High-Throughput expressie en zuivering van menselijke opgeloste stoffen voor structurele en biochemische studies
29 september 2023
Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.
Opgeloste stoffen, of SLC's, zijn verantwoordelijk voor de opname van voedingsstoffen en zijn betrokken bij ziekten bij de mens. Er zijn echter maar weinig medicijnen die gericht zijn op SLC's omdat ze slecht bestudeerd zijn. We hebben efficiënte benaderingen ontwikkeld om SLC's te klonen, tot expressie te brengen en te zuiveren.
Onze workflow levert pure eiwitten op, waardoor biochemische en structurele studies mogelijk zijn, en levert uiteindelijk inzichten op voor campagnes voor het ontdekken van geneesmiddelen. Met de vele rollen in biologische processen, ziekte en medicijnafgifte, hebben SLC's steeds meer aandacht gekregen en zijn ze aantrekkelijke therapeutische doelwitten geworden. De private, publieke ReSOLUTE IMI-projecten genereerden open access bronnen en gegevens om nieuwe ontdekkingen op het gebied van SLC-functie, fysiologie, pathologie en therapeutische targeting mogelijk te maken.
Van oudsher waren SLC's een uitdaging om te bestuderen, omdat het integrale membraaneiwitten zijn met verschillende substraten en diverse transportmechanismen. Onlangs hebben Cryo-EM, het BacMam-expressiesysteem en nieuwe solubilisatiereagentia geleid tot een stapsgewijze verandering in hun karakterisering. Zuivere eiwitmonsters zijn nodig voor biochemische en structurele studies.
Bij mensen hebben opgeloste stoffen dragers vaak een slechte opbrengst wanneer ze te veel tot expressie worden gebracht en onstabiel wanneer ze worden gezuiverd. Daarom had elk doelwit in het verleden jaren nodig om individuele structuren te ontwikkelen om het eiwitmonster te produceren voor stroomafwaartse toepassingen. Onze methode is geoptimaliseerd voor het parallel en kostenefficiënt bestuderen van meerdere doelen of constructies van een enkel doelwit.
Daarom wordt de experimentele flexibiliteit, kosten, tijd en laboratoriummiddelen zorgvuldig afgewogen. Bovendien bieden we open toegang tot al onze protocollen en bronnen in dit artikel en in het ReSOLUTE-webportaal.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op solute carriers (SLC's), die cruciaal zijn voor de opname van voedingsstoffen en gekoppeld zijn aan diverse menselijke ziekten. De onderzoekers ontwikkelden efficiënte methoden voor het kloneren, tot expressie brengen en zuiveren van SLC's, wat verdere biochemische en structurele studies mogelijk maakt.
Belangrijkste Componenten van de Studie
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Biochemie
- Farmacologie
Achtergrond
- Solute carriers spelen een essentiële rol bij het transport van voedingsstoffen.
- Ze zijn betrokken bij diverse menselijke ziekten.
- Ondanks hun belang zijn er weinig geneesmiddelen die zich op SLC's richten vanwege beperkt onderzoek.
- Recente initiatieven waren erop gericht het begrip van de functies van SLC's te verbeteren.
Doel van de studie
- Om schaalbare methoden te ontwikkelen voor de studie naar menselijke SLC's.
- Om zuivere eiwitten te produceren voor biochemische en structurele analyse.
- Om inspanningen voor geneesmiddelenonderzoek gericht op SLC's te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Klonering van codon-geoptimaliseerde genen voor SLC's.
- Expressie van SLC-eiwitten in geschikte systemen.
- Zuivering van eiwitten om homogene monsters te verkrijgen.
- Gebruik van open bronnen uit IMI-projecten voor datatoegang.
Belangrijkste resultaten
- Er zijn efficiënte klonerings- en expressiemethoden vastgesteld.
- Hoogzuivere SLC-eiwitten zijn verkregen voor verdere studies.
- De studie biedt inzicht in SLC-functies en het therapeutische potentieel.
