Name: Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-09-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Leer hoe u de functionele integriteit van de bloed-hersenbarrière evalueert met behulp van bEnd.3 endotheelcellen en TER-metingen. Deze niet-invasieve methode versnelt het screenen van geneesmiddelen voor centrale zenuwstelselaandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We waarderen de financiële steun van de National Natural Science Foundation of China (82274207 en 82104533), het Key Research and Development Program van Ningxia (2023BEG02012) en het Xinglin Scholar Research Promotion Project van de Chengdu University of TCM (XKTD2022013).

OPMERKING: Van de hersenen van muizen afgeleide endotheelcellen.3 (bEnd.3) werden geïnoculeerd in de kamers van een plaat met 24 putjes om een eenvoudig in vitro model van BBB te construeren onder specifieke mediumomstandigheden. De TEER van normale cellen en hypoxische cellen werd gemeten met een TEER-meter (Figuur 1 en Figuur 2).
1. Voorbereiding van de oplossing
<ol><li>Bereid het DMEM-celkweekmedium dat FBS (10%, v/v), 100 E/ml penicilline en 10 mg/ml streptomycine bevat (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Bereid 100 mM CoCl2 stockoplossing door 1,30 mg CoCl2 toe te voegen aan 100 μL DMSO-oplossing. OPMERKING: Alle bovenstaande oplossingen werden bewaard bij een toestand van 4 °C en de stockoplossing werd vóór gebruik verdund volgens de gewenste concentratie.</li>
	<li>Bereid 5% natriumhypochlorietoplossing (v/v) door 2 ml natriumhypochlorietoplossing toe te voegen aan 38 ml dubbel gedestilleerd water.</li>
</ol>2. Celkweek en levensvatbaarheid van de cel
<ol><li>Zaai 1 ml bEnd.3 cellen in kweekschaaltje (100 mm) met DMEM-medium met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml en kweek bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2 . Vervang het medium om de 2 à 3 dagen en subkweek de cellen 2x per week.</li>
	<li>Nadat bEnd.3-cellen zijn gegroeid tot 80% samenvloeiing, verteert u de cellen gedurende 30 s met 0,25% trypsine.</li>
	<li>Maak een suspensie van bEnd.3 cellen met een dichtheid van 7 x 104 cellen/ml met behulp van DMEM-medium door een celteller. Zaai vervolgens 100 μL bEnd.3-celsuspensie in een plaat met 96 putjes.</li>
	<li>Reinig de cellen na celadhesie met PBS en kweek de cellen gedurende 24 uur onder dezelfde omstandigheden met 100 μL kweekmedium of geneesmiddelbevattend medium (100 μM, 200 μM, 300 μM, 400 μM, 500 μM CoCl2). Nadat u het medium in de putplaat hebt verwijderd en met PBS hebt gereinigd, voegt u 100 μL CCK-8-oplossing toe. NOTITIE: Genereer geen luchtbellen in de put, die de waarden van optische dichtheid (OD) beïnvloeden.</li>
	<li>Zet de platen met 96 putjes in een omgeving van 37 °C en incubeer gedurende 1 uur. Meet de absorptie van de platen met 96 putjes bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer. OPMERKING: Om verschillen binnen de groep te voorkomen, werden de putplaten vóór detectie afgekoeld tot kamertemperatuur.</li>
