Name: Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Ontdek hoe cytoskeletkrachten de kernvorm en RNA-dynamiek in muizeicellen beïnvloeden met behulp van geavanceerde beeldvorming. Deze methode biedt inzicht in vrouwelijke gametbiologie en celmechanica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.A.J. en M.A. schreven mee aan het manuscript en alle co-auteurs becommentarieerden het manuscript. M.A. wordt gesteund door CNRS en "Projet Fondation ARC" (PJA2022070005322).A.A.J. wordt gesteund door Fondation des Treilles, Fonds Saint-Michel en Fondation du Collège de France.

Impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en condensaatdynamiek in muizeneicellen

<ol><li>Quinlan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+Streaming+in+the+Drosophila+Oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Rev+Cell+Developl+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic Streaming in the Drosophila Oocyte.</a> Annual Rev Cell Developl Biol. 32, 173-195 (2016).</li>
<li>Goldstein, R. E., van de Meent, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+perspective+on+cytoplasmic+streaming%5BTitle%5D)+AND+%22Interface+Focus%22%5BJournal%5D)">A physical perspective on cytoplasmic streaming.</a> Interface Focus. 5 (4), 20150030(2015).</li>
<li>Gundersen, G. G., Worman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear positioning.</a> Cell. 152 (6), 1376-1389 (2013).</li>
<li>Metzger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAP+and+kinesin-dependent+nuclear+positioning+is+required+for+skeletal+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAP and kinesin-dependent nuclear positioning is required for skeletal muscle function.</a> Nature. 484 (7392), 120-124 (2012).</li>
<li>Roman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+repair+after+physiological+damage+relies+on+nuclear+migration+for+cellular+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Muscle repair after physiological damage relies on nuclear migration for cellular reconstruction.</a> Science. 374 (6565), 355-359 (2021).</li>
<li>Almonacid, M., Terret, M. E., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+nucleus+positioning+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Develop+Biol%22%5BJournal%5D)">Control of nucleus positioning in mouse oocytes.</a> Semin Cell Develop Biol. 82, 34-40 (2018).</li>
<li>Brunet, S., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+vesicle+position+and+meiotic+maturation+in+mouse+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Germinal vesicle position and meiotic maturation in mouse oocyte.</a> Reproduction. 133 (6), 1069-1072 (2007).</li>
<li>Levi, M., Ghetler, Y., Shulman, A., Shalgi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+molecular+markers+are+correlated+with+maturation-competence+of+human+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Morphological and molecular markers are correlated with maturation-competence of human oocytes.</a> Hum Reprod. 28 (9), 2482-2489 (2013).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+diffusion+positions+the+nucleus+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Active diffusion positions the nucleus in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 17 (4), 470-479 (2015).</li>
<li>Almonacid, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+fluctuations+of+the+nuclear+envelope+shape+the+transcriptional+dynamics+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Active fluctuations of the nuclear envelope shape the transcriptional dynamics in oocytes.</a> Dev Cell. 51 (2), 145-157 (2019).</li>
<li>Al Jord, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+forces+functionally+reorganize+nuclear+condensates+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic forces functionally reorganize nuclear condensates in oocytes.</a> Nat Commun. 13 (1), 5070(2022).</li>
<li>Shin, Y., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+phase+condensation+in+cell+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liquid phase condensation in cell physiology and disease.</a> Science. 357 (6357), eaaf4382(2017).</li>
<li>Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates%3A+organizers+of+cellular+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 18 (5), 285-298 (2017).</li>
<li>Lyon, A. S., Peeples, W. B., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+framework+for+understanding+the+functions+of+biomolecular+condensates+across+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A framework for understanding the functions of biomolecular condensates across scales.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 215-235 (2021).</li>