- De gegenereerde gegevens ondersteunen lopend onderzoek naar de SLC-fysiologie en -pathologie.
Conclusies
- De ontwikkelde methoden verbeteren de studie naar SLC's aanzienlijk.
- De verkregen inzichten kunnen leiden tot nieuwe strategieën voor geneesmiddelenontwikkeling.
- Een beter begrip van SLC's kan de therapeutische targeting verbeteren.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Menselijke solute carriers (SLC's) vormen een grote, onderbenutte klasse membraantransporters met aanzienlijk therapeutisch potentieel, maar hun structurele en biochemische karakterisering is achtergebleven door uitdagingen bij expressie en zuivering. Deze high-throughput workflow maakt parallelle, schaalbare productie van pure, functioneel actieve SLC-eiwitten mogelijk, waarmee een belangrijk knelpunt in vroege geneesmiddelenontdekking en targetvalidatie direct wordt aangepakt. Door de toegang tot hoogwaardige SLC-monsters te vergemakkelijken, ondersteunt deze methode het risicobeheer op portefeuilleniveau en versnelt het de evaluatie van deze targets voor farmaceutische interventie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt systematische analyse van de functie en substraatspecificiteit van SLC-transporters mogelijk.
- Ondersteunt mechanische risicoreductie door structureel intacte, biochemisch actieve eiwitten te leveren voor hypothese-testen.
- Faciliteert target-validatie door reproduceerbare productie van meerdere SLC-constructen in parallel.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert SLC-eiwitten van hoge zuiverheid die geschikt zijn voor kwantitatieve biochemische en transportassays.
- Standaardiseert de eiwitinput voor downstream high-throughput screening en engagement-studies.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van assays door een consistente eiwitkwaliteit en opbrengst te garanderen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Maakt structurele studies mogelijk die inzicht geven in ziektespecifieke transportmechanismen en druggability.
- Levert stabiele eiwitpreparaten voor bindingstudies van kleine moleculen en transportstudies die zijn afgestemd op de ontwikkeling van translationele biomarkers.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door het genereren van gegevens over eiwitstabiliteit en -activiteit.
Integratie van pipeline en workflow
Deze workflow integreert op het grensvlak van vroege ontdekking en lead-identificatie, en biedt fundamentele reagentia voor zowel mechanistische studies als screeningscampagnes.
- Ontdekkingsbiologie: Levert hoogwaardige SLC-eiwitten voor hypothese-gestuurde functionele en structurele analyse.
- Screening: Maakt robuuste assay-ontwikkeling en compound-screening mogelijk met reproduceerbare eiwitinputs.
- Analytica: Levert kwantitatieve output zoals eiwitconcentratie, zuiverheid en monodispersiteit voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de identificatie van ziekte-relevante SLC's en hun farmacologische modulatie.
- Bedrijfsvoorziening voor hergebruik: Vestigt een schaalbaar, herbruikbaar platform voor de evaluatie van SLC-targets in meerdere programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij de selectie van SLC-doelen en vermindert mechanistische ambiguïteit.
- Operationele waarde: Stroomlijnt de eiwitproductie met gestandaardiseerde high-throughput-protocollen.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen en verbetert de kapitaalallocatie door eerdere triage van doelen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt de risico-gecorrigeerde prioritering van SLC-doelen voor verdere ontwikkeling in screenings- en preklinische pijplijnen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de expressie, zuivering en analytische karakterisering van membraaneiwitten.
- Vereist toegang tot eukaryote expressiesystemen, chromatografie-infrastructuur en eiwitanalyses.
- Profiteert van gestandaardiseerde protocollen en open-access bronnen voor reproduceerbaarheid tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse SLC-familieleden en constructontwerpen, wat een brede toepasbaarheid ondersteunt.
- Eiwitstabiliteit en opbrengst kunnen variëren per doelwit, waardoor optimalisatie van het construct en de buffer noodzakelijk is.