	<li>Bereken de levensvatbaarheid van de cellen die wordt geïnduceerd door verschillende concentraties CoCl2 volgens de formule [ODDrug - ODBlank] / [ODControl-OD Blank] x 100%. Selecteer de CoCl2-concentratie met een significant verschil in vermindering van de levensvatbaarheid van de cel in vergelijking met de controlegroep voor het volgende experiment.</li>
</ol>3. Assemblage van het model
<ol><li>Spoel de bovenste kamer van de 24-wells platen met PBS. OPMERKING: Cellen groeiden en versmolten op de bodem van de bovenste kamer van de plaat met 24 putjes, en er vormden zich geleidelijk strakke verbindingen tussen cellen om een barrièrerol te spelen. Als de endotheelcellen die in sommige onderzoeken worden gebruikt, niet in staat zijn om zelfstandig een volledige barrière op PET-membranen te vormen, is het coaten van de membranen met collageen IV-oplossing vereist voorafgaand aan celinoculatie.</li>
	<li>Meng de bEnd.3 cellen met DMEM medium om een suspensie te maken met een dichtheid van 5 x 105 cellen/ml met behulp van een vortex mixer. Zaai vervolgens 200 μL bEnd.3-celsuspensie op het PET-membraan in de bovenste kamer van een plaat met 24 putjes (0,33cm2, 0,4 μm membraanporiegrootte). OPMERKING: De pilotstudie van dit protocol vond geen verschil in resultaten bij het gebruik van 5 tot 10 passages van bEnd.3-cellen voor experimenten. Om de kans op succesvolle modellering te garanderen, verwijzen wij u naar het celgetalinterval van dit protocol.</li>
	<li>Voeg 1200 μL compleet medium toe aan de onderste kamer van de plaat om ervoor te zorgen dat de osmotische druk van de bovenste en onderste kamer de neiging heeft zich te stabiliseren. Er zijn verschillen in het volume van het toegevoegde medium, afhankelijk van het type; Zorg ervoor dat het vloeistofniveau van de bovenste en onderste kamers gelijk is.</li>
	<li>Vervang het medium van de bovenste kamer en de onderste kamer elke dag op een vast tijdstip en controleer tegelijkertijd de weerstandswaarde.<ol><li>Bij het veranderen van het medium wordt de integriteit van de cellaag beschadigd door kunstmatige aanraking of overmatige beweging. Om de bovenstaande situatie te voorkomen, verwijdert u langzaam het oude medium aan één kant met een onderdrukpipet en voegt u langzaam een nieuw medium toe langs de wand tijdens het uitwisselen van de vloeistof.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Meting van TEER
<ol><li>Voordat het werk begint, plaatst u de weerstand, 5% natriumhypochlorietoplossing, 75% ethanol en dubbele gedestilleerde wateroplossing in een ultraschone tafel. Schakel de UV-straling gedurende 30 minuten in om resterende bacteriën en ziekteverwekkers te elimineren.</li>
	<li>Plaats de elektroden in een oplossing van 5% natriumhypochloriet met langzaam schudden gedurende 3 s tot 5 s en dompel ze vervolgens gedurende 15 minuten onder in 75% ethanol. Breng ten slotte over naar PBS of een oplossing met dubbel gedestilleerd water tot gebruik.</li>
	<li>Zet de schakelaar aan de achterkant van de celweerstandsmeter AAN, klik op Plaat selecteren volgens de parameters in Tabel 1 en selecteer Plaat met 24 putjes.</li>
