Name: T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Leer hoe T4-bacteriofaag en E. coli interacties in de muizendarm worden bestudeerd met een gnotobiotisch model. Deze methode onthult inzichten over gastheer-bacteriofaagdynamiek en darmgezondheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen dat het land waarop ze dit onderzoek hebben uitgevoerd het traditionele, voorouderlijke en niet-afgestane grondgebied is van de xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation. Het land waarop het zich bevindt, is altijd een leerplaats geweest voor het Musqueam-volk, dat al millennia lang hun cultuur, geschiedenis en tradities van de ene generatie op de andere op deze site heeft doorgegeven. We moedigen anderen aan om meer te weten te komen over de geboortelanden waarin ze wonen en werken in https://native-land.ca. De auteurs erkennen de steun van de Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, naar MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 naar CT, RGPIN-2016-04282 naar LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, naar C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, naar C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 naar LCO) en de Canadian Foundation for Innovation (34673 naar LCO en 38277 naar CT). We zijn dankbaar voor de technische ondersteuning van het UBC Centre for Disease Modelling en ubcFLOW, dat wordt ondersteund door het UBC GREx Biological Resilience Initiative, en van leden van de Osborne- en Trolini-laboratoria voor kritische discussies en evaluatie van het manuscript. Figuur 1A en Figuur 2A zijn gemaakt met behulp van Biorender.com.

Onderzoek naar de dynamiek van darmfagen en bacteriën in muizenmodellen met behulp van T4-faag

De auteurs hebben niets te onthullen.