<li>Gordon, J. M., Phizicky, D. V., Neugebauer, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+mechanisms+of+gene+expression+control%3A+pre-mRNA+splicing+as+a+life+or+death+decision%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Nuclear mechanisms of gene expression control: pre-mRNA splicing as a life or death decision.</a> Curr Opin Genet Dev. 67, 67-76 (2021).</li>
<li>Barutcu, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+mapping+of+nuclear+domain-associated+transcripts+reveals+speckles+and+lamina+as+hubs+of+functionally+distinct+retained+introns%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic mapping of nuclear domain-associated transcripts reveals speckles and lamina as hubs of functionally distinct retained introns.</a> Mol Cell. 82 (5), 1035-1052.e9 (2022).</li>
<li>Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+stochastic%2C+motor-driven+properties+of+the+cytoplasm+using+force+spectrum+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Probing the stochastic, motor-driven properties of the cytoplasm using force spectrum microscopy.</a> Cell. 158 (4), 822-832 (2014).</li>
<li>Verlhac, M. H., Kubiak, J. Z., Clarke, H. J., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+and+chromatin+behavior+follow+MAP+kinase+activity+but+not+MPF+activity+during+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microtubule and chromatin behavior follow MAP kinase activity but not MPF activity during meiosis in mouse oocytes.</a> Development. 120 (4), 1017-1025 (1994).</li>
<li>Reis, A., Chang, H. Y., Levasseur, M., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APCcdh1+activity+in+mouse+oocytes+prevents+entry+into+the+first+meiotic+division%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">APCcdh1 activity in mouse oocytes prevents entry into the first meiotic division.</a> Nat Cell Biol. 8 (5), 539-540 (2006).</li>
<li>El-Hayek, S., Clarke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+oocyte+growth+and+development+by+intercellular+communication+within+the+follicular+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Results+Probl+Cell+Differ%22%5BJournal%5D)">Control of oocyte growth and development by intercellular communication within the follicular niche.</a> Results Probl Cell Differ. 58, 191-224 (2016).</li>
<li>Dumont, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+centriole-+and+RanGTP-independent+spindle+assembly+pathway+in+meiosis+I+of+vertebrate+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A centriole- and RanGTP-independent spindle assembly pathway in meiosis I of vertebrate oocytes.</a> J Cell Biol. 176 (3), 295-305 (2007).</li>
<li>Kaláb, P., Pralle, A., Isacoff, E. Y., Heald, R., Weis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+RanGTP-regulated+gradient+in+mitotic+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Analysis of a RanGTP-regulated gradient in mitotic somatic cells.</a> Nature. 440 (7084), 697-701 (2006).</li>
<li>Lafontaine, D. L. J., Riback, J. A., Bascetin, R., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleolus+as+a+multiphase+liquid+condensate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The nucleolus as a multiphase liquid condensate.</a> Nat Rev. Mol Cell Biol. 22 (3), 165-182 (2021).</li>
<li>Terret, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DOC1R%3A+a+MAP+kinase+substrate+that+control+microtubule+organization+of+metaphase+II+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">DOC1R: a MAP kinase substrate that control microtubule organization of metaphase II mouse oocytes.</a> Development. 130 (21), 5169-5177 (2003).</li>
<li>Dumont, J., Verlhac, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+FRET+to+study+RanGTP+gradients+in+live+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using FRET to study RanGTP gradients in live mouse oocytes.</a> Methods Mol Biol. 957, 107-120 (2013).</li>
<li>McSwiggen, D. T., Mir, M., Darzacq, X., Tjian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+phase+separation+in+live+cells%3A+diagnosis%2C+caveats%2C+and+functional+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Develop%22%5BJournal%5D)">Evaluating phase separation in live cells: diagnosis, caveats, and functional consequences.</a> Gene Develop. 33 (23-24), 1619-1634 (2019).</li>
<li>OOCytes. , https://github.com/Carreau/OOCytes (2014).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+transactions+on+image+processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE transactions on image processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>ImageJ. , https://imagej.github.io/update-sites/big-epfl (2023).</li>