	<li>Selecteer afhankelijk van de bedieningsbehoeften de juiste detectievolgorde. In dit onderzoek hebben we gekozen voor de A1-procedure .</li>
	<li>Steek een kΩ-weerstand in de rechterplug om het instrument te kalibreren. Als het kalibratieresultaat 1000 ± 5 Ω is, beschouw de nauwkeurigheid van het instrument dan als normaal.<ol><li>Als het kalibratieresultaat niet 1000 Ω is, klikt u op Mode Units op de hoofdinterface om OHMS te selecteren en klikt u vervolgens op Kalibreren op het hoofdscherm om het instrument opnieuw te kalibreren.</li>
	</ol></li>
	<li>Trek de kΩ-weerstand aan de rechterkant naar buiten en vervang de meetelektrode door een aansluitdraad.</li>
	<li>Plaats de elektrode in de plaat met 24 putjes zonder de cellen verticaal te zaaien en klik op Blank Handling op het hoofdscherm van het instrument. De achtergrondwaarde van de plaatweerstand zonder zaadcellen is ongeveer 134,4 Ω.</li>
	<li>Steek de twee elektroden in de bovenste en onderste kamers van de gezaaide plaat met cellen zodat de cellaag ertussen zit en noteer vervolgens de weerstandswaarde door voorzichtig op het pedaal te trappen.<ol><li>Zorg ervoor dat de elektrode de cellen in de bovenste kamer en de onderkant van de onderste kamer niet raakt. De inweektijd van de elektrode in de oplossing heeft geen invloed op de weerstandswaarde en het is alleen nodig om ervoor te zorgen dat de elektrode zich in de juiste positie bevindt.</li>
	</ol></li>
	<li>Verkrijg TEER-waarden (Ωcm2) door elektrische weerstandswaarden (ohm) te vermenigvuldigen met het onderste oppervlak (cm2) van de bovenste kamer, zoals in de vergelijking: TEER (Ωcm2) = Weerstand (Ω) xS-inzetstuk (cm2)</li>
	<li>Teken een lijndiagram van TEER-Time (in dagen). Wanneer de weerstandswaarde in de loop van de tijd niet verder toeneemt (gemeten over dagen), beschouw de cel dan als een barrière. NOTW: Het monolayer BBB-model van bEnd.3-cellen zal met succes worden geconstrueerd door bEND.3-cellen te kweken met de parameters in deze studie gedurende ongeveer 6 dagen. De TEER van het bEnd.3-celmodel varieerde van 16,49 ± 2,12Ωcm2 tot 27,59 ± 1,50Ωcm2 binnen 6 dagen (n=8, gemiddelde ± SD).</li>
</ol>5. Vernietiging van barrières en statistische analyse
<ol><li>Selecteer volgens de TEER - tijdcurve de putten met barrièrefunctie en verdeel ze in de controlegroep en CoCl2-groep (n = 4).</li>
	<li>Voeg het kweekmedium en het kweekmedium met 300 μM CoCl2 (200 μL) toe aan respectievelijk de bovenste kamer van de controlegroep en de CoCl2-groep .</li>
	<li>Detecteer de weerstandswaarden van de controlegroep en CoCl2-groepen na 12 uur en 24 uur incubatie bij 37 °C volgens de in stap 4 beschreven procedure.</li>
	<li>Gebruik commerciële software om de trend van TEER-waarden van de barrière van cellen gekweekt met of zonder 300 μM CoCl2 in kaart te brengen.</li>
	<li>Gebruik statistische analysesoftware om het verschil in resistentiewaarden tussen met CoCl2 behandelde cellen en normale cellen te analyseren (n=4, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).</li>
</ol>