Bacteriofagen, of fagen, zijn virussen die bacteriën infecteren en doden met soort- en stamspecificiteit1. Fagen spelen een belangrijke rol binnen complexe bacteriële gemeenschappen zoals de darmmicrobiota, waar ze betrokken zijn bij het reguleren van de populatiedynamiek en het stimuleren van bacteriële fitheid. Gedurende het afgelopen decennium is er hernieuwde belangstelling geweest voor faagonderzoek als gevolg van de opkomst van antimicrobieel resistente pathogenen3 en het potentieel voor faagtherapie als alternatieve behandelingsstrategie. In de afgelopen jaren zijn lytische faagcocktails met enig succes intraveneus gebruikt bij ernstige, antibioticaresistente bacteriële septische infecties bij mensen 3,4. Orale faagtherapie is ook voorgesteld als een mogelijk alternatief voor antibiotica om darminfecties en ontstekingen te behandelen. Bovendien zijn fagen betrokken bij het succes van fecale filtraattransplantaties (FFT), dit zijn fecale microbiotapreparaten die zijn gefilterd om bacteriën te verwijderen, bij de behandeling van recidiverende Clostridioides difficile-infectie (rCDI)5,6, inflammatoire darmaandoeningen (IBD)7,8 en necrotiserende enterocolitis bij te vroeg geboren varkens9. Gezien deze resultaten is het belangrijk om rekening te houden met interacties tussen zowel fagen en de darmmicrobiota, als fagen en de gastheer van zoogdieren, aangezien de toevoeging van nieuwe fagen aan een reeds bestaande gemeenschap indirecte effecten kan hebben op de gemeenschap als geheel, en niet alleen op de doelbacteriën2,10.
De studie van faaginteracties met hun doelbacteriën in vitro is nuttig gebleken voor het begrijpen van de mechanismen en effecten van faag- en bacterie-interacties in de darm. In deze setting is aangetoond dat Escherichia coli-specifieke T4-fagen van de orde Caudovirales immunoglobuline (Ig)-achtige domeinen nodig hebben die zich bevinden in zeer antigene buitenste capside (Hoc)-eiwitten op het virionoppervlak om zich te hechten aan darmslijm11. Bovendien hebben transwell-tests aangetoond dat T4-fagen in staat zijn om te interageren met epitheelcelculturen en door cellagen te transloceren door macropinocytose12,13. Deze resultaten ondersteunen de hypothese dat fagen kunnen interageren met hun metazoaire gastheer, ook al zijn ze niet in staat om eukaryote cellen te infecteren. Deze modellen, hoewel nuttig, missen het volledige scala aan complexe interacties die plaatsvinden in een darmecosysteem die nodig zijn voor een uitgebreide verkenning van de tripartiete interactie tussen fagen, bacteriën en de metazoaire gastheer.
Muismodellen zijn een belangrijk hulpmiddel voor het onderzoeken van fagen binnen complexe omgevingen. Een wenselijke toepassing van faagtoediening is als een alternatieve strategie voor de behandeling van antimicrobieel resistente infecties of pathobionten geassocieerd met chronische ontstekingsziekten, waaronder IBD. Opkomende literatuur suggereert echter dat faaggedrag in vitro niet volledig representatief is voor in vivo functies. Buttimer et al.14 toonden aan dat een faagcocktail in staat was om de beoogde bacteriën in vitro uit te putten in een vereenvoudigd consortium voor menselijke microbiota, maar niet in vivo kon worden gerepliceerd in gnotobiotische muizen die waren gekoloniseerd met hetzelfde bacterie-faagconsortium. Bovendien leidde de T7-faag in een conventioneel microbioom van muizen tot selectieve uitputting van de beoogde darmbacteriën, hoewel geleidelijk herstel in de loop van de tijd werd waargenomen, wat wijst op geëvolueerde resistentie15. Andere studies hebben het naast elkaar bestaan aangetoond van oraal toegediende fagen en hun doelbacteriestammen in vivo 2,16. Naast het naast elkaar bestaan van fagen en bacteriën, leidde de toediening van fagen inderdaad tot wijdverbreide veranderingen in de algehele samenstelling en functie van de microbiotagemeenschap 2,16. Dit is relevant in ziekteomgevingen, aangezien verschillende onderzoeken associaties hebben gevonden tussen een verhoogde relatieve abundantie van Caudovirales en IBD 7,8,17 die onafhankelijk waren van veranderingen in bacteriële abundantie7. Het blijft onbekend of dit een aanjager of gevolg is van de pathogenese van de ziekte.
