerio) en het verzamelen ervan op een enkel glaasje voor ruimtelijke transcriptomische analyse.

Ruimtelijk compacte opstelling van larvale zebravissecties voor ruimtelijke transcriptomische analyse

Leer darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing. Deze methode identificeert epitheliale, stromale, bloed-, spier-, immuuncellen en enterische neurale ganglia om gastro-intestinale ontwikkeling en ziekte te bestuderen.

Darmisolatie van zebravislarven voor eencellige RNA-sequencing

Meer video's verkennen