Transendotheliale weerstandsmeting om de integriteit van de celbarrière te beoordelen

<ol><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLEC14A+deficiency+exacerbates+neuronal+loss+by+increasing+blood-brain+barrier+permeability+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 48(2020).</li>
<li>Bagchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+models+for+drug+screening+and+permeation+studies%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview.</a> Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).</li>
<li>Daneman, R., Prat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier.</a> Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412(2015).</li>
<li>Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+in+health+and+disease%3A+Important+unanswered+questions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions.</a> J Exp Med. 217 (4), 20190062(2020).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier delivery.</a> Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).</li>
<li>Eigenmann, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+four+immortalized+human+brain+capillary+endothelial+cell+lines%2C+hCMEC%2FD3%2C+hBMEC%2C+TY10%2C+and+BB19%2C+and+optimization+of+culture+conditions%2C+for+an+in+vitro+blood-brain+barrier+model+for+drug+permeability+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33(2013).</li>
<li>Gajdács, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concept+of+an+ideal+antibiotic%3A+Implications+for+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Molecule%22%5BJournal%5D)">The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design.</a> Molecule. 24 (5), 892(2019).</li>
<li>Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+models%3A+in+vitro+to+in+vivo+translation+in+preclinical+development+of+CNS-targeting+biotherapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics.</a> Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).</li>
<li>Helms, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+the+blood-brain+barrier%3A+An+overview+of+commonly+used+brain+endothelial+cell+culture+models+and+guidelines+for+their+use%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).</li>
<li>Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, Ş, ÖztÜrk, Ş, Şendemİr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculture+model+of+blood-brain+barrier+on+electrospun+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Turk+J+Biol%22%5BJournal%5D)">Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers.</a> Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).</li>
<li>Kim, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+validation+of+the+simplified+in+vitro+3D+Co-culture+based+BBB+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model.</a> Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).</li>
<li>Aazmi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascularizing+the+brain+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Vascularizing the brain in vitro.</a> iScience. 25 (4), 104110(2022).</li>
<li>Burkhart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+brain+capillary+endothelial+cells+in+primary+culture+with+defined+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 19(2015).</li>
<li>Campisi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+self-organized+microvascular+model+of+the+human+blood-brain+barrier+with+endothelial+cells%2C+pericytes+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes.</a> Biomaterials. 180, 117-129 (2018).</li>
<li>Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammatory+in+vitro+cell+culture+models+and+the+potential+applications+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders.</a> Front Pharmacol. 12, 671734(2021).</li>
<li>Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+transepithelial+transport+measurements+to+detect+nephrotoxicity+in+vitro+using+the+RPTEC%2FTERT1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line.</a> Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).</li>
<li>Nazari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+TEER+measurements+of+biological+barriers+in+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems.</a> Biosens Bioelectron. 234, 115355(2023).</li>
<li>Nicolas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurements+on+perfused+membrane-free+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia.</a> Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).</li>
<li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+alleviates+hypoxia-induced+blood-brain+barrier+injury+via+regulation+of+CLDN5+%28claudin+5%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5).</a> Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).</li>
<li>Feng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA%2FROCK-2+pathway+inhibition+and+tight+junction+protein+upregulation+by+catalpol+suppresses+lipopolysaccaride-induced+disruption+of+blood-brain+barrier+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability.</a> Molecules. 23 (9), (2018).</li>