De historische focus van faagonderzoek lag op de relatie tussen een faag en zijn doelbacterie. Het is echter ook belangrijk om rekening te houden met mogelijke interacties tussen faag en het slijmvlies, het epitheel en het immuunsysteem van de metazoaire gastheer. Deze interacties spelen allemaal een belangrijke rol in de algehele respons op een darmfaaginfectie. Om dit aan te tonen, zijn fagen bestudeerd met behulp van kiemvrije (GF) muizen om hun impact op het immuunsysteem op te helderen zonder interferentie door de microbiota8. In dit systeem werden faagnucleïnezuren gedetecteerd door Toll-like receptoren (TLR's) die zich in endosomen van fagocytische immuuncellen (macrofagen en dendritische cellen) bevinden. Dit activeerde stroomafwaartse signalering en stimuleerde T-celafhankelijke productie van interferon (IFN)-γ8 of type I IFN's18. Bovendien impliceerden Flückiger et al.19 geheugen CD8+ T-cellen bij de herkenning van faag-gecodeerde (profag) antigenen, wat resulteerde in kruisreactiviteit van T-cellen met tumorantigenen, wat resulteerde in verminderde tumorbelasting. Ten slotte is de productie van faagspecifieke antilichamen gedocumenteerd in muizenstudies waarbij fagen op een continue manier aan diermodellen werden toegediend via drinkwater 8,20, of door herhaalde orale maagsonde gedurende meerdere maanden20, wat het vermogen van faageiwitten aantoont om humorale immuunresponsen te bevorderen. Hoewel deze manieren van faaginoculatie een optimale en voortdurende priming van het immuunsysteem mogelijk maken, vertegenwoordigen ze mogelijk niet de natuurlijk voorkomende interacties tussen fagen en het darmmilieu, noch de kinetiek van oraal toegediende faagtherapie. Tot nu toe heeft een beperkt aantal studies de interacties van fagen met een enkele bacteriesoort onderzocht in monocolonized muismodellen21. Muizen met monokolonisatie bleken echter van cruciaal belang bij het ontcijferen van microbe-specifieke effecten van individuele soorten op het maagdarmkanaal (GI) en de ontwikkeling van het immuunsysteem22,23,24, en ze kunnen nog nuttig blijken te zijn bij het begrijpen van tripartiete interacties tussen fagen, hun doelbacteriën en de metazoaire gastheer.
Opwindend is dat er nog veel te leren valt over de interacties tussen darmfaag en darmcommensale bacteriën, evenals de interacties die optreden tussen de metazoaire gastheer en de fagen die erin verblijven. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-faag en zijn bacteriële tegenhanger, E. coli (K-12, BW25113), te bestuderen met behulp van een gnotobiotisch muismodel. Deze gestandaardiseerde procedures bieden ook een basis voor het optimaliseren van andere faag/bacterie-dyades door de groeiparameters aan te passen aan de paren van belang. De hier beschreven methoden beschrijven: (1) Bereiding van T4-faag en vehiculumlysaten voor orale sonde van muizen; (2) Orale toediening van T4-faag aan gnotobiotische muizen met E. coli monokolonisatie; (3) Monitoring van T4-faagniveaus in uitwerpselen en weefsels van muizen in de loop van de tijd.
Voor de representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd, werden gezuiverde T4-faaglysaten vermeerderd uit faagbankvoorraden die worden bijgehouden door het Rohwer Lab. De faag-op-tap-methode voor de vermeerdering van T4-fagen is aangepast25, zoals vermeld in dit protocol. De methode levert binnen drie dagen endotoxine-lage faagvoorraden met een hoge titer op. Met behulp van deze aanpak werden routinematig 10 ml ≥ 1010 plaquevormende eenheden (pfu)/ml T4-faag met < 0,5 endotoxine-eenheden (EU)/ml verzameld. De aanbevolen endotoxineniveaus voor orale of intraveneuze toediening aan muizen zijn respectievelijk ≤ 20 EU/ml en ≤ 5 EU/kg/u (of 0,1 EU toegediend gedurende 1 uur voor een muis van 20 g), waardoor dit een geschikte methode is voor de bereiding van fagen voor in-vivo-inoculatie . Alle faagvoorraden werden bij 4 °C opgeslagen in een faagbuffer van zout magnesium (SM) (recept in stap 1.1.5.1). E. coli werd gekweekt in LB-media. Voor verschillende faag-bacterieparen kunnen diverse kweekmedia en groeiomstandigheden worden aangepast aan dit protocol. Fagen kunnen ook afkomstig zijn uit de omgeving, zoals afvalwater, zeewater, bodem en darminhoud en kunnen worden geïsoleerd en gezuiverd volgens Sambrook en Russell26 voorafgaand aan de bereiding met behulp van de juiste groei- en voortplantingsomstandigheden voor elk faag-gastheerpaar van belang25. Als alternatief kunnen fagen worden verkregen uit commerciële bronnen (zie Materiaaltabel) of uit faagbanken.

