Kristallisatie en in situ verzameling van gegevens over kamertemperatuur met behulp van de kristallisatiefaciliteit in Harwell en Beamline VMXi, Diamond Light Source
8 maart 2024
We presenteren een protocol voor de kristallisatie van eiwitten met behulp van de kristallisatiefaciliteit in het Research Complex in Harwell en de daaropvolgende in situ röntgenkristallografische gegevensverzameling van kristallen in de platen bij Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) beamline. We beschrijven monstervereisten, kristallisatieprotocollen en richtlijnen voor gegevensverzameling.
Het begrijpen van de driedimensionale structuren van eiwitten ligt ten grondslag aan het ontwerp van geneesmiddelen, biotechnologie en ons begrip van veel verschillende ziekten. VMXI bepaalt eiwitstructuren zonder cryo-koeling, dus veel dichter bij hun natuurlijke temperaturen. VMXI meet ook diffractiegegevens van eiwitkristallen terwijl ze zich nog in hun kristallisatieplaten bevinden, waardoor schade door mechanische behandeling wordt voorkomen.
In de toekomst willen we echt gebruik maken van de ongelooflijke doorvoer van VMXI om grote populaties kristallen te verkennen om veel verschillende structurele toestanden te identificeren in plaats van de enkele structuur die mensen nu vaak verkrijgen. We willen ook aandringen op de ontwikkeling van geneesmiddelen en het uitvoeren van fragmentscreening en -optimalisatie binnen kristallisatieplaten. Een nieuwe aanpak die enorm veelbelovend is.
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor proteïnekristallisatie en in situ röntgenkristallografische dataverzameling. De methode maakt gebruik van de VMXi-beamline om proteïnestructuren bij natuurlijke temperaturen te analyseren, wat het begrip van het gedrag van proteïnen verbetert.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Structurele biologie
- Kristallografie
- Proteïneanalyse
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitstructuren is cruciaal voor geneesmiddelenontwerp en ziekteonderzoek.
- Traditionele methoden maken vaak gebruik van cryokoeling, wat de eiwittoestanden kan veranderen.
- VMXi maakt gegevensverzameling direct vanuit crystallisatieplaten mogelijk.
- Deze aanpak minimaliseert beschadigingen aan kristallen door mechanische hantering.
Doel van de studie
- Om een protocol te ontwikkelen voor efficiënte proteïnekristallisatie.
- Om de mogelijkheden van VMXi te benutten voor high-throughput structurele analyse.
- Om meerdere structurele toestanden van proteïnen te verkennen voor betere inzichten.
Gebruikte methoden
- Kristallisatie van proteïnen in NC2-platen.
- Gebruik van het ISPyB-systeem voor het beheren van voorstellen en zendingen.
- Datacollectie met behulp van de VMXi-beamline bij 20 °C.
- Geautomatiseerde beeldvorming en analyse van kristallisatiedruppels.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle verzameling van diffractiegegevens zonder cryokoeling.
- Identificatie van kristallijne objecten middels CHiMP-beoordeling.
- Efficiënt beheer van monstergroepen en gegevensverzamelingsprocessen.
- Verhoogde doorvoer voor het verkennen van diverse eiwitstructuren.
Conclusies
- Het protocol faciliteert high-throughput proteïnekristallisatie en -analyse.
- De aanpak van VMXi biedt significante voordelen ten opzichte van traditionele methoden.
- Deze methode is veelbelovend voor toekomstige geneesmiddelenontwikkeling en structureel biologisch onderzoek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
In situ kristallografie bij kamertemperatuur bij VMXi maakt snelle, high-throughput structurele analyse van eiwitten mogelijk, wat bijdraagt aan vroege fasen van geneesmiddelenonderzoek en mechanische risicoreductie. Directe gegevensverzameling vanuit kristallisatieplaten minimaliseert artefacten door monsterbehandeling en versnelt de feedback op kristallisatie-resultaten, waardoor het voorspellend vertrouwen in structuurgebaseerde R&D wordt verhoogd. Deze pijplijn is ontworpen om targetvalidatie en fragment-gebaseerde screening te stroomlijnen, waarbij wereldwijde toegang op afstand de vooruitgang van portfolio's op ondernemingsniveau ondersteunt.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe structurele analyse van eiwitten mogelijk bij temperaturen die dicht bij de fysiologische omstandigheden liggen voor functionele targetvalidatie.
- Ondersteunt snelle hypothese-testen door onmiddellijke feedback te geven over crystallisatie- en ligandbindingsstatussen.
- Faciliteert mechanisch de-risking door meerdere conformationele toestanden vast te leggen over kristalpopulaties heen.
- Verbetert het voorspellende vertrouwen voor downstream drug design door cryo-geïnduceerde artefacten te minimaliseren.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Bereidt gevalideerde crystallisatiesystemen voor voor fragment-screening en optimalisatie binnen platen.
- Standaardiseert imaging- en datacollectieworkflows met behulp van geautomatiseerde, op machine learning gebaseerde kristalidentificatie.
- Maakt reproduceerbare, kwantitatieve structurele outputs mogelijk voor een betrouwbare evaluatie van verbindingen.
- Schaalt naar high-throughput screening met wachtrijgebaseerde data-acquisitie en geautomatiseerde datamerging.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt structurele dataverzameling uit met ziekterelevante condities door cryokoelingsartefacten te vermijden.
- Handhaaft translationele continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door seriële kristallografie te ondersteunen.
- Zorgt voor risico-gecorrigeerde vooruitgang door snelle beoordeling van ligandbinding en proteïnedynamiek mogelijk te maken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert het proces vanaf de vroege ontdekking tot de identificatie van lead-verbindingen, ter ondersteuning van structuurgebaseerd ontwerp en fragment-screening binnen een uniforme, op afstand toegankelijke workflow.
- Discovery Biology: Versnelt hypothese-testen en pathway-verduidelijking door snelle, artefact-vrije structuurbepaling mogelijk te maken.
- Screening: Levert assay-ready, reproduceerbare crystallisatieplatforms met geautomatiseerde beeldvorming en datacollectie.
- Analytics: Biedt kwantitatieve diffractiegegevens en geautomatiseerde merging voor robuuste comparatieve analyse.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt preklinische continuïteit door eiwitstructuren vast te leggen onder native-achtige condities.
- Enterprise hergebruik: Biedt een schaalbare, op afstand toegankelijke infrastructuur voor herhaalde structurele campagnes over verschillende programma's heen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert en automatiseert workflows voor kristallisatie, imaging en datacollectie.
- Strategische waarde: Maakt snellere go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiënte portfolio-progressie mogelijk.
- Portfolio-impact: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en een snelle vooruitgang van structureel gevalideerde targets.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in proteïnekristallisatie en de interpretatie van structureel-biologische gegevens.
- Toegang tot geautomatiseerde beeldvorming, machine learning-gebaseerde kristalidentificatie en synchrotron-beamline-infrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor monster-tracking, gegevensbeheer en protocollen voor toegang op afstand.
- Aanpassing aan diverse eiwitdoelwitten en kristallisatieomstandigheden kan protocoloptimalisatie vereisen.
- De doorvoersnelheid en datakwaliteit zijn afhankelijk van de monstervoorbereiding en de compatibiliteit van de platen met geautomatiseerde systemen.