<li>Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroinflammation+and+blood-brain+barrier+disruption+following+traumatic+brain+injury%3A+Pathophysiology+and+potential+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets.</a> J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notoginsenoside+R1+intervenes+degradation+and+redistribution+of+tight+junctions+to+ameliorate+blood-brain+barrier+permeability+by+Caveolin-1%2FMMP2%2F9+pathway+after+acute+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke.</a> Phytomedicine. 90, 153660(2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+cobalt+chloride+as+a+chemical+hypoxia+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model.</a> J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).</li>
<li>Jiang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+attenuates+high+altitude+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+in+mice+via+inhibiting+NF-%CE%BAB%2FNLRP3+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway.</a> Eur J Pharmacol. 925, 175015(2022).</li>
<li>Xie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodiola+crenulate+alleviates+hypobaric+hypoxia-induced+brain+injury+via+adjusting+NF-%CE%BAB%2FNLRP3-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation.</a> Phytomedicine. 103, 154240(2022).</li>
<li>Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergent+properties+of+the+connected+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The emergent properties of the connected brain.</a> Science. 378 (6619), 505-510 (2022).</li>
<li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimated+burden+of+stroke+in+China+in+2020%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Netw+Open%22%5BJournal%5D)">Estimated burden of stroke in China in 2020.</a> JAMA Netw Open. 6 (3), 231455(2023).</li>
<li>Alzheimers Dement. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+facts+and+figures%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Dement%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease facts and figures.</a> Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps+promote+tPA-induced+brain+hemorrhage+via+cGAS+in+mice+with+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke.</a> Blood. 138 (1), 91-103 (2021).</li>
<li>Liu, X. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Cdk5+deficit+leads+to+the+development+of+spontaneous+epilepsy+through+CXCL1%2FCXCR2-mediated+reactive+astrogliosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis.</a> J Exp Med. 217 (1), 20180992(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Sporadic+Alzheimer%27s+Disease+in+Human+Brain+Organoids+under+Serum+Exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci+%28Weinh%29%22%5BJournal%5D)">Modeling Sporadic Alzheimer's Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure.</a> Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462(2021).</li>
<li>Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+%28BBB%29+based+on+hCMEC%2FD3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells.</a> J Control Release. 358, 78-97 (2023).</li>
<li>Artus, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+pathway+contributes+to+the+integrity+of+tight+junctions+in+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).</li>
<li>Sivandzade, F., Cucullo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vitro+blood-brain+barrier+modeling%3A+A+review+of+modern+and+fast-advancing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).</li>
<li>Galla, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocultures+of+primary+porcine+brain+capillary+endothelial+cells%3A+Still+a+functional+in+vitro+model+for+the+blood-brain-barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier.</a> J Control Release. 285, 172-177 (2018).</li>
<li>Srinivasan, B., Kolli, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial%2Ftransendothelial+electrical+resistance+%28TEER%29+to+measure+the+integrity+of+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Blood-Brain+Barrier%22%5BJournal%5D)">Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier.</a> Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).</li>
<li>Liang, Y., Yoon, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+sensors+for+blood-brain+barrier+%28BBB%29+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Sens+Actuators+Rep%22%5BJournal%5D)">In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip.</a> Sens Actuators Rep. 3, 100031(2021).</li>
<li>Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+increases+expression+of+selected+blood-brain+barrier+transporters+GLUT-1%2C+P-gp%2C+SLC7A5+and+TFRC%2C+while+maintaining+barrier+integrity%2C+in+brain+capillary+endothelial+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers.</a> Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De hersenen zijn een van de meest ontwikkelde lichaamsorganen en regelen een breed scala aan ingewikkelde fysiologische processen, waaronder geheugen, cognitie, gehoor, geuren beweging. De hersenen zijn tegelijkertijd een van de meest gecompliceerde en zieke organen van het menselijk lichaam. Het voorkomen van veel aandoeningen van het centrale zenuwstelsel vertoont jaar na jaar een groeiende tendens als gevolg van factoren zoals luchtvervuiling, onregelmatige eetpatronen en andere factoren 27,28,...