<table><tbody><tr><td>1-octanol (99%)</td><td>Thermofisher</td><td>CAAAA15977-AP</td><td></td></tr><tr><td>50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units</td><td>Millipore Sigma&nbsp;</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP160-500</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&reg; 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>BD Microtainer&reg; Tubes, SST</td><td>BD Medical</td><td>365967</td><td></td></tr><tr><td>Bioexclusion airtight cages (ISO cages)&nbsp;</td><td>Techiplast</td><td>1245ISOCAGE</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch&trade; Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module</td><td>BioRad</td><td>1851196</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP510-500</td><td></td></tr><tr><td>Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk</td><td>Andwin Scientific&nbsp;</td><td>16812612</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)</td><td>Fisher</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>Copper coated steel beads (4.5 mm)</td><td>Crosman Corporation</td><td>0767</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood &amp; Tissue Kit (50)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade; Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents&trade;&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagents&trade; Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox&nbsp;</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>Green FastMix&reg; qPCR mix, 1250 rxns</td><td>QuantaBio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED</td><td>Techiplast</td><td>UISOHEPAXTBOX-300</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Incubated Shaker</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>8354-30-0009</td><td></td></tr><tr><td>Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml</td><td>Fisher</td><td>14-666-315</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm sealing film</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Phage stocks</td><td>Carolina Biological Supply&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>PicoLab&reg; Mouse Diet 20 EXT</td><td>LabDiet</td><td>5R58</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&trade; Chromogenic Endotoxin Quant Kit</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>A39552S</td><td></td></tr><tr><td>RNase A (17,500 U)</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase Set</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)</td><td>Fisher scentific&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Sterile flexible film isolator&nbsp;</td><td>Class Biologically Clean&nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&trade; Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II&nbsp;</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>AAJ22638AE</td><td></td></tr><tr><td>Water, (DNASE, RNASE free)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP2484100</td><td></td></tr></tbody></table>

t4 bacteriofaag en e. coli interactie in de muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo

Bacteriofagen (fagen) zijn virussen die bacteriën infecteren met soort- en stamspecificiteit en zijn de meest voorkomende biologische entiteiten in alle bekende ecosystemen. Binnen bacteriële gemeenschappen, zoals die in de darmmicrobiota, zijn fagen betrokken bij het reguleren van de populatiedynamiek van de microbiota en het stimuleren van bacteriële evolutie. Er is de afgelopen tien jaar hernieuwde belangstelling voor faagonderzoek, deels vanwege de gastheerspecifieke dodingsmogelijkheden van lytische fagen, die een veelbelovend hulpmiddel bieden om de toenemende dreiging van antimicrobieel resistente bacteriën tegen te gaan. Bovendien suggereren recente studies die aantonen dat fagen zich hechten aan darmslijm dat ze een beschermende rol kunnen spelen bij het voorkomen van bacteriële invasie in het onderliggende epitheel. Belangrijk is dat, net als bacteriële microbiomen, verstoorde fageom in verband zijn gebracht met verslechterde resultaten bij ziekten zoals inflammatoire darmaandoeningen. Eerdere studies hebben aangetoond dat fagen het microbioom van dieren en mensen kunnen moduleren door middel van fecale filtraattransplantaties, wat de gezondheid van de gastheer ten goede komt. Met deze recente golf van onderzoek komt de noodzaak om protocollen op te stellen en te standaardiseren voor het bestuderen van fagen in de context van het darmmicrobioom. Dit protocol biedt een reeks procedures om geïsoleerde T4-fagen en hun bacteriële gastheer, Escherichia coli, te bestuderen in de context van het maagdarmkanaal van muizen. De hier beschreven methoden beschrijven hoe te beginnen met een faaglysaat, het aan muizen toe te dienen en de effecten op de niveaus van bacteriële gastheer en fagen te beoordelen. Dit protocol kan worden aangepast en toegepast op andere faag-bacterieparen en biedt een startpunt voor het bestuderen van gastheer-faagdynamiek in vivo.