<li>Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+image+correlation+spectroscopy+%28STICS%29+theory%2C+verification%2C+and+application+to+protein+velocity+mapping+in+living+CHO+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells.</a> Biophys J. 88 (5), 3601-3614 (2005).</li>
<li>Yi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+maintenance+of+asymmetric+meiotic+spindle+position+through+Arp2%2F3-complex-driven+cytoplasmic+streaming+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic maintenance of asymmetric meiotic spindle position through Arp2/3-complex-driven cytoplasmic streaming in mouse oocytes.</a> Nat Cell Biol. 13 (10), 1252-1258 (2011).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9, 676-682 (2012).</li>
<li>Stowers ImageJ Plugins. , https://research.stowers.org/imagejplugins/ (2023).</li>
<li>Luisier, F., Vonesch, C., Blu, T., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+interscale+wavelet+denoising+of+Poisson-corrupted+images%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Process%22%5BJournal%5D)">Fast interscale wavelet denoising of Poisson-corrupted images.</a> Signal Process. 90 (2), 415-427 (2010).</li>
<li>Ovocyte_Nucleus. , https://github.com/orion-cirb/Ovocyte_Nucleus (2023).</li>
<li>Letort, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLetort%2C+G+%22gletort%2FImageJFiles%3A+GLijplugs_v0.2.0%22">gletort/ImageJFiles: GLijplugs_v0.2.0</a>. , doi: 10.5281/zenodo.6854802 (2022).</li>
<li>ImageJFiles. , https://github.com/gletort/ImageJFiles/tree/master/radioak (2023).</li>
<li>Chu, F. Y., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+origin+of+shape+fluctuations+of+the+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">On the origin of shape fluctuations of the cell nucleus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (39), 10338-10343 (2017).</li>
<li>Caragine, C. M., Haley, S. C., Zidovska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+fluctuations+and+coalescence+of+nucleolar+droplets+in+the+human+cell+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Surface fluctuations and coalescence of nucleolar droplets in the human cell nucleus.</a> Phys Rev Lett. 121 (14), 148101(2018).</li>
<li>Introini, V., Kidiyoor, G. R., Porcella, G., Cicuta, P., Cosentino Lagomarsino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centripetal+nuclear+shape+fluctuations+associate+with+chromatin+condensation+in+early+prophase%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Centripetal nuclear shape fluctuations associate with chromatin condensation in early prophase.</a> Commun Biol. 6 (1), 1-11 (2023).</li>
<li>Boija, A., Klein, I. A., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomolecular+condensates+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Biomolecular condensates and cancer.</a> Cancer Cell. 39 (2), 174-192 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

De belangrijkste stappen in dit protocol zijn onder meer de juiste micro-injectie van eicellen zonder hun overleving of normale functie te beïnvloeden 9,10,11, evenals het micro-injecteren van vooraf gedefinieerde hoeveelheden cRNA die een correcte visualisatie van relevante structuren, zoals nucleaire spikkels, mogelijk zouden maken.
Het leggen van het verband tussen cytoplasmatische en (intra)-nucleaire dynamiek is essentieel bij het bestuderen van hoe het cytoskelet de kern of het inwendige ervan in beroering brengt. Dit protocol, met kleine aanpassingen, maakt dat mogelijk door cytoplasmatische roerintensiteiten te correleren met nucleaire YFP-Rango of SRSF2-GFP druppeldynamiek (zoals in11). Om verder te gaan, moeten eicellen eerst gedurende 120 s worden gefilmd in helderveldmodus om cytoplasmatisch roeren vast te leggen, voordat ze onmiddellijk gedurende 120 s worden gefilmd met een laser van 491 nm om nucleaire omtrek of druppeldynamiek vast te leggen. In het geval van nucleaire SRSF2-GFP-druppeltjes kan de correlatie eenvoudig worden beoordeeld door hun effectieve diffusiecoëfficiënten (zie stap 7 in dit protocol) te vergelijken met de omgekeerde maximale intensiteitswaarden van cytoplasmatisch roeren verkregen met behulp van beeldcorrelatieanalyses (zie stap 4 in dit protocol). Een ander belangrijk punt is de grootte van de condensaten die worden gekozen voor analyses van fluctuaties in het druppeloppervlak. Druppels met een vergelijkbare diameter moeten worden geselecteerd voor vergelijkende analyses om vertekening te voorkomen, aangezien de grootte de intensiteit van oppervlaktefluctuaties moduleert.