BBB is een unieke biologische interface tussen bloedcirculatie en zenuwweefsel, die is samengesteld uit vasculaire endotheelcellen, pericyten, astrocyten, neuronen en andere cellulairestructuren1. De stroom van ionen, chemicaliën en cellen tussen het bloed en de hersenen wordt strikt gereguleerd door deze barrière. Deze homeostase beschermt de zenuwweefsels tegen gifstoffen en ziekteverwekkers en maakt tegelijkertijd de juiste werking van de zenuwen van de hersenen mogelijk 2,3. Het handhaven van de integriteit van de BBB kan de ontwikkeling en progressie van aandoeningen die het centrale zenuwstelsel aantasten, zoals neuronale disfunctie, oedeem en neuro-inflammatie, effectief voorkomen. De unieke fysiologische eigenschappen van de BBB voorkomen echter dat meer dan 98% van de medicijnen met kleine moleculen en 100% van de macromoleculaire geneesmiddelen het centrale zenuwstelselbinnendringen. Daarom is het verhogen van de penetratie van medicijnen via de BBB tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen voor het centrale zenuwstelsel essentieel voor het bereiken van therapeutische werkzaamheid 6,7. Hoewel computersimulatiescreening van substraten de kans dat kandidaat-geneesmiddelen de BBB overschrijden aanzienlijk heeft verhoogd, zijn betrouwbare en betaalbare in vitro/in vivo BBB-modellen nog steeds nodig om aan de behoeften van wetenschappelijk onderzoek te voldoen8.
Een snelle en betaalbare techniek voor high-throughput drug screening is het in vitro model9. Om licht te werpen op de fundamentele processen van de effecten van geneesmiddelen op de BBB-functie en hun rol in de ontwikkeling en progressie van ziekten, is een reeks vereenvoudigde in vitro BBB-modellen gemaakt. Op dit moment zijn de gebruikelijke in vitro BBB-modellen de monolaag-, co-cultuur-, dynamische en microfluïdische modellen 10,11,12, geconstrueerd door vasculaire endotheelcellen en astrocyten, pericyten of microglia 13,14. Hoewel 3D-celculturen meer in overeenstemming zijn met de fysiologische structuur van BBB15, wordt hun toepassing als middel voor het screenen van geneesmiddelen op BBB nog steeds beperkt door hun ingewikkelde ontwerp en ondermaatse reproduceerbaarheid. Het monolayer in vitro model daarentegen wordt het meest gebruikt om de BBB te onderzoeken en is toepasbaar voor het bepalen van de expressie van membraantransporters en tight junction eiwitten in bepaalde cellen.
Transmembraan elektrische weerstandsmeting (TEER) is een techniek om de cellaag over de weerstand te evalueren en te bewaken en de celintegriteit en permeabiliteit van de barrière te evalueren. Door tegelijkertijd twee elektroden in het groeimedium of de bufferoplossing aan weerszijden van de monolaag te plaatsen, is het mogelijk om de wisselstroom of elektrische impedantie door de compacte laag van de cel te meten 16,17. Om te bepalen of het in vitro BBB-model op de juiste manier is gemaakt, zal de meting van TEER meestal worden gebruikt als de gouden standaard18. Aan de andere kant kan de trend van medicatie-actie op BBB-permeabiliteit nauwkeurig worden voorspeld door de verandering in elektrische weerstand van de cellaag na betrokkenheid van het geneesmiddel te meten19. Feng et al. ontdekten bijvoorbeeld dat catalpol (het primaire actieve monomeer van rehmanniae) de door lipopolysaccharide geïnduceerde neerwaartse regulatie van tight junction-eiwitten in de BBB effectief kon omkeren en de TEER-waarde van de endotheelcellaag20 van de muizenhersenen kon verhogen.
De neuro-inflammatoire reactie is meestal de belangrijkste oorzaak van een verstoring van de BBB-homeostase21. Hypoxische behandeling om neuro-inflammatoir letsel te induceren is de belangrijkste methode om de bloed-hersenbarrière te vernietigen, voornamelijk met inbegrip van fysische methoden en chemische reagensmethoden. De eerste maakt voornamelijk gebruik van een incubator met drie gassen om het zuurstofgehalte in de celgroeiomgeving te variëren om hypoxische omstandigheden te simuleren22, terwijl de laatste wordt bereikt door kunstmatig deoxyreagentia zoals CoCl2 in het celkweekmediumte introduceren 23. De cellen blijven zuurstofarm als Co2+ in het heem wordt vervangen door Fe2+. Als Fe2+ wordt gesubstitueerd door Co2+ in de katalytische groep, wordt de activiteit van prolinehydroxylase en aspartaathydroxylase geremd, wat resulteert in een accumulatie van hypoxie-induceerbare factor-1α (HIF-1α)24. Bij aanhoudende hypoxie veroorzaakt de defosforylering van HIF-1α in het cytoplasma celdood en activeert de vasculaire endotheliale groeifactor, die uiteindelijk de vasculaire permeabiliteit verhoogt. In eerdere studies 25,26 is goed aangetoond dat hypoxie de expressie van endotheliale tight junction-eiwitten aanzienlijk kan verminderen om de permeabiliteit van BBB te vergroten. In deze studie werd de tijdweerstandscurve van bEnd.3-cellen gezaaid in platen met 24 putjes gemeten om een eenvoudig BBB-model te creëren. Met behulp van dit model hebben we de veranderingen in cel-TEER na CoCl2-interventie gekarakteriseerd om een celmodel te construeren dat kan worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen op BBB-bescherming.

<table><tbody><tr><td>24-well transwell plate</td><td>Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 &micro;m)</td><td>10522023</td><td></td></tr><tr><td>75 % ethanol</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd</td><td>2023052901</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd</td><td>220412-078-B</td><td></td></tr><tr><td>bEnd.3 cells</td><td>Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd</td><td>CL0049</td><td></td></tr><tr><td>Cell counting kit-8 (CCK-8)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>BG0025</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (100mm)</td><td>Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd</td><td>1192022</td><td></td></tr><tr><td>Cobalt Chloride (CoCl2)</td><td>Sigma</td><td>15862</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modified eagle medium (1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8121587</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>2166090RP</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software</td><td>GraphPad Software</td><td>9.0.0(121)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (Contains collagen IV)</td><td>MedChemexpress</td><td>HY-K6002</td><td></td></tr><tr><td>Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax iD5</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8 software</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724(B724)</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (100x)</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>17C18B16</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS, 1x)</td><td>Gibco ThermoFisher Scientific</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hypochlorite</td><td>ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd</td><td>2022091501</td><td></td></tr><tr><td>Transmembrane resistance meter</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>VOM3 (verison 1.6)</td><td></td></tr></tbody></table>

opname van functionele integriteit van barrière op bend.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een dynamische fysiologische structuur die bestaat uit microvasculaire endotheelcellen, astrocyten en pericyten. Door de interactie tussen beperkte doorvoer van schadelijke stoffen, opname van voedingsstoffen en metabolietklaring in de hersenen te coördineren, is de BBB essentieel voor het behoud van de homeostase van het centrale zenuwstelsel. Het bouwen van in vitro modellen van de BBB is een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de pathofysiologie van neurologische aandoeningen en het creëren van farmacologische behandelingen. Deze studie beschrijft een procedure voor het maken van een in vitro monolaag BBB-celmodel door bEnd.3-cellen in de bovenste kamer van een plaat met 24 putjes te zaaien. Om de integriteit van de celbarrièrefunctie te beoordelen, werd de conventionele epitheelcelvoltmeter gebruikt om de transmembraan elektrische weerstand van normale cellen en CoCl 2-geïnduceerde hypoxische cellen in realtime vast te leggen. We verwachten dat de bovenstaande experimenten effectieve ideeën zullen opleveren voor het maken van in vitro modellen van BBB en geneesmiddelen voor de behandeling van aandoeningen van ziekten van het centrale zenuwstelsel.

Dit protocol maakte het mogelijk om veranderingen in de weerstandswaarden van cellen te registreren volgens de parameters die waren ingesteld in de transendotheelweerstandsmeter. De levensvatbaarheid van bEnd.3-cellen (aantal levende cellen) die met verschillende concentraties CoCl2 werden behandeld, werd gescreend door middel van een CCK-8-test. Grotere celbeschadiging veroorzaakt door CoCl2 werd vertegenwoordigd door een lagere levensvatbaarheid van de cellen. We ontdekten dat 300 μM CoCl2</s...

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar en efficiënt in vitro model van de bloedbarrière van de hersenen. De methode maakt gebruik van cerebrale vasculaire endotheelcellen bEnd.3 van muizen en meet de transmembraan elektrische weerstand.

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic physiological structure composed of microvascular endothelial cells, astrocytes, and pericytes. By coordinating ...

Huidige studies maken doorgaans gebruik van permeabiliteitstests en bijbehorende eiwitexpressie om de nauwkeurigheid van TEER-detectie te verifiëren. Het BBB-model van monolaagcellen is minder effectief voor het screenen van geneesmiddelen, en het gebruik van meer cellen maakt het moeilijker om het model te construeren. Het protocol van deze studie is relatief eenvoudig, omdat de niet-invasieve procedure het mogelijk maakt om de celmonsters na TEER-detectie in andere experimenten te gebruiken.De detectie van TEER om de permeabiliteit van celmodellen te beoordelen, kan de screening van geneesmiddelen voor behandeling en preventie van het centrale zenuwstelsel versnellen om het slagingspercentage van de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen te vergroten. In de toekomst zullen we de expressie van tight junction-eiwit in de cellen van het bovenste compartiment van de borstwand detecteren om te verifiëren dat TEER-testresultaten de integriteit van de BBB-barrièrefunctie effectief kunnen weergeven.

barrier-functional-integrity-recording-on-bend3-vascular-endothelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een real-time elektrische Impedantie Gebaseerd Techniek om invasie van endotheelcellen monolaag meten door Cancer Cells

This video demonstrates a method for assessing transendothelial electrical resistance (TEER) in mouse brain microvascular endothelial cells in vitro. A high TEER value indicates intact endothelial cell junctions, while the addition of activated T cells lowers the TEER value, reflecting disruption of the junctional barrier.

Assessing Transendothelial Electrical Resistance in an In Vitro Blood-Brain Barrier Model

De organische elektrochemische transistor is geïntegreerd met levende cellen en gebruikt om te controleren ion flux in de maag epitheliale barrière. In deze studie, een toename ionenflux betrekking tot verstoring van tight junctions, geïnduceerd door de aanwezigheid van calcium chelator EGTA (ethyleenglycol-bis (beta-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetra azijnzuur zuur), gemeten.

Sensing van Barrier weefselverstoring met een Organic elektrochemische Transistor

Dit protocol beoordelingen elektrische cel-substraat Impedantie Sensing, een werkwijze voor registreren en analyseren van de impedantie spectrum van hechtende cellen voor de kwantificering van celhechting, proliferatie, motiliteit en cellulaire reacties op farmacologische en toxische stimuli. Detectie van endotheliale permeabiliteit en beoordeling van cel-cel en cel-substraat contacten benadrukt.

Electric Cell-substraat Impedantie Sensing voor de kwantificering van endotheelproliferatie, barrièrefunctie en Motility

Hier beschrijven we een in vitro muismodel van de bloed-hersenbarrière dat gebruik maakt van impedantiecelspectroscopie, met een focus op de gevolgen voor de integriteit en permeabiliteit van endotheelcellen na interactie met geactiveerde T-cellen.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van de bloed-hersen barrière met behulp van Impedantiespectroscopie: een focus op T-cel-endotheelcellen Interaction

Deze publicatie beschrijft de fabricage van een apparaat van de orgel-on-chip met geïntegreerde elektroden voor directe kwantificering van signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER). Voor een validatie, de bloed - hersen barrière werd geïmiteerd binnen dit microfluidic apparaat en zijn functie als barrière werd gecontroleerd. De gepresenteerde methoden voor de integratie van de elektrode en directe kwantificering van de TEER zijn algemeen toepasbaar.

Fabricage en validatie van een orgel-on-chip systeem met geïntegreerde elektroden te kwantificeren direct signaalcomplexen elektrische weerstand

Hier laten we zien hoe je een goedkope volt-Amperemeter opzetten met programmeerbare uitgangsfrequentie die kan worden gebruikt met in de handel verkrijgbare Chopstick-elektroden voor transepitheliale/endotheliale elektrische weerstand metingen.

Een eenvoudige benadering om TEER metingen uit te voeren met behulp van een zelfgemaakte volt-Amperemeter met programmeerbare uitgangsfrequentie

Dit protocol illustreert een in vitro endotheelceltranscytosetest als een model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren door het vermogen van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen te meten om mierikswortelperoxidase over cellen te transporteren in caveolae-gemedieerde transcellulaire transportprocessen.

Endotheelceltranscytosetest als een in vitro model om de permeabiliteit van de binnenste bloed-retinale barrière te evalueren

Hier demonstreren we de techniek van het gebruik van op impedantie gebaseerde biosensoren: ECIS en cellZscope, voor het meten van de sterkte van de endotheliale barrière van de hersenen. We beschrijven de voorbereiding en techniek van het toevoegen van verschillende stimuli aan een in vitro model van het hersenendotheel. We meten, registreren en geven een representatieve analyse van de bevindingen.

Het meten van veranderingen in de integriteit van de endotheliale barrière van de hersenen met twee op impedantie gebaseerde biosensoren als reactie op kankercellen en cytokines

We presenteren een methode voor het verzamelen van electrocorticografische signalen voor onderzoeksdoeleinden van mensen bij wie een invasieve epilepsie monitoring. We laten zien hoe je de BCI2000 software platform te gebruiken voor het verzamelen van gegevens, signaalverwerking en stimulus presentatie. In het bijzonder laten we zien Sigfried, een BCI2000-based tool voor real-time functionele brein in kaart brengen.

Het opnemen van de Mens electrocorticografische (ECOG) Signalen voor neurowetenschappelijk onderzoek en Real-time Functioneel Cortical Mapping

Leer hoe u de functionele integriteit van de bloed-hersenbarrière evalueert met behulp van bEnd.3 endotheelcellen en TER-metingen. Deze niet-invasieve methode versnelt het screenen van geneesmiddelen voor centrale zenuwstelselaandoeningen.

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand (Video) | JoVE Journal

Opname van functionele integriteit van barrière op bEnd.3 vasculaire endotheelcellen via detectie van transendotheliale elektrische weerstand

Meer video's verkennen