Om de interacties tussen de T4-faag/E. coli-dyade in de darm van muizen te onderzoeken, werden T4-faag en vehiculumlysaten bereid, gereinigd en gezuiverd (Figuur 1A). T4-faaglysaten werden getitereerd door middel van plaquetest en verdund tot 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/muis) in SM-buffer. Voertuiglysaten werden ook getiterd om te bevestigen dat er geen levensvatbare faagaanwezigheid was en verdund in hetzelfde volume SM-buffer als het T4-faaglysaat. Endotoxineniveaus werden gekwantificeerd in verdunde lysaten met behulp van een chromogene endotoxine-kwantificeringskit. T4-faag, warmte-geïnactiveerde faag en vehiculumlysaten hadden endotoxineniveaus die lager waren dan aanvaardbare niveaus voor drinkwater (<20 EU/ml)25 (figuur 1B). Aangezien het vehiculumlysaat een vergelijkbare hoeveelheid endotoxine bevatte als het T4-faaglysaat, werd het als een geschikte controle beschouwd. Het door warmte geïnactiveerde faaglysaat (2 x 107 pfu/ml voorafgaand aan de warmtebehandeling) bevatte minder endotoxine dan zowel het vehiculum als het T4-faaglysaat. Volgens de instructies van de kit werden monsters die met 1-octanol waren behandeld, getest op remming van de test door toevoeging van een endotoxinestandaard aan het mediumlysaat (verrijkt medium), om een uiteindelijke concentratie van 0,5 EU/ml te verkrijgen. De endotoxineniveaus met pieken minus de endotoxineniveaus van het vehiculum bedroegen 0,5 EU/ml ±25%, volgens de aanbevelingen van de fabrikant (figuur 1B). Dit toonde aan dat 1-octanol met succes was verwijderd en dat er geen remming van de test was veroorzaakt door de lysaten die de resultaten van de test zou kunnen verstoren.
E. coli K-12 (BW25113) monocolonized C57BL/6 muizen werden gefokt in een steriele flexibele film vinylisolator onder gnotobiotische omstandigheden (Figuur 2A). Muizen van de F0-generatie werden gekoloniseerd met E. coli door toevoeging aan hun omgeving en co-housing. Alleen de nakomelingen (F1- en F2-generatie) die vanaf de geboorte met E. coli werden gekoloniseerd door verticale transmissie en co-housing werden gebruikt voor experimenten. Deze strategie controleerde voor de veranderingen in het immuunsysteem, de slijmproductie en de ontwikkeling van het maagdarmkanaal die optreden als reactie op bacteriële inoculatie22,37, waardoor veranderingen kunnen worden gemeten die alleen optreden als gevolg van de introductie van fagen. Eenmaal volgroeid, werden experimentele muizen overgebracht naar steriele isocages, waar ze elk 2 x 106 pfu T4-faag of een gelijk volume vehiculumlysaat kregen via een orale sonde op een leeftijd van 6-8 weken. De overvloed aan T4-fagen en E. coli werd gedurende vier weken gecontroleerd door het verzamelen van fecale pellets en spotplating-assays op respectievelijk 0,5% (zachte) agar of 1,5% agar. In de loop van dit experiment konden T4-faag en E. coli naast elkaar bestaan zonder dat een van beide populaties werd uitgeput (Figuur 2B, C). Orale toediening van T4-faag in lagere doses van 2 x 102 en 2 x 104 pfu/muis verminderde het vermogen van de T4-faag om de darm te koloniseren niet in vergelijking met 2 x 106 pfu (Figuur 2D). Evenzo werd geen dosisafhankelijk effect van T4-inoculatie op de E. coli-spiegels waargenomen (figuur 2E).
Belangrijk is dat consistentie in beplating tussen monsters cruciaal bleek te zijn voor het aantal plaques. Bij het toevoegen van bacteriën aan de zachte agar werd bijvoorbeeld vastgesteld dat de dichtheid van bacteriën de uitkomst van de test sterk beïnvloedde. Toevoeging van E. coli die gedurende 1 uur, 1,5 uur of 2 uur werd gesubcultureerd, resulteerde in een lager aantal plaques dan bij de toevoeging van E. coli die gedurende 2,8 uur of langer werd gesubcultureerd. Bovendien stabiliseerde de kwantificering van plaque zich op ~1 x 109 pfu/ml wanneer E. coli gedurende 2,8 uur tot 16 uur ('s nachts) werd gesubcultureerd, wat ongeveer een 5-voudige toename was in vergelijking met de waarde berekend op basis van een subcultuur van 1 uur (~2 x 108 pfu/ml) (Figuur 3A). In plaats van subculturing kunnen doelbacteriën worden geïnoculeerd in zachte agar uit nachtelijke culturen. Hier had het volume van de 16 uur ('s nachts) E. coli-cultuur die in de zachte agar werd geïnoculeerd, invloed op het aantal plaques (Figuur 3B). Deze resultaten geven aan dat de dichtheid van E. coli in de agar het aantal plaquetests kan beïnvloeden. In beide benaderingen bleven de resultaten van de kwantificering van de fagen steken op dezelfde waarde (109 pfu/ml), wat suggereert dat de doelbacteriën een voldoende hoge dichtheid in de zachte agar moeten hebben om de nauwkeurigheid van het aantal plaques te garanderen.
Alles bij elkaar benadrukken deze resultaten het belang van het ontwikkelen van een begrip van de kinetiek van faag-bacteriën door middel van in vitro en in vivo pilotexperimenten voorafgaand aan het uitvoeren van experimentele manipulaties.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig01v2.jpg"> Figuur 1: Bereiding van faaglysaten. (A) Workflow voor het starten van een faaglysaat uit een faag met een hoge titer. Lysaten werden vermeerderd, gereinigd, geconcentreerd en endotoxinen werden verwijderd. Verontreinigende 1-octanol werd verwijderd door middel van snelheidsvacuüm. (B) Endotoxinen werden gekwantificeerd in faag- en mediumlysaten met behulp van een chromogene endotoxinekwantificeringskit. Blauwe stippellijnen geven de boven- en ondergrens aan om de productremming in de productremmingscontrole te weerleggen (0,5 EU/ml ± 25%). Elk punt vertegenwoordigt een van de twee technische replicaten. De hoogte van de staaf vertegenwoordigt het gemiddelde van de replicaten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig01largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig02v2.jpg"> Figuur 2: Generatie van monokoloniseerde muizen en monitoring van faag- en bacterieniveaus in fecale pellets. (A) Workflow voor het koloniseren van kiemvrije muizen met een enkele bacteriesoort en het genereren van F1- en F2-monokoloniseerde muizen. (B-E) Niveaus van T4-faag en E. coli gedetecteerd in fecale pellets van C57BL/6-muizen die monokoloniseerd met E. coli werden geboren en werden geïnoculeerd met T4-faag op 6-8 weken oud. Op dag 0 (pre-kolonisatie) en de aangegeven dagen na kolonisatie werden T4-faagniveaus gemeten door middel van spotplating en plaque-assays met behulp van de enkele agarlaagmethode. E. coli-niveaus werden gemeten door middel van spotplating op 1,5% LB-agar. (B, C) Kinetiek van (B) T4-faag- en (C) E. coli-niveaus in teruggewonnen fecale pellets na inoculatie met 2 x 106 pfu T4-faag of voertuiglysaat (genormaliseerd voor volume- en endotoxineniveaus). (D, E) D) T4-faag en E) E. coli in teruggewonnen fecale pellets na inoculatie met 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu of 2 x 106 pfu T4-faag. Foutbalken vertegenwoordigen het gemiddelde en de standaardfout van het gemiddelde (SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig02largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65906/65906fig03v2.jpg"> Figuur 3: Nauwkeurigheid van probleemoplossing bij plaque-assays. (A) T4-faaglysaattiter met behulp van E. coli-nachtculturen of subculturen voor de bereiding van zachte agar (0,5% agar, LB). Subculturen werden gemaakt met behulp van een 1:50 verdunning van een nachtelijke E. coli-cultuur in verse LB. 5 ml zachte agarpreparaten werden geënt met 100 μL E. coli en 20 μL T4-faag. CaCl2 en MgSO4 werden voor deze tests niet aan zachte agar toegevoegd, maar kunnen desgewenst worden toegevoegd. E. coli-subcultuurtijden van minder dan 2,8 uur resulteerden in een lagere schijnbare fagtiter. (B) T4-faaglysaattiter met verschillende E. coli-dichtheden in zachte agarbereiding. Het toevoegen van verschillende volumes E. coli uit een nachtelijke cultuur (niet gesubcultureerd, zoals in A) aan de zachte agar resulteerde in verschillende schijnbare faagtiters. Foutbalken vertegenwoordigen de berekende onzekerheid van de faagtiter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65906/65906fig03largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Bacteriofagen (fagen), virussen die bacteriën infecteren, zijn een integraal onderdeel van het darmmicrobioom. Hoewel deze symbiotische bewoners de bacteriële fitheid en populatiedynamiek aansturen, is er weinig bekend over hoe ze de darmhomeostase en ziekte beïnvloeden. Dit protocol bestudeert geïsoleerde T4-fagen in een muismodel, aanpasbaar aan andere faag-bacterieparen.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Bacteriophages (phages) are viruses that infect bacteria with species- and strain-level specificity and are the most abundant biological entities across ...

Ons onderzoek heeft tot doel de tripartiete interacties tussen bacteriofagenbacteriën en het immuunsysteem van zoogdieren te begrijpen in de context van de darm, gnotobiotische muizendarm. We hopen inzicht te krijgen in deze interacties onder gezondheids- en ziekteomstandigheden om het belang van het darmmicrobioom beter te begrijpen. Recente ontwikkelingen hebben aangetoond dat bacteriofagen kunnen worden gedetecteerd door het immuunsysteem van zoogdieren.Er is gesuggereerd dat de menselijke darmfageoom ontregeld kan zijn bij ziektetoestanden zoals inflammatoire darmaandoeningen, en immuunstimulatie door fagen zou de fenotypes van de ziekte kunnen verergeren. Ons doel is om anderen te voorzien van een gestandaardiseerd protocol voor het produceren van een T4-faaglysaat voor inoculatie en telling in gnotobiotische muismodellen. Op deze protocollen kan worden voortgebouwd en aangepast voor gebruik met andere bacteriofaagbacterieparen.

t4-bacteriophage-e-coli-interaction-murine-intestine-prototypical

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dit artikel beschrijft de procedure voor het bereiden van een fluorescentie-gemerkte versie van bacteriofaag lambda, infectie...

Na Cell-lot in<em&gt; E. coli</em&gt; Na Infectie door Phage Lambda

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024).This video demonstrates the in vivo interaction between T4 bacteriophage and E. coli in the murine intestine, and the fecal spot plating method to quantify their coexistence by measuring bacterial colonies and phage plaques.

Assessing the Coexistence of T4 Bacteriophage and E. coli in Murine Fecal Samples

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het gebruik van high-throughput instellingen om de antibacteriële werkzaamheid van bacteriofaag cocktails te screenen.

Bacteriofaag effectiviteit voor biocontrole van door voedsel overgedragen pathogenen geëvalueerd via high-throughput instellingen

We beschrijven een protocol om de belangrijkste taken van gastheer signaalmoleculen in lytische replicatie van een model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (γHV68) te identificeren. Gebruik te maken van genetisch gemodificeerde muizenstammen en embryonale fibroblasten voor γHV68 lytische replicatie, het protocol maakt het mogelijk zowel de fenotypische karakterisatie en moleculaire ondervraging van virus-gastheer interacties in virale lytische replicatie.

Opheldering van Host-virus interactie in Lytische Replicatie van een Model Herpesvirus

Murine beenmergtransplantatie is een veel gebruikte techniek om immunologische mechanismen voor graft-versus-host ziekte bij mensen bestuderen. De mogelijkheid om T-cel mensenhandel patronen te...

Inductie van Graft-versus-host ziekte en<em&gt; In Vivo</em&gt; T-cel monitoren door gebruik van een MHC-matched muizenmodel

Schetsen we methoden voor de efficiënte en snelle isolatie / cultuur van levensvatbare microglia uit de neonatale cerebrale cortex en volwassen ruggenmerg. De dissectie en beplating van corticale microglia kan worden bereikt binnen 90 minuten, met de daaropvolgende microglia oogst plaatsvindt ~ 10 dagen na de eerste dissectie.

Kweken Microglia van de neonatale en volwassen centrale zenuwstelsel

De leden van het Burkholderia geslacht zijn ziekteverwekkers van klinisch belang. We beschrijven een werkwijze voor het totaal bacterieel eiwit extractie met mechanische verbreking en 2-D gelelektroforese voor daaropvolgende proteoomanalyse.

Totaal Eiwitextractie en 2-D gelelektroforese Werkwijzen voor<em&gt; Burkholderia</em&gt; Soorten

Hier wordt een procedure beschreven voor de oprichting van systemische infectie in de neonatale rat met culturen van Escherichia coli K1. Deze niet-invasieve procedure toestaat kolonisatie van het maagdarmkanaal, translocatie van het pathogeen in de systemische circulatie, en invasie van het centraal zenuwstelsel bij de choroid plexus.

Non-Invasive Model van Neuropathogenic Escherichia coli Infectie in de Neonatale Rat

De huidige studie beschrijft de ontwikkeling en toepassingen van een genetisch gemanipuleerd assaysysteem gebaseerd op de transfectie van rattenbasofiele leukemiecellen met het paarden FcεRIα-gen. Getransfecteerde cellen drukken een functioneel receptor uit waarbij de afgifte van mediatoren van de allergische respons kan worden geactiveerd door IgE en antigeen.

Ontwikkeling van een In vitro Modelsysteem voor het bestuderen van de interactie van Equus Caballus IgE met zijn receptor met hoge affiniteit FceRI

Leer hoe T4-bacteriofaag en E. coli interacties in de muizendarm worden bestudeerd met een gnotobiotisch model. Deze methode onthult inzichten over gastheer-bacteriofaagdynamiek en darmgezondheid.

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo (Video) | JoVE Journal

T4 Bacteriofaag en E. coli Interactie in de Muizendarm: een prototypisch model voor het bestuderen van gastheer-bacteriofaagdynamiek in vivo

Meer video's verkennen