Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein
26 januari 2024
Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.
Het menselijk brein is een complex orgaan dat verschillende vaardigheden omvat. Om de functionaliteit ervan te begrijpen, is het essentieel om gedetailleerde celsensoren over het hele brein te bouwen. Ons routinematige high-throughput-protocol maakt de analyse mogelijk van 3D-cytoarchitectuur van volumetrische gebieden van het menselijk brein met micrometerresolutie, waardoor de structurele karakterisering ervan mogelijk wordt.
Volumetrische reconstructie van grote delen van het menselijk brein brengt verschillende experimentele uitdagingen met zich mee die verband houden met de enorme afmetingen van hersenmonsters, de complexe biologische samenstelling, de variabele postmortale fixatie- en opslagomstandigheden en de autofluorescerende signalen van lipofuscine-achtige pigmenten. Dit alles kan de efficiëntie van het optisch wissen en het aantonen van kwaliteit in gevaar brengen. In vergelijking met andere opruimingstechnieken kan de korte weefseltransformatiemethode in combinatie met beeldvorming met lichtbladmicroscopie worden gebruikt voor snelle en gelijktijdige verwerking van meerdere menselijke hersensecties.
Deze resulteren in 3D-hersenreconstructie met een subcellulaire resolutie.
Overzicht
Deze studie presenteert een high-throughput protocol voor gelijktijdige optische klaring, multi-ronde labeling en 3D volumetrische reconstructie van postmortale menselijke hersensecties. Door de S WITCH - H 2 O 2 - Antigen R etrieval - 2,2'-thiodiethanol (TDE) SHORT-techniek te integreren met light-sheet fluorescentiemicroscopie, maakt deze methodologie gedetailleerde structurele karakterisering mogelijk met micrometerresolutie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Histologie
- Immunohistochemie
Achtergrond
- Het menselijk brein is een complex orgaan dat nauwkeurig onderzoek op verschillende schalen vereist.
- Uitdagingen omvatten het verwerken van grote breinmonsters en autofluorescerende signalen van pigmenten.
- Het gepresenteerde protocol pakt de tekortkomingen van bestaande clearing-technieken aan.
Doel van de studie
- Om een gestroomlijnd protocol te ontwikkelen voor het analyseren van de structuur van de menselijke hersenen.
- Om de efficiëntie van het optische klaren en de beeldkwaliteit van hersenweefselsneden te verbeteren.
- Om 3D-reconstructie met een hoge mate van detail en betrouwbaarheid mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- De studie maakt gebruik van light-sheet fluorescentiemicroscopie.
- Menselijk hersenweefsel wordt gebruikt als biologisch model, waarbij gedetailleerde sectie- en verwerkingsstappen worden beschreven.
- Belangrijke stappen omvatten het inbedden van monsters in agarose, verwerking met TDE en multi-ronde immunokleuring voor diverse neuronale markers.
- Incubatietijden en temperaturen zijn nauwkeurig gedefinieerd om optimale clearing- en beeldvormingscondities te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol leidt tot effectieve optische klaring en hoogwaardige beeldvorming van grijze en witte stof.
- Meervoudige kleuringsrondes maken de visualisatie van verschillende neuronale populaties in menselijke hersendoorsneden mogelijk.
- De methode demonstreert het vermogen om subcellulaire details vast te leggen in 3D-reconstructies.
Conclusies
- Deze studie stelt een methode vast voor een uitgebreide analyse van de hersenstructuur met een resolutie van micrometers.
- De aanpak benadrukt het potentieel voor het verbeteren van ons begrip van de architectuur van de hersenen en de implicaties hiervan voor neuronale studies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Grootschalige 3D-beeldvorming met een hoge resolutie van menselijk hersenweefsel is essentieel voor het verbeteren van targetvalidatie en het mechanistische begrip binnen neurofarmaceutisch R&D. Het SHORT-protocol, in combinatie met light-sheet fluorescentiemicroscopie, maakt snelle, gemultiplexte structurele mapping van neuronale subpopulaties in zowel de grijze als de witte stof mogelijk. Deze mogelijkheid ondersteunt het voorspellende vertrouwen en risicoreductie bij vroege ontdekkingsfasen en translationele omslagpunten.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt gedetailleerde analyse van de neuronale architectuur en het in kaart brengen van subpopulaties mogelijk voor targetvalidatie.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door de cytoarchitecturale context in menselijk hersenweefsel bloot te leggen.
- Faciliteert portfolio-triage door het leveren van hoogwaardige, kwantitatieve structurele gegevens.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt optisch geklaarde, multi-gelabelde weefselcoupes voor die geschikt zijn voor downstream kwantitatieve imaging-workflows.
- Standaardiseert de monsterverwerking voor reproduceerbare high-throughput imaging en analyse.
- Maakt multiplexed detectie van neuronale markers mogelijk, wat een robuuste assay-ontwikkeling ondersteunt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt structurele beeldgevingsresultaten uit in lijn met ziekterelevante menselijke hersenarchitectuur.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door directe analyse van menselijk weefsel mogelijk te maken.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling met uitgebreide 3D-cytoarchitecturigegevens.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van discovery tot preklinisch onderzoek door high-throughput, kwantitatieve beeldvorming van menselijke hersendoorsneden mogelijk te maken voor targetvalidatie en mechanistische studies.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en pathway-verduidelijking via gedetailleerde neuronale mapping.
- Screening: Levert reproduceerbare, gemultiplexte en voor imaging geschikte monsters voor kwantitatieve analyse.
- Analytiek: Biedt multi-channel data met subcellulaire resolutie voor vergelijkende conditieanalyse.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen ontdekking en preklinisch werk met directe relevantie voor menselijk weefsel.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een schaalbare, gestandaardiseerde workflow voor herhaald gebruik binnen neurobiologische programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij de validatie van neurobiologische targets.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare weefselverwerking en beeldvorming.
- Strategische waarde: Maakt geïnformeerde go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënt portfoliomanagement mogelijk.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de verdere ontwikkeling van neurofarmaceutische assets.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in weefselverwerking, immunolabeling en geavanceerde microscopie.
- Vereist toegang tot light-sheet fluorescentiemicroscopie en infrastructuur voor multichannel-beeldvorming.
- Noodzaakt standaardisatie van monstervoorbereidings- en beeldvormingsprotocollen tussen verschillende teams.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor verschillende hersengebieden of weefselcondities.
- De monsterbehandeling en incubatieparameters moeten strikt worden gecontroleerd voor optimale resultaten.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:18
Preparing Formalin‐Fixed Human Brain Sections for SHORT Tissue Transformation Technique
2:01
SWITCH ‐ H2O2 ‐ Antigen Retrieval — TDE (SHORT) Tissue Transformation Technique
4:55
Sample Mounting for Light‐Sheet Fluorescence Microscopy and Stripping for Multi‐Round Labeling of the Same Specimens
