Name: Ex vivo van patiënten afkomstige glioomorganoïden kweken met behulp van een weefselhakselaar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T13:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Leer een geautomatiseerde methode om patiëntafgeleide glioblastoomorganoïden te genereren met een weefselhakselaar. Deze aanpak vermindert de productietijd met bijna 70% en behoudt de kenmerken van de oorspronkelijke tumor voor effectieve geneesmiddelen- en immunotherapiescreening.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF, B-450) Würzburg, het Beierse Centrum voor Kankeronderzoek (BZKF) en de publicatie ondersteund door het Open Access Publishing Fund van de Universiteit van Würzburg. We willen Dagmar Hemmerich en Siglinde Kühnel, beiden afdeling Experimentele Neurochirurgie, Afdeling Neurochirurgie, Universitair Ziekenhuis Würzburg, bedanken voor hun technische ondersteuning. Figuur 1 is gemaakt met behulp van www.biorender.com.

Alle patiënten werden behandeld op de afdeling Neurochirurgie, Universitair Ziekenhuis Würzburg, Duitsland, na schriftelijke geïnformeerde toestemming te hebben gegeven in overeenstemming met de verklaring van Helsinki en zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Universiteit van Würzburg (#22/20-me). Tumorweefselmateriaal van vier GBM-patiënten en één astrocytoom, IDH-mutant, CZS WHO graad 2 patiënten (laaggradig glioom, LGG) (tabel 1) werd verkregen uit een operatie en verwerkt met behulp van het volgende protocol. Het geautomatiseerde proces van het genereren van BOB's met behulp van een weefselhakmolen wordt aangeduid als chopper (C) en het proces van het handmatig snijden van het weefsel met twee scalpels onder microscopische controle als handmatig (M). Zes secties van gelijke grootte (1-2cm3) werden ontleed uit het tumormonster, vervolgens werd elk in tweeën gesneden en homogeen verwerkt met behulp van de twee methoden. Vanwege de eerder genoemde intratumorale heterogeniteit werd voor elke benadering één plaat met 6 putjes gegenereerd van elke patiënt, waarbij elk putje BOB's vertegenwoordigde van een andere plaats binnen de oorspronkelijke tumor. Beide procedures vonden plaats onder een laminaire luchtstroomkast en alle gebruikte instrumenten werden voor gebruik gesteriliseerd. Het overzicht van de aanpak wordt geïllustreerd in figuur 1.
1. Bereiding van agaroseblokken (alleen voor de C-benadering, optioneel)
<ol><li>Vul 50 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een bekerglas, voeg een tablet agarose toe (zie Materiaaltabel) en meng goed tot het gesuspendeerd is.</li>
	<li>Verwarm het mengsel 30-40 s in de magnetron, vermijd koken. Koel het mengsel vervolgens af tot het 47 °C bereikt.</li>
	<li>Giet het agarosemengsel in een afgesloten cilindervormige gietvorm en vermijd luchtbelvorming. Koel de worp onmiddellijk af met een bevroren (-20 °C) klem of door het gedurende 30 minuten op droogijs te leggen.</li>
</ol>2. Verwerking van het tumormateriaal
<ol><li>Maak een doos met ijs klaar om het tumormateriaal gekoeld te houden op weg van de operatiekamer naar het laboratorium.</li>
	<li>Breng het tumorweefsel (4-5 cm³) over in een steriele buis van 50 ml met 25 ml Hibernate A (zie Materiaaltabel) die de tumor bedekt en plaats de buis in de ijsbox.</li>
	<li>Breng onder een laminaire luchtstroomkast het tumormateriaal samen met de Hibernate A over in een gesteriliseerde glazen petrischaal.</li>
	<li>Verwijder het necrotische weefsel en ontleed de bloedvaten zorgvuldig met behulp van een scalpel en een weefseltang onder microscopisch toezicht. Identificeer necrotisch weefsel aan de hand van hemorragische gebieden die een bruinachtige tint vertonen als gevolg van bloedingen, of weefsel dat er bleker of witter uitziet ten opzichte van het aangrenzende levensvatbare weefsel. Let op dat u het weefsel niet samenknijpt of verstoort.</li>
	<li>Snijd het tumormateriaal in zes stukken met een grootte van ongeveer 1-2 cm3. Verdeel de stukjes over plastic petrischaaltjes (n = 6) die vooraf gevuld zijn met 3 ml H-GPSA-medium (tabel 2), elk22. Zet de petrischaaltjes op ijs.</li>
</ol>3. Instellen van de tissue chopper
<ol><li>Plaats het mes zoals beschreven in de handleiding van de fabrikant23.</li>
	<li>Stel de plakdikte in op 0,45-0,50 mm. Stel de meskracht in op gemiddeld. Zet de ontgrendelingsknop van de tafel in de "start"-modus.</li>
</ol>4. Verwerking van de stukjes tumorweefsel
<ol><li>Tumorweefsel bewerken met de chopper (C-methode)<ol><li>Snijd de agaroseblokken in cilinders van 2 cm lengte en lijm een van deze cilinders met behulp van histoacryllijm op de ronde plastic schaal van de hakmolen (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Maak met een scalpel een verdieping in de agarosecilinder en plaats vervolgens het tumorweefsel uit het eerste putje (stap 2.5) in deze put. OPMERKING: Het tumormateriaal moet voorzichtig worden behandeld en mag niet in de opening worden geperst of geduwd. De opening moet groot genoeg zijn om gemakkelijk in de tumor te passen, maar klein genoeg om het tumormateriaal stabiel te houden tijdens het snijproces. Stappen 4.1.1. en 4.1.2. zijn optioneel.</li>
		<li>Plaats de kunststof schijf op de montageschijf van de snijtafel (zie Tabel met materialen).</li>
		<li>Schakel de hakmolen in en druk op de resetknop . De hakselaar begint nu te snijden (eerste ronde). De machine stopt automatisch nadat de tafel het einde heeft bereikt en zowel agarose als tumorweefsel in de gewenste diameter zijn gesneden.</li>
		<li>Draai de montageschijf 90° en zet vervolgens de ontgrendelingstafelknop in de startmodus.</li>
		<li>Druk op de resetknop en laat de machine het weefsel opnieuw snijden, waardoor rechthoekig weefsel ontstaat (tweede ronde).</li>
		<li>Verwijder de plastic schijf met het verwerkte materiaal en draai alleen het tumorweefsel voorzichtig 90° met een weefselspatel.</li>
		<li>Plaats de plastic schijf op de snijtafel, stel vervolgens de ontgrendelingstafelknop in op de startmodus en druk op de resetknop voor een laatste snijronde (derde ronde).</li>
		<li>Schakel de hakmolen uit en verwijder de plastic schijf. Reinig de hakmolen en de messen.</li>
		<li>Gebruik een enkelkanaalspipet van 5 ml om het verwerkte materiaal samen met het medium in de pipet op te zuigen en de suspensie terug in de schaal te spoelen.</li>
		<li>Herhaal de vorige stap 2-3 keer om het weefsel goed te scheiden.</li>
		<li>Plaats de petrischaal terug op ijs en herhaal de stappen (4.1.1-4.1.12.) met de andere 5 schalen van elke tumor.</li>
	</ol></li>
	<li>Tumorweefsel handmatig bewerken (M-methode)<ol><li>Breng het tumorweefsel over van de eerste plastic petrischaal (stap 2.5) samen met 3 ml H-GPSA-medium (tabel 2) in een glazen petrischaal. Ontleed het segment handmatig onder de microscoop in secties van 0,5 mm met behulp van twee scalpels.</li>
		<li>Breng het ontlede weefsel terug naar de plastic petrischaal met behulp van een pipet van 2 ml.</li>
		<li>Herhaal de stappen (4.2.1.-4.2.3.) voor de tumorsecties in de andere vijf petrischaaltjes (stap 2.5).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Het wassen van het tumorweefsel
<ol><li>Kantel elke petrischaal tot 45° omhoog en wacht 30 seconden tot de tumorbrokken naar de bodem van de schaal zinken.</li>
	<li>Zuig voorzichtig 2,5 ml van het H-GPSA-medium (tabel 2) op met behulp van een pipet van 1 ml en let erop dat u geen tumorweefsel opneemt.</li>
	<li>Voeg 2 ml RBC's lysisbuffer (zie Materiaaltabel) toe aan elk monster. De verwerkte tumorstukken moeten volledig worden afgedekt door lysisbuffer.</li>
	<li>Plaats de 6 schaaltjes gedurende 10 minuten op een laboratoriummachine op lage snelheid.</li>
	<li>Zuig voorzichtig 2 ml van de lysisbuffer op om geen tumorweefsel op te nemen.</li>
	<li>Herhaal de vorige wasstappen (stap 5.1-5.5) twee keer met 2 ml H-GPSA-medium (tabel 2) in plaats van lysisbuffer.</li>
</ol>6. Het kweken van het tumorweefsel
<ol><li>Zuig het H-GPSA-medium (tabel 2) uit elk schaaltje op en vervang het door 4 ml BOB-medium (tabel 2).</li>
	<li>Breng de weefselbrokken van elk schaaltje over naar een respectievelijke put van een ultralaag opzetstuk met 6 putjes (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Plaats de plaat op een orbitale schudder in een incubator en incubeer gedurende 2-4 weken bij 37 °C, 5% CO2 en 150 tpm.</li>
	<li>Voer om de twee dagen een halve mediumwissel uit door 2 ml medium uit elk putje op te zuigen en te vervangen door 2 ml vers BOB-medium (tabel 2) dat is voorverwarmd tot 37 °C.</li>
	<li>Observeer het weefsel onder de microscoop (morfologie, groei, gemiddelde kleur) en snijd groeiende BOB's (>0,7 mm) of zelfklevend weefsel om weefselhypoxie te voorkomen.<ol><li>Breng hiervoor de BOB's over van de ultralage bevestigingsput naar een gesteriliseerde glazen petrischaal en gebruik een scalpel om te snijden. Als alternatief kunnen zelfklevende BOB's worden opgelost door ze op te zuigen met een pipet van 1 ml. Pas op dat u niet in de BOB's knijpt en ga er voorzichtig mee om.</li>
	</ol></li>
	<li>Evalueer de vorming van de BOB door de BOB om de twee dagen te tellen en controleer grondig op de gewenste ronde morfologie (Figuur 2).</li>
</ol>7. Bevestiging en inbedding van de BOB's
<ol><li>Repareer twee BOB's uit elk putje van elke patiënt met 4% formaline gedurende 24 uur na 6 weken kweek.</li>
	<li>Dompel de vaste BOB's onder in neutraal gebufferde (natriumfosfaat) formaline tot ze zijn ingebed.</li>
	<li>Plaats elke BOB in een cassette (zie Materiaaltabel) voor verdere verwerking.</li>
	<li>Start een uitdrogingsproces door de cassette onder te dompelen in de volgende oplossingen, zoals vermeld in de onderstaande opmerking: OPMERKING: 50% ethanol gedurende 20 min, 70% ethanol gedurende 20 min, 80% ethanol gedurende 20 min, 96% ethanol gedurende 20 min, 100% ethanol gedurende 20 min, 100% ethanol gedurende 30 min, 100% ethanol + chloroform (verhouding 1:1) gedurende 30 min, 100% ethanol + chloroform (verhouding 1:1) gedurende 30 minuten, Absolute chloroform gedurende 30 min, Absolute chloroform gedurende 30 min, Paraffine gedurende 30 min, Paraffine gedurende 30 min met behulp van de STP 120.</li>
	<li>Veranker de gedehydrateerde BOB's in paraffinewas bij 58-60 °C.</li>
	<li>Snijd de ingebedde BOB's in plakjes met een dikte van 2,5 μm en monteer ze op objectglaasjes om ze te kleuren.</li>
</ol>8. Immunofluorescentie kleuring
<ol><li>Monteer de BOB's na 6 weken kweek.</li>
	<li>Voer vervolgens dubbele kleuring uit tegen gliaal fibrillair zuur eiwit (GFAP, verdunning: 1:100) en de proliferatiemarker Ki67 (verdunning: 1:1000) (zie materiaaltabel), zoals eerder gemeld22.</li>
	<li>Evalueer op dezelfde manier apoptose door BOB's dubbel te kleuren tegen GFAP en anti-caspase-3 (CC3, verdunning: 1:400) (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Leg beelden van de BOB's vast met een fluorescentiemicroscoop met een vergroting van 40x.</li>
	<li>Analyseer de afbeeldingen op GFAP-, Ki67- en CC3-positieve cellen, evenals GFAP/Ki67- en GFAP/CC3-dubbelpositieve cellen.</li>
	<li>Gebruik het open-source programma Fiji (ImageJ-win 32) voor beeldanalyse.</li>
</ol>9. Evaluatie en data-analyse
<ol><li>Maak dagelijks microscopisch kleine helderveldfoto's tijdens de eerste week van de kweek met standaardinstellingen en een vergroting van 5x.</li>
	<li>Observeer de morfologische veranderingen en volg het rijpingsproces in zowel handmatige als geautomatiseerde verwerkingsbenaderingen.</li>
	<li>Voer morfologische analyse uit met behulp van de microscoop in standaard helderveldmodusinstellingen.</li>
	<li>Evalueer het PDO-nummer en de morfologie tijdens de eerste 4 weken van de kweek in BOB's van alle vijf patiënten.</li>
	<li>Verkrijg drie metingen van elke PDO-telling van elke patiënt om de gemiddelde en standaardfout van het gemiddelde (SEM) te berekenen.</li>
	<li>Onderzoek proliferatie en apoptose in BOB's van drie patiënten.</li>
	<li>Analyseer de gegevens met behulp van een in de handel verkrijgbaar statistisch softwarepakket (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Pas Students-T- en Mann-Whitney U-tests toe om verschillen te bepalen tussen het handmatig en geautomatiseerd genereren van PDO's in termen van aantal PDO's, proliferatie en apoptose.</li>
</ol>

Afleiding van 3D-glioomorganoïden uit door hakselaars verwerkte patiënttumoren

<ol><li>Gatto, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDH+inhibitors+and+beyond%3A+the+cornerstone+targeted+glioma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Diagn+Ther%22%5BJournal%5D)">IDH inhibitors and beyond: the cornerstone targeted glioma treatment.</a> Mol Diagn Ther. 25 (4), 457-473 (2021).</li>
<li>Buckner, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+plus+Procarbazine%2C+CCNU%2C+and+Vincristine+in+low-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiation plus Procarbazine, CCNU, and Vincristine in low-grade glioma.</a> N Engl J Med. 374 (14), 1344-1355 (2016).</li>
<li>Grochans, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+glioblastoma+multiforme-literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of glioblastoma multiforme-literature review.</a> Cancers (Basel). 14 (10), 2412(2022).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%29%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma).</a> N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Herrlinger, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lomustine-temozolomide+combination+therapy+versus+standard+temozolomide+therapy+in+patients+with+newly+diagnosed+glioblastoma+with+methylated+MGMT+promoter+%28CeTeG%2FNOA-09%29%3A+a+randomised%2C+open-label%2C+phase+3+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Lomustine-temozolomide combination therapy versus standard temozolomide therapy in patients with newly diagnosed glioblastoma with methylated MGMT promoter (CeTeG/NOA-09): a randomised, open-label, phase 3 trial.</a> Lancet. 393 (10172), 678-688 (2019).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+tumor-treating+fields+plus+maintenance+temozolomide+vs+maintenance+temozolomide+alone+on+survival+in+patients+with+glioblastoma%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Effect of tumor-treating fields plus maintenance temozolomide vs maintenance temozolomide alone on survival in patients with glioblastoma: a randomized clinical trial.</a> Jama. 318 (23), 2306-2316 (2017).</li>
<li>Desbaillets, N., Hottinger, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+in+glioblastoma%3A+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy in glioblastoma: a clinical perspective.</a> Cancers (Basel). 13 (15), 3721(2021).</li>
<li>Gularyan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+inter-+and+intratumoral+heterogeneity+of+glioblastoma+using+TOF-SIMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Investigation of inter- and intratumoral heterogeneity of glioblastoma using TOF-SIMS).</a> Mol Cell Proteomics. 19 (6), 960-970 (2020).</li>
<li>Brennan, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+somatic+genomic+landscape+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The somatic genomic landscape of glioblastoma.</a> Cell. 155 (2), 462-477 (2013).</li>
<li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes Dev. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Pollard, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+stem+cell+lines+expanded+in+adherent+culture+have+tumor-specific+phenotypes+and+are+suitable+for+chemical+and+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Glioma stem cell lines expanded in adherent culture have tumor-specific phenotypes and are suitable for chemical and genetic screens.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 568-580 (2009).</li>
<li>Timerman, D., Yeung, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+confusion+of+glioma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identity confusion of glioma cell lines.</a> Gene. 536 (1), 221-222 (2014).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li>
<li>Kopper, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organoid+platform+for+ovarian+cancer+captures+intra-+and+interpatient+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity.</a> Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).</li>
<li>Lee, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+evolution+and+drug+response+in+patient-derived+organoid+models+of+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer.</a> Cell. 173 (2), 515-528 (2018).</li>
<li>Bian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+cerebral+organoids+model+brain+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered cerebral organoids model brain tumor formation.</a> Nat Methods. 15 (8), 631-639 (2018).</li>
<li>Ogawa, J., Pao, G. M., Shokhirev, M. N., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+model+using+human+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma model using human cerebral organoids.</a> Cell Rep. 23 (4), 1220-1229 (2018).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Rep. 26 (12), 3203-3211 (2019).</li>
<li>da Silva, B., Mathew, R. K., Polson, E. S., Williams, J., Wurdak, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+glioblastoma+spheroid+infiltration+of+early-stage+cerebral+organoids+models+brain+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Spontaneous glioblastoma spheroid infiltration of early-stage cerebral organoids models brain tumor invasion.</a> SLAS Discov. 23 (8), 862-868 (2018).</li>
<li>Hubert, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+organoid+culture+system+derived+from+human+glioblastomas+recapitulates+the+hypoxic+gradients+and+cancer+stem+cell+heterogeneity+of+tumors+found+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional organoid culture system derived from human glioblastomas recapitulates the hypoxic gradients and cancer stem cell heterogeneity of tumors found in vivo.</a> Cancer Res. 76 (8), 2465-2477 (2016).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+patient-derived+glioblastoma+organoid+model+and+biobank+recapitulates+inter-+and+intra-tumoral+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A patient-derived glioblastoma organoid model and biobank recapitulates inter- and intra-tumoral heterogeneity.</a> Cell. 180 (1), 188-204 (2020).</li>
<li>Nickl, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma-derived+three-dimensional+ex+vivo+models+to+evaluate+effects+and+efficacy+of+tumor+treating+fields+%28TTFields%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma-derived three-dimensional ex vivo models to evaluate effects and efficacy of tumor treating fields (TTFields).</a> Cancers (Basel). 14 (21), 5177(2022).</li>
<li>Tissue Chopper. Lafayette Instrument. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://lafayetteinstrument.com">http://lafayetteinstrument.com</a> (2023).</li>
<li>Klein, E., Hau, A. C., Oudin, A., Golebiewska, A., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+organoids%3A+pre-clinical+applications+and+challenges+in+the+context+of+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma organoids: pre-clinical applications and challenges in the context of immunotherapy.</a> Front Oncol. 10, 604121(2020).</li>
<li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+organoids+and+orthotopic+xenografts+of+primary+and+recurrent+gliomas+represent+relevant+patient+avatars+for+precision+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Patient-derived organoids and orthotopic xenografts of primary and recurrent gliomas represent relevant patient avatars for precision oncology.</a> Acta Neuropathol. 140 (6), 919-949 (2020).</li>
<li>Bougnaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+crosstalk+between+tumour+and+brain+parenchyma+instructs+histopathological+features+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Molecular crosstalk between tumour and brain parenchyma instructs histopathological features in glioblastoma.</a> Oncotarget. 7 (22), 31955-31971 (2016).</li>
<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nat Cell Biol. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
<li>Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+slice+preparation%3A+a+tribute+to+the+pioneer+Henry+McIlwain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain.</a> J Neurosci Methods. 59 (1), 5-9 (1995).</li>
<li>Kato, H., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+preparing+in+vitro+slices+of+cat%27s+visual+cortex+for+electrophysiological+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A technique for preparing in vitro slices of cat's visual cortex for electrophysiological experiments.</a> J Neurosci Methods. 4 (1), 33-38 (1981).</li>
<li>Teyler, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slice+preparation%3A+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Bull%22%5BJournal%5D)">Brain slice preparation: hippocampus.</a> Brain Res Bull. 5 (4), 391-403 (1980).</li>
<li>Schulz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+culture+of+organotypic+hippocampal+slices+for+the+analysis+of+brain+metastasis+and+primary+brain+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and culture of organotypic hippocampal slices for the analysis of brain metastasis and primary brain tumor growth.</a> Methods Mol Biol. 2294, 59-77 (2021).</li>
<li>Driehuis, E., Gracanin, A., Vries, R. G. J., Clevers, H., Boj, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+pancreatic+organoids+from+normal+tissue+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Establishment of pancreatic organoids from normal tissue and tumors.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100192(2020).</li>
<li>Driehuis, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+cancer+organoids+recapitulate+disease+and+allow+personalized+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).</li>
<li>Neal, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+of+the+tumor+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling of the tumor immune microenvironment.</a> Cell. 175 (7), 1972-1988 (2018).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+transformation+of+diverse+gastrointestinal+tissues+in+primary+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Oncogenic transformation of diverse gastrointestinal tissues in primary organoid culture.</a> Nat Med. 20 (7), 769-777 (2014).</li>
<li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li>
<li>Zhao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Organoids.</a> Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).</li>
<li>Toh, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3D+mammalian+cell+perfusion-culture+system+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A novel 3D mammalian cell perfusion-culture system in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7 (3), 302-309 (2007).</li>
<li>Zhang, C., Zhao, Z., Abdul Rahim, N. A., van Noort, D., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+human-on-chip%3A+culturing+multiple+cell+types+on+a+chip+with+compartmentalized+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Towards a human-on-chip: culturing multiple cell types on a chip with compartmentalized microenvironments.</a> Lab Chip. 9 (22), 3185-3192 (2009).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nat Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Kengla, C., Atala, A., Sang Jin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+of+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Essentials+of+3D+Biofabrication+and+Translation%22%5BJournal%5D)">Bioprinting of organoids.</a> Essentials of 3D Biofabrication and Translation. , 271-282 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deze studie presenteert een snelle en efficiënte methode voor het genereren van BOB's. GBM blijft een uitdagende tumor om te behandelen, vaak gekenmerkt door terugval en een hoge ziektelast 3,6. Er is dringend behoefte aan innovatieve therapeutische benaderingen, aangezien veelbelovende resultaten die in vitro worden waargenomen vaak niet in vivo werkzaam zijn tijdens fase I-onderzoeken. Een van de redenen voor deze discrepantie zou het beperkte vermogen kunnen zijn van van patiënten afkomstige onsterfelijke cellijnen, gekweekt in monolaagculturen, om de complexe cel-celinteracties en genetische eigenschappen van de ouderlijke tumor weer te geven. Gezien de hoge inter- en intratumorale heterogeniteit van GBM 8,9, hebben gepersonaliseerde gerichte therapieën de voorkeur en kunnen ze veelbelovend zijn voor toekomstige toepassingen. In tegenstelling tot 2D-aanhangende cellijnen hebben organoïden het vermogen om de eigenschappen van het ouderweefsel te behouden21, maar complexe cel-celinteracties tussen de tumor en de normale hersenen zijn van het grootste belang en kunnen mogelijk over het hoofd worden gezien door dit model. Het handmatig genereren van BOB's is echter een tijdrovend proces en weefselbeschadiging veroorzaakt door knijpen met scalpels tijdens het snijden kan een succesvolle BOB-groei belemmeren. Daarom werd een geautomatiseerde methode geoptimaliseerd met behulp van een weefselhakmolen om met minder tijd en moeite een groter aantal BOB's te genereren. Bovendien toonden we aan dat de totale proliferatie- en apoptosepercentages niet verschilden tussen de twee benaderingen.
De C-benadering is eenvoudig, eenvoudig te implementeren en maakt het mogelijk om een groter aantal BOB's te genereren (figuur 3). De rotatie van het weefsel tussen de tweede en derde hakronde werd geïdentificeerd als een kritieke stap in het protocol. In dit stadium heeft het weefsel zijn integriteit al verloren en kan het gemakkelijk uit elkaar vallen, wat resulteert in grotere stukken die extra snijden of handmatige dissectie onder de microscoop vereisen. Terwijl de geautomatiseerde chopperbenadering een vooraf ingestelde snijgrootte met grotere nauwkeurigheid mogelijk maakt, mist de handmatige benadering precisie bij het bepalen van de grootte van BOB's, wat leidt tot ongelijk gevormde en gedimensioneerde BOB's, wat een nadeel is voor vergelijkende screening van geneesmiddelen (Figuur 2). Desalniettemin wordt met de voorgestelde methode de standaardisatie van het aantal cellen per BOB niet bereikt, wat mogelijk een nadeel vormt voor gestandaardiseerde protocollen voor het screenen van geneesmiddelen. De voor- en nadelen van verschillende technieken voor het genereren van organoïden 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42 en hun toepassingen zijn samengevat in tabel 3.
GBM-weefsel kan variëren in consistentie, variërend van taai (infiltratiezone) tot zacht (necrotische kern), wat uitdagingen kan opleveren voor de geautomatiseerde chopperbenadering. Als het weefsel te taai is, kan de hakselaar het samenknijpen en beschadigen, terwijl te zacht weefsel kan worden platgedrukt. Het gekozen weefsel vertoonde onderscheidende kenmerken, waaronder een gemiddeld niveau van stevigheid, sporadisch met een roze-grijze kleur in plaats van bruine of gele verkleuring. Weefsel met een sponsachtige en gemakkelijk kruimelige textuur vertoonde superieure conservering in de agaroseblokken, terwijl buitengewoon delicaat en vloeibaar tumorweefsel werd weggelaten uit de bemonsteringsprocedure. De chopper-benadering maakte het echter mogelijk om met succes een groter aantal BOB's te genereren in vergelijking met de handmatige aanpak, zelfs met weefsel met een suboptimale consistentie. De belangrijkste oplossing is om nauwe interactie te onderhouden met de chirurg die de tumorresectie uitvoert om weefsel uit verschillende delen van de tumor te verwerken. In gevallen van suboptimale weefselconsistentie was het handmatig bewerken van het weefsel onder de microscoop een nuttige toevoeging na het hakken. Om rekening te houden met heterogeniteit, werd het tumorweefsel aanvankelijk verdeeld in zes segmenten, die vervolgens elk werden gehalveerd voor de C- of M-benadering. Binnen deze zes afzonderlijke secties wordt een aanzienlijke mate van heterogeniteit verwacht. Bovendien is zelfs binnen de BOB's uit dezelfde sectie of put de aanwezigheid van verschillende subpopulaties aannemelijk.
Als proof of concept werden de proliferatie- en apoptosegegevens gerapporteerd van twee patiënten met GBM en één patiënt met LGG, die geen significante verschillen tussen de twee methoden laten zien. Het genereren van BOB's is niet beperkt tot zeer kwaadaardige hersentumoren, maar kan ook worden toegepast op LGG's. Deze studie benadrukt dat LGG zelden groei in 2D-cultuur vertoont, waardoor de ontwikkeling van een nauwkeurig model voor hun studie zeer waardevol is. Dit protocol is bedoeld om de veelzijdigheid van deze aanpak aan te tonen bij het snel en effectief genereren van BOB's van GBM en LGG.
Over het algemeen zouden BOB's in de toekomst kunnen worden gebruikt voor patiëntgerichte pre-therapeutische tests van gerichte therapieën bij kwaadaardige hersentumoren. Het bieden van een snelle en efficiënte methode voor geïndividualiseerde screening van geneesmiddelen is cruciaal, aangezien tumorprogressie snel optreedt en reddingsbehandelingsopties hard nodig zijn. Als volgende stap zou het PDO-model kunnen worden geëvalueerd met verschillende immunotherapeutische benaderingen om echte behandelingsresponsen beter na te bootsen. In de toekomst zouden BOB's kunnen worden gebruikt om geavanceerde conclusies te trekken over de noodzaak van verdere verkenning en evaluatie van therapieën in een klinische setting.

Laaggradige gliomen (LGG's) zijn een groep relatief zeldzame hersentumoren die zich doorgaans presenteren als langzaam groeiend en minder agressief in vergelijking met hooggradige gliomen zoals glioblastoom. Ze kunnen zowel bij volwassenen als bij kinderen voorkomen, met een iets hogere prevalentie bij volwassenen. De exacte prevalentie verschilt per regio en populatie, maar LGG's zijn verantwoordelijk voor ongeveer 15%-20% van alle primairehersentumoren1. Behandelingsstrategieën voor LGG's omvatten vaak een combinatie van chirurgie, bestralingstherapie en chemotherapie, gericht op het maximaliseren van tumorresectie met behoud van de neurologische functie. De behandeling van LGG's kan complex zijn en de keuze van de therapie kan afhangen van factoren zoals de locatie van de tumor en moleculairekenmerken2. Vooruitgang in het begrijpen van de genetische en moleculaire onderbouwing van LGG's heeft geleid tot meer gerichte therapieën, en lopend onderzoek blijft behandelingsbenaderingen verfijnen.
Glioblastoom, IDH-wildtype, CNS WHO graad 4 (GBM), is daarentegen de meest voorkomende primaire hersentumor bij volwassenen, met een incidentie tussen 3,19-4,17 gevallen per 100.000 persoonsjaren3. GBM veroorzaakt symptomen zoals hoofdpijn, toevallen, focale neurologische stoornissen, veranderingen in persoonlijkheid en verhoogde intracraniale druk. De standaardbehandeling voor GBM bestaat uit debulking van de tumor, indien mogelijk, gevolgd door bestralingstherapie in combinatie met Temozolomide4. Bovendien kan het combineren van temozolomide en lomustine de mediane totale overlevingskans verbeteren bij patiënten met O 6-methylguanine-methyltransferase (MGMT)-promotormethylering5. Ondanks deze recente therapeutische benaderingen blijft GBM echter een ongeneeslijke ziekte met een slechte prognose, gekenmerkt door een mediane totale overlevingskans van 16 maanden tot 20,9 maanden wanneer Tumor Treating Fields (TTFields) wordt toegevoegd 3,6. Verschillende immunotherapeutische benaderingen zijn onderzocht bij GBM, maar toonden een beperkte werkzaamheid in vivo. Bovendien belemmeren klinische en preklinische beperkingen therapeutische doorbraken7. Het opstellen van een geschikt en realistisch ex vivo-model was een uitdaging vanwege de inter-8 en intratumorale9 heterogeniteit van GBM.
Conventionele 2-dimensionale (2D) patiëntcellijnen vertegenwoordigen homogene celpopulaties en zijn geschikt voor high-throughput screening van geneesmiddelen. Van patiënten afkomstige en onsterfelijke cellijnen slagen er echter niet in om GBM adequaat na te bootsen vanwege verschillen in groeiomstandigheden en afwijkingen in genotypische en fenotypische kenmerken na meerdere passages 10,11,12.
Aan de andere kant zijn 3D-organoïdemodellen onlangs naar voren gekomen als veelbelovende systemen die de fenotypische en moleculaire heterogeniteit van orgaan- en verschillende soorten kanker repliceren 13,14,15,16,17,18. In de context van GBM zijn cerebrale organoïden genetisch gemodificeerd om tumorachtige kenmerken te simuleren16,17 of samen met GSC's of sferoïden gekweekt om tumorcelinfiltratie te induceren18,19. Hoewel van patiënten afgeleide GBM-organoïden gekweekt met Matrigel en EGF/bFGF GBM-kenmerken vertonen zoals stamcelheterogeniteit en hypoxie20, blijft het onzeker in hoeverre dit model de belangrijkste moleculaire eigenschappen van de neoplasmata van patiënten kan weergeven.
Patiënt-afgeleide GBM-organoïden (BOB's) zijn veelbelovende modellen die de overheersende kenmerken van hun analoge oudertumoren kunnen behouden, waaronder histologische kenmerken, cellulaire diversiteit, genexpressie en mutatieprofielen. Bovendien worden ze snel geïnfiltreerd bij implantatie in de hersenen van volwassen knaagdieren, wat een realistisch model biedt voor het testen van medicijnen en gepersonaliseerde therapie. Het handmatig ontleden van tumorweefsel om BOB's te genereren is echter tijdrovend en kostbaar. Daarom bestaat er een dringende behoefte aan een snelle methode die grote aantallen BOB's kan produceren, waardoor een uitgebreide beoordeling van verschillende therapeutische benaderingen mogelijk wordt die veelbelovend zijn voor geïndividualiseerde drugstests. Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het rechtstreeks vervaardigen van BOB's uit vers ontleed tumorweefsel met behulp van een automatische weefselhakselaar. Bovendien werden BOB's die met deze methode werden gegenereerd, vergeleken met handmatig ontlede BOB's van dezelfde patiënten in termen van PDO-aantal, morfologische kenmerken, apoptose en proliferatie van tumorcellen.

<table><tbody><tr><td>2-mercaptoethanol (1000x)</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>30% formaldehyde methanol-vrij</td><td>Carl Roth</td><td>4235.1</td><td>Gebazigd in 4% concentratie</td></tr><tr><td>70% ethanol oplossing</td><td></td><td></td><td>Voor sterilisatie&nbsp;</td></tr><tr><td>Agarose tabletten 0,5 g</td><td>Carl Roth</td><td>HP67.7</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B 250 &micro;g/mL</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td></td></tr><tr><td>Anatomische pincetten</td><td>&nbsp;Hartstein</td><td>&nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>Anatomische spatel</td><td>&nbsp;Hartstein</td><td>&nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement zonder vitamine A (50x)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie cassette met deksel</td><td>Resolab</td><td>37001-b</td><td></td></tr><tr><td>Blades voor McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden instruments</td><td>Model TC752-1</td><td></td></tr><tr><td>CC3 antilichaam (Asp 175)</td><td>Cells signaling technology</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Eenmalige scalpel</td><td>&nbsp;Feather</td><td>&nbsp;0200130015</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td>Gibco</td><td>15230089</td><td>Om het formaldehyde te verdunnen</td></tr><tr><td>Dulbecco's Gemodificeerd Eagleserum Nutriëntenmengsel (DMEM) F-12 (1:1) (1x)</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>Inclusief L-Glutamine en 15 mM HEPES</td></tr><tr><td>Dulbecco's Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8537-500ML</td><td>Gemodificeerd, zonder calcium, chloor en magnesiumchloride, vloeibaar, steriel gefilterd, geschikt voor celkweek</td></tr><tr><td>eBioscience 1x RBC Lysis Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>433357</td><td></td></tr><tr><td>Falconbuis 50 ml Cellstar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>GFAP antilichaam</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc33673</td><td></td></tr><tr><td>Glasbeker</td><td>&nbsp;N/A</td><td>&nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>Glas petrischaal</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Heracell 240i CO2 Incubator</td><td>Thermo scientific</td><td>51032875</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Biologische Veiligheidscabinet</td><td>Thermo scientific</td><td>5016643</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate-A</td><td>Gibco</td><td>A1247501</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl lijm</td><td>B. Braun chirurgisch</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>Human Insulin, Oplossing</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-360248</td><td></td></tr><tr><td>IJsbox</td><td>&nbsp;N/A</td><td>&nbsp;N/A</td><td></td></tr><tr><td>Ki67 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab16667</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Cavey Laboratory Engineering</td><td>51350V</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B</td><td>Leica</td><td>DMI6000B</td><td>Voor helderveld en immunofluorescentie foto's</td></tr><tr><td>Stereozoom microscoop S9D</td><td>Leica</td><td>W841832</td><td>Voor handmatig snijden en organoïd monitoring</td></tr><tr><td>Microgolfoven</td><td>Bosch</td><td>N/A</td><td>Om de agarose oplossing te verwarmen</td></tr><tr><td>Montage plastic schijven</td><td>Cavey Laboratory Engineering</td><td>51354</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal (1x)</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale schudmachine Rotamax120</td><td>Heidolph</td><td>10304491</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof petrischalen Cellstar</td><td>greiner bio-one</td><td>628160</td><td>n = 12</td></tr><tr><td>Eenkanaals pipet 1000 &micro;m</td><td>Eppendorf</td><td>4924000010</td><td></td></tr><tr><td>Eenkanaals pipet 5000 &micro;m</td><td>Eppendorf</td><td>EP3123000276</td><td></td></tr><tr><td>Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) versie 23.0</td><td>IBM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surgipath Paraplast</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td>Inbeddingsmedium</td></tr><tr><td>Ultra-lage hechting Nucleon Sphera 6-well plaat</td><td>Thermo Scientific</td><td>174932</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo van patiënten afkomstige glioomorganoïden kweken met behulp van een weefselhakselaar

Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper

Glioblastoom, IDH-wildtype, CZS WHO graad 4 (GBM) is een primaire hersentumor die geassocieerd is met een slechte overleving van de patiënt ondanks agressieve behandeling. Het ontwikkelen van realistische ex vivo modellen blijft een uitdaging. Patiënt-afgeleide 3-dimensionale organoïde (PDO) modellen bieden innovatieve platforms die de fenotypische en moleculaire heterogeniteit van GBM vastleggen, met behoud van de belangrijkste kenmerken van de oorspronkelijke tumoren. Handmatige dissectie voor het genereren van BOB's is echter tijdrovend, duur en kan resulteren in een aantal onregelmatige en ongelijke BOB's. Deze studie presenteert een innovatieve methode voor de productie van BOB's met behulp van een geautomatiseerde weefselhakselaar. Tumormonsters van vier GBM- en één astrocytoom-, IDH-mutant, CZS WHO-graad 2-patiënten werden zowel handmatig als met behulp van de weefselhakselaar verwerkt. Bij de handmatige aanpak werd het tumormateriaal ontleed met scalpels onder microscopische controle, terwijl de weefselhakmolen onder drie verschillende hoeken werd gebruikt. Na kweek op een orbitale shaker bij 37 °C werden morfologische veranderingen geëvalueerd met behulp van helderveldmicroscopie, terwijl proliferatie (Ki67) en apoptose (CC3) na 6 weken werden beoordeeld door middel van immunofluorescentie. De weefselchoppermethode verkortte bijna 70% van de productietijd en resulteerde in een significant hoger gemiddeld aantal BOB's in vergelijking met het handmatig bewerkte weefsel vanaf de tweede week (week 2: 801 vs. 601, P = 0,018; week 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; en week 4:1195 vs. 784, P < 0,01). Kwaliteitsbeoordeling onthulde vergelijkbare percentages van tumorcelapoptose en proliferatie voor beide productiemethoden. Daarom biedt de geautomatiseerde weefselhakselmethode een efficiëntere aanpak in termen van tijd en PDO-opbrengst. Deze methode is veelbelovend voor het screenen van geneesmiddelen of immunotherapie bij GBM-patiënten.

Vier patiënten met GBM en één met LGG werden geïncludeerd na pathologische bevestiging door een ervaren neuropatholoog (CMM). De meerderheid van de patiënten had een niet-gemethyleerde MGMT-promotor en alle GBM-patiënten waren IDH1- en IDH2-wildtype (tabel 1). Gemiddeld duurde het productieproces 88,8 min (+/- 6,3 min) in de C-benadering en 322 min (+/- 17,2 min) in de M-benadering. Het totale slagingspercentage was 87% in de handleiding en 93% in de chopper-aanpak na 4 weken kweek (n = 5). Bovendien bereikten BOB's afgeleid van de C-groep binnen 1 week de gewenste afgeronde vorm en waren ze volwassen genoeg om te worden gebruikt in in vitro experimenten, terwijl de BOB's van de M-groep meestal scherp en ongedefinieerd bleven (Figuur 2). Het tumorweefsel dat met de C-benadering werd verwerkt, resulteerde in totaal 281 BOB's (gemiddelde per patiënt = 56 +/- 43) na de eerste kweekweek, terwijl 250 BOB's (gemiddelde per patiënt = 50 +/- 41) zich ontwikkelden met de M-benadering. Tijdens de tweede kweekweek leverde het weefsel van alle vijf patiënten hogere BOB-getallen op wanneer ze werden gegenereerd met de C-benadering (801; Gemiddelde per patiënt = 130 +/- 38) vergeleken met de M-benadering (601; Gemiddelde per patiënt = 76 +/- 44; P = 0,018). Tijdens de derde kweekweek verzamelde de C-benadering in totaal 1105 BOB's van alle patiënten (gemiddelde per patiënt = 221 +/- 32) vergeleken met 771 BOB's (gemiddelde per patiënt = 155 +/- 34) in de M-benadering (P = 0,032). Bovendien vormden zich in totaal 1195 BOB's (gemiddelde per patiënt = 239 +/- 50) na vier weken kweek wanneer ze werden gegenereerd met de C-benadering vergeleken met 784 (gemiddelde per patiënt = 157 +/- 36) met behulp van de M-benadering (P < 0,01). Daarom liet de C-methode vanaf de tweede week een significant hoger aantal BOB's zien (figuur 3). Verder werden de relatieve fluctuaties in het aantal BOB's geëvalueerd om de dynamische trends tussen opeenvolgende weken te onderzoeken. Uit de analyse bleek dat het aantal BOB's tijdens de eerste overgang van de eerste naar de tweede week in de C-benadering indrukwekkend sterk toenam (265%), wat wijst op snelle vooruitgang. Vervolgens was er een lagere stijging van het aantal tellingen in de derde week (75%), als gevolg van een tijdelijke aanpassing. De M-benadering daarentegen liet een consistente en gestage toename van het aantal BOB's zien (92% in de tweede week, respectievelijk 67% in de derde week), wat bijdroeg tot een opmerkelijke stabiliteit van de tellingen in de vierde week. Deze consistente opwaartse trend in het aantal BOB's onderstreept de betrouwbaarheid en veerkracht van de C-benadering gedurende de hele observatieperiode.
Twee GBM-patiënten en één LGG-patiënt werden geïncludeerd voor de analyse van astrocytenaantallen (GFAP) in BOB's, PDO-celproliferatie (Ki67) en apoptose (CC3). Het vastgestelde aantal astrocyten vertoonde geen significante verschillen tussen de twee verwerkingsmethoden met een gemiddelde van 43% in de C-benadering en 45% in de M-benadering (Figuur 4 en Figuur 5, Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2). Evenzo waren de proliferatiepercentages binnen de BOB's vergelijkbaar tussen de C-benadering (3%) en de M-benadering (1%). Alleen BOB's gegenereerd met de C-benadering van patiënt 5 vertoonden een proliferatiepercentage van 26% vergeleken met 1% met de M-benadering (P = 0,001; Figuur 4C). Over het algemeen werden lage apoptosepercentages gedetecteerd in BOB's die werden verwerkt met de C-benadering (3%) vergeleken met 2% van de M-benadering voor alle patiënten, die niet significant verschilden (figuur 5C). Bovendien was er geen significant verschil tussen de twee methoden met betrekking tot het aantal astrocyten dat apoptose onderging (Figuur 5D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig01.jpg"> Figuur 1: Grafisch overzicht van het productieproces van patiënt-afgeleide organoïden (PDO's) met behulp van een geautomatiseerde hakselaar versus een handmatige aanpak. De illustratie toont de verschillende betrokken stappen, waaronder (A) monsterafname, (B) dissectie van tumormateriaal, (C) wassen en (D) incubatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig02.jpg"> Figuur 2: BOB-morfologie tijdens de eerste kweekweek. Vergelijking van de vorming van BOB's na dissectie met behulp van zowel de geautomatiseerde hakselaar als de handmatige methode. Schaalbalken = 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig03.jpg"> Figuur 3: Aantal BOB's tijdens de eerste vier weken van de kweek. De x-as geeft de tijd in weken (W) weer, en de y-as het aantal BOB's van de C (blauw) en M (rood) benadering (n = 5). Elk gegevenspunt vertegenwoordigt het gemiddelde aantal, met foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde aangeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig04.jpg"> Figuur 4: Celproliferatiesnelheden binnen BOB's. (A) Representatieve immunofluorescentiebeelden (n = 3) van GFAP-positieve cellen (groen), Ki67-positieve cellen (rood) en DAPI (blauw) in BOB's van patiënten 3, 4 en 5 (tabel 1). Alle BOB's werden verwerkt met behulp van de hakselaar (C) en handmatige (M) methode. Schaalbalken = 100 μm. (B) Vergelijking van de twee methoden met betrekking tot het relatieve aantal GFAP-positieve cellen, (C) Ki67-positieve cellen en (D) Ki67/GFAP-dubbel positieve cellen. Niet-significante resultaten worden aangeduid met "ns". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65952/65952fig05.jpg"> Figuur 5: Apoptosepercentages binnen BOB's. (A) Representatieve immunofluorescentiebeelden (n = 3) van GFAP-positieve cellen (groen), CC3-positieve cellen (rood) en DAPI (blauw) in BOB's van patiënten 3, 4 en 5 (tabel 1). Alle BOB's werden verwerkt met behulp van de hakselaar (C) en handmatige (M) methode. Schaalbalken = 100 μm. (B) Vergelijking van de twee methoden met betrekking tot het relatieve aantal GFAP-positieve cellen, (C) CC3-positieve cellen en (D) CC3/GFAP-dubbel positieve cellen. Niet-significante resultaten worden aangeduid met "ns". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Kenmerken van patiënten en klinische parameters. GBM = glioblastoom, IDH-wildtype, CZS WHO graad 4; LGG = laaggradig glioom; KPS = Karnofsky-prestatiescore; MGMT = O 6-methylguanine-DNA-methyltransferase; IDH1 = isocitraatdehydrogenase 1, IDH2 = isocitraatdehydrogenase 2, ATRX = α-thalassemie/mentale retardatie, X-gebonden gen; M = morfologie; CC = celgetal; p = proliferatie; A = apoptose. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952_Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 2: Gemiddelde composities. H-GPSA = Overwinteren A-Glutamax potloodlijn streptomycine amfotericine B. BOB = Patiënt-afgeleide organoïden DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium. NEAA: niet-essentiële aminozuren. Penstreptokokken: Penicilline/Streptomycine <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/65952_Table%202_updated.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Tabel 3: Overzicht van de gebruikte technieken om celkweekmodellen te genereren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Table%203_updated.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 1: Individuele kanalen voor proliferatiekleuring van BOB's. (A) DAPI (blauw), (B) GFAP-positieve cellen (groen), (C) Ki67-positieve cellen (rood) en (D) overlay-kanaal in BOB's van patiënten 3, 4 en 5. Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Supplementary%20figure1.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur 2: Individuele kanalen voor apoptosekleuring van BOB's. (A) DAPI (blauw), (B) GFAP-positieve cellen (groen), (C) CC3-positieve cellen (rood) en (D) overlaykanaal in BOB's van patiënten 3, 4 en 5. Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65952/Supplementary%20figure2.pdf" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Deze studie introduceert een geautomatiseerde methode om van patiënten afgeleide glioblastoom 3-dimensionale organoïden te genereren met behulp van een weefselhakselaar. De methode biedt een geschikte en effectieve aanpak om dergelijke organoïden te verkrijgen voor therapeutisch onderzoek.

Ex vivo van patiënten afkomstige glioomorganoïden kweken met behulp van een weefselhakselaar

Glioblastoma, IDH-wild type, CNS WHO grade 4 (GBM) is a primary brain tumor associated with poor patient survival despite aggressive treatment. Developing ...

cultivating-ex-vivo-patient-derived-glioma-organoids-using-tissue

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the development of a 3D co-culture system. Mouse brain slices are placed on a membrane, and fluorescently labeled human brain tumor cells are allowed to grow on it. Once the system is ready, it is stained for imaging.

Establishing a Brain Tumor in an Organotypic Slice Co-culture Model

The video demonstrates the generation and maintenance of organotypic slice cultures from glioblastoma tissue. The isolated tissue is embedded in an agarose matrix, and thin sections are obtained using a vibratome. These sections are then placed on permeable membrane inserts within a microplate and cultured in a slice culture maintenance media for long-term maintenance.

Generating and Maintaining Slice Cultures from Human Glioblastoma Tissue

This video describes the preparation and cultivation of brain tumor organoids from single-cell suspension. Using a laminin-rich extracellular matrix as a scaffold and culture media for nutrients, cells are facilitated to multiply and self-organize within the organoid. Consequently, ex vivo organoids are generated, mimicking cellular diversity and the microenvironment of brain tumors.

Generating an Organoid Culture from a Brain Tumor Cell Suspension

Protocol voor vermeerdering van gedissocieerde hoogwaardige glioom chirurgische specimens in serumvrij neurosfeermedium om te selecteren voor cellen met kankerstamcelfenotype. Voor specimens die niet als neurosferen groeien, wordt een alternatief protocol voorgesteld. Een paraffine-inbeddingstechniek voor het behoud van de 3D-neurosfeerarchitectuur voor immunocytochemie wordt beschreven.

Optimalisatie van hoogwaardige glioomcelcultuur van chirurgische specimens voor gebruik in klinisch relevante diermodellen en 3D-immunochemie

Huidige ex vivo modellen van glioblastoom (GBM) zijn niet geoptimaliseerd voor fysiologisch relevant onderzoek naar menselijke tumorinval. Hier presenteren we een protocol voor het genereren en onderhouden van organotypische plakculturen uit vers menselijk GBM-weefsel. Een beschrijving van time-lapse microscopie en kwantitatieve cel migratie analyse technieken wordt verschaft.

Een humane glioblastoom organotypische snijcultuurmodel voor de studie van tumorcellenmigratie en patiëntspecifieke effecten van anti-invasieve medicijnen

Deze studie introduceert en beschrijft protocollen voor het afleiden van twee specifieke menselijke neurale organoïden als een relevant en nauwkeurig model voor het bestuderen van 1) menselijke multiform glioblastoom ontwikkeling binnen menselijke neurale organoïden uitsluitend bij de mens en 2) neuron Dopaminerge differentiatie die een driedimensionale organoïde genereert.

Menselijke neurale Organoïden voor het bestuderen van hersenkanker en neurodegeneratieve ziekten

Hier beschrijven we een methode om glioblastoom (GBM) organoïden te genereren uit primaire patiëntspecimens of van patiënten afgeleide celculturen en deze tot volwassenheid te houden. Deze GBM-organoïden bevatten fenotypisch diverse celpopulaties en recreëren tumormicro-omgevingen ex vivo.

Behoud van humane glioblastoom cellulaire diversiteit ex vivo met behulp van driedimensionale organoïde cultuur

Kuikenembryo's worden gebruikt voor het bestuderen van menselijke glioblastoom (GBM) hersentumoren in ovo en in ex vivo hersenschijfcoculturen. GBM-celgedrag kan worden geregistreerd door time-lapse-microscopie in ex vivo co-culturen en beide preparaten kunnen op het experimentele eindpunt worden geanalyseerd door gedetailleerde 3D-confocale analyse.

Het kuikenembryobrein gebruiken als model voor in vivo en ex vivo analyses van menselijk glioblastoomcelgedrag

IDH1-mutant diffuse laaghangstroomgliomen zijn zeldzame tumoren die moeilijk te kweken zijn. We introduceren een eenvoudige, niet-enzymatische explant-methode die de expressie van IDH1-mutante eiwitten behoudt en culturen maandenlang in stand houdt. Belangrijk is dat deze techniek werkt met diepvriesgeconserveerde tumoren en een waardevolle bron biedt voor glioomonderzoek.

Een protocol voor explantaatculturen van IDH1-mutant diffuse laaggradige gliomen

Hier schetsen we een uitgebreid protocol voor het genereren en gebruiken van in het laboratorium gemanipuleerde glioblastoom-organoïden (LEGO) om genotype-fenotype-afhankelijkheden te onderzoeken en potentiële geneesmiddelen voor de behandeling van glioblastoom te screenen.

In het laboratorium gemanipuleerde glioblastoom organoïdecultuur en screening van geneesmiddelen

Leer een geautomatiseerde methode om patiëntafgeleide glioblastoomorganoïden te genereren met een weefselhakselaar. Deze aanpak vermindert de productietijd met bijna 70% en behoudt de kenmerken van de oorspronkelijke tumor voor effectieve geneesmiddelen- en immunotherapiescreening.

Ex vivo van patiënten afkomstige glioomorganoïden kweken met behulp van een weefselhakselaar

Meer video's verkennen