Er zijn enkele beperkingen voor dit protocol. Analyses van fluctuaties in de nucleaire omtrek zijn gebaseerd op volledige intranucleaire kleuring, zoals YFP-Rango of NLS-GFP. Voor analyses op nucleaire spikkels kan micro-injectie van buitensporige hoeveelheden SRSF2-GFP-cRNA leiden tot schijnbare veranderingen in de fasescheidingseigenschappen van deze condensaatmarker (Figuur 3C), zoals eerder door anderen is beoordeeld26. Het is daarom van cruciaal belang om na te gaan of exogene eiwitexpressieprofielen vergelijkbaar zijn met de endogene. Bovendien moeten relatief kleine druppeltjes (straal van <2 μm) worden uitgesloten van pijpleidingen voor de analyse van oppervlaktefluctuaties vanwege beperkingen van de ruimtelijke resolutie met de hier gedefinieerde instrumenten. Dit resolutieprobleem kan meestal worden opgelost door het gebruik van meer oplossende microscopen, die bijvoorbeeld nodig kunnen zijn om oppervlaktefluctuaties van kleinere condensaten in de eicelkern of in de aanzienlijk kleinere kern van somatische cellen te onderzoeken.
Over het algemeen maakt dit protocol het mogelijk om actine en microtubuli cytoskelet-gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen over schalen te vangen. In het bijzonder maakt het de documentatie mogelijk van op cytoskelet gebaseerde mobilisatie van het cytoplasma, fluctuaties in de nucleaire omtrek, samen met vloeistofachtige nucleaire spikkelverplaatsingen en oppervlaktefluctuaties. Hoewel sommige studies in andere celtypen sommige van deze zaken aanpakken 38,39,40 via verschillende protocollen van verschillende complexiteit op individuele ruimtelijke schalen, biedt dit eenvoudige protocol de hulpmiddelen die nodig zijn om de genoemde cellulaire dynamiek over meerdere schalen in een enkele werkpijplijn voor het eerst aan te pakken. Bovendien maken de gegevens die uit deze benadering worden gegenereerd, aangevuld met biofysische modellering zoals in10,11, een minimaal invasieve evaluatie mogelijk van: i) veranderingen in de nucleaire mechanica10; ii) de overdracht van op het cytoskelet gebaseerde actieve krachten in het cytoplasma naar condensaten in de kern11; en iii) de dissipatie van deze actieve energie over verschillende cellulaire compartimenten10,11. Belangrijk is dat dit protocol veelzijdig is, omdat het niet alleen kan worden aangepast aan andere nucleaire condensaten zoals de nucleolus23, maar ook aan andere celtypen zoals kankercellen, waar veranderingen in zowel cytoskeletaal als nucleair condensaatgedrag werden gedocumenteerd17,41.

Nucleaire positionering is essentieel voor meerdere cellulaire en ontwikkelingsfuncties 1,2,3,4,5. Vrouwelijke geslachtscellen van zoogdieren, eicellen genaamd, hermodelleren hun cytoplasma om de kern in het celcentrum te positioneren, ondanks het feit dat ze een asymmetrische verdeling in grootte ondergaan, die afhankelijk is van het daaropvolgende chromosoom dat niet gecentreerd is6 (Figuur 1). Deze centrering van de kern voorspelt een succesvolle eicelontwikkeling bij muizen en mensen 7,8, en dus hun embryogene potentieel (Figuur 1).
Cytoplasmatische remodellering in eicellen van muizen wordt voornamelijk aangedreven door het actomyosine-cytoskelet9 (Figuur 2). Zijn activiteit genereert mechanische krachten die de kern10 in beroering brengen, herpositioneren en binnendringen (Figuur 2). Bijgevolg stemt deze cytoplasmatische krachtoverdracht van cytoplasmatisch naar nucleoplasmatisch af op de dynamiek van nucleaire boodschapper-RNA-verwerkende organellen genaamd nucleaire spikkels11, een van de vele membraanloze organellen in de kern die bekend staan als biomoleculaire condensaten 12,13,14,15,16 (Figuur 2).
Live beeldvorming is doorslaggevend geweest bij het ontcijferen van de functionele implicaties van nucleaire agitatie. Films van nucleaire migratie gedurende uren, evenals films met een hoge temporele resolutie van het actinegaas en het bulkcytoplasma, droegen grotendeels bij aan de uitwerking van een theoretisch model voor nucleaire positionering, waarbij verschillende tijdschalen met elkaar werdenverbonden. Ook films met een hoge temporele resolutie van het cytoplasma, nucleaire omtrek en nucleaire componenten zoals chromatine en nucleaire condensaten, benadrukten de rol van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de kern op RNA-verwerking en genexpressie in eicellen van muizen, waarbij verschillende spatiotemporele schalen binnen de cel werden overbrugd10,11. Al met al leverde een dergelijke schaaloverschrijdende benadering op basis van live beeldvorming de eerste reden op die cytoskeletale agitatie van de kern koppelde aan het ontwikkelingssucces van eicellen.
Het protocol biedt de beeldvormings- en beeldanalysepijplijn die wordt gebruikt om de overdracht van cytoplasmatische krachten (voornamelijk gegenereerd door F-actine en gedeeltelijk door microtubuli) naar de kern en zijn interne componenten in eicellen van muizen te bestuderen. Het resultaat van deze experimenten is om het continuüm van krachten op ruimtelijke schalen vast te leggen, van het cytoskelet in het cytoplasma tot het nucleaire binnenste via films met een hoge temporele resolutie, zoals te zien is in twee recente studies10,11, die het verband legden tussen cytoplasmatische actieve bewegingen, fluctuaties van de nucleaire omtrek, evenals beweging en oppervlaktefluctuaties van een enkel type nucleaire biomoleculaire condensaten: nucleaire spikkels. Dezelfde benadering kan worden toegepast op andere modelsystemen waar cytoplasmatische krachten naar verwachting zullen veranderen, zoals in de context van kwaadaardige kankercellen17.

<table><tbody><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 spinning disk</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMI6000B microscope&nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtojet microinjector</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter wheel</td><td>Sutter Instruments Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorodish</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph software&nbsp;</td><td>Universal Imaging,&nbsp;</td><td></td><td>versie 7.7.9.0</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OF1 en C57BL/6 muizen&nbsp;</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) Tailing kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>Retiga 3 CCD camera&nbsp;</td><td>QImaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>SC35 antilichaam</td><td>Abcam</td><td>ab11826</td><td>Nucleair vlek antilichaam; muis IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)</td></tr><tr><td>SRSF2-GFP plasmid&nbsp;</td><td>&nbsp;OriGene Technologies</td><td>MG202528</td><td>NM_011358</td></tr><tr><td>Stripper Micropipette</td><td>&nbsp;XLAB Solutions</td><td></td><td>gespecialiseerd voor oöcytverzameling</td></tr><tr><td>T3 mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1384&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage mMachine&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM13344</td><td></td></tr><tr><td>Thermostaatkamer</td><td>Life Imaging Service</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Capturing Cytoskeleton-Based Agitation of the Mouse Oocyte Nucleus Across Spatial Scales

Een grote uitdaging bij het begrijpen van de oorzaken van vrouwelijke onvruchtbaarheid is het ophelderen van mechanismen die de ontwikkeling van vrouwelijke geslachtscellen, oöcyten genaamd, regelen. Hun ontwikkeling wordt gekenmerkt door celgroei en daaropvolgende delingen, twee kritieke fasen die de eicel voorbereiden op fusie met sperma om de embryogenese te starten. Tijdens de groei reorganiseren eicellen hun cytoplasma om de kern in het celcentrum te positioneren, een gebeurtenis die voorspellend is voor een succesvolle ontwikkeling van eicellen bij muizen en mensen en dus voor hun embryogene potentieel. In eicellen van muizen bleek deze cytoplasmatische reorganisatie te worden aangedreven door het cytoskelet, waarvan de activiteit mechanische krachten genereert die de kern in beroering brengen, herpositioneren en binnendringen. Bijgevolg stemt deze cytoplasmatische naar nucleoplasmatische krachtoverdracht de dynamiek af van nucleaire RNA-verwerkende organellen die bekend staan als biomoleculaire condensaten. Dit protocol biedt een experimenteel raamwerk om, met een hoge temporele resolutie, de impact van het cytoskelet op de kern over ruimtelijke schalen in eicellen van muizen te documenteren. Het beschrijft de stappen en hulpmiddelen voor beeldvorming en beeldanalyse die nodig zijn om i) cytoskeletactiviteit in het cytoplasma van de eicel te evalueren, ii) op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern, en iii) de effecten ervan op de dynamiek van biomoleculair condensaat in het nucleoplasma van de eicel. Naast de eicelbiologie kunnen de hier uitgewerkte methoden worden aangepast voor gebruik in somatische cellen om op dezelfde manier cytoskelet-gebaseerde afstemming van nucleaire dynamiek op verschillende schalen aan te pakken.

Afbeeldingspanelen in figuur 3 tonen voorbeelden van een typische volgroeide eicel (figuur 3A), het nucleoplasma in een volgroeide eicel die YFP-Rango tot expressie brengt (figuur 3B), het nucleoplasma in een volgroeide eicel die een correct tot expressie brengt (linkerpaneel; Figuur 3C) of een buitensporig (rechterpaneel; Figuur 3C) dosis SRSF2-GFP-cRNA en een immunokleuring van nucleaire spikkels in een volgroeide eicel met behulp van het SC35-antilichaam (Figuur 3D). De juiste dosis SRSF2-GFP cRNA om te micro-injecteren werd gedefinieerd op basis van visuele vergelijkingen tussen expressieprofielen van SRSF2-GFP met endogene profielen van nucleaire spikkels.
Cytoplasmatische roerkrachten in eicellen, zoals aangetoond door eerder werk uit het laboratorium met behulp van STICS-vectorkaarten en beeldcorrelatieanalyse (zie9 en11), kunnen worden verminderd door cytoskeletale verstoringen, zowel genetisch (bijv. FMN2-mutante muis) als chemisch (bijv. Cytochalasine D). STICS-kaarten van controle-eicellen geven talrijke vectoren weer, waarbij kleuren hoge stroomsnelheden aangeven, terwijl kaarten van eicellen met verstoorde cytoskeletkrachten minder vectoren weergeven, met kleuren die lage stroomsnelheden aangeven. Evenzo gaat de beeldcorrelatie zeer snel verloren in controle-eicellen in vergelijking met eicellen met verstoorde cytoskeletkrachten. Dit is waarneembaar op correlatiecurves, met een snellere afname van de curve voor controle-eicellen in vergelijking met oöcyten met verstoorde cytoskeletkrachten9 of een snellere toename wanneer de curve wordt omgekeerd11.
Cytoskeletale krachten brengen de kern en zijn inwendige organellen in beroering, in het bijzonder nucleaire condensaten zoals nucleaire spikkels10,11. In figuur 4A is de kern van controle-eicellen onderhevig aan belangrijke perifere fluctuaties, die zichtbaar zijn met behulp van de kernsonde YFP-Rango. De vorm van de kern in eicellen met verstoorde krachten in het cytoskelet is stabiel in de loop van de tijd (figuur 4C). Analyse van fluctuaties in de nucleaire omtrek is essentieel om de agitatie nauwkeurig te kwantificeren. Door de variantie van de afstand van het kernzwaartepunt tot de periferie te bepalen, (r-R)2 (Figuur 4B), konden fluctuaties worden gekwantificeerd, waaruit bleek dat nucleaire agitatie 6 keer hoger is in controle-eicellen dan in eicellen met verstoorde cytoskeletkrachten10. In figuur 5A-B worden nucleaire spikkels (SRSF2-GFP+ druppeltjes) getoond in controle- en verstoorde contexten van cytoplasmatische krachten met hoge temporele resolutie. In controles fluctueert het druppeloppervlak significant meer dan druppeloppervlakken in eicellen met verstoorde cytoplasmatische krachten, die kunnen worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met behulp van de Radioak32-plug-in. Visueel geven groene en rode kleuren (Radioak-uitvoer te zien op de onderste afbeeldingen van figuur 5A-B) hoeken aan waar de plug-in oppervlakteveranderingen tussen opeenvolgende afbeeldingen heeft gedetecteerd en wit duidt op een gebrek aan oppervlakteveranderingen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van late oögenese en vroege embryogenese van muizen. Illustratie van kerncentrering die optreedt bij late eicelgroei, chromosoom-off-centrering die optreedt tijdens eiceldeling en vroege stappen (1-cel- en 2-celstadia) van embryogenese. Het vrouwelijk genoom (eicelkern en vrouwelijke pronucleus) is roze, de mannelijke pronucleus is blauw. De embryokernen (na fusie van oudergenomen) zijn paars. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig02.jpg"> Figuur 2: Illustratie van cytoplasmatische en nucleaire remodellering op verschillende schalen in groeiende eicellen van muizen. Deze figuur vat de belangrijkste bevindingen van 9,10,11 samen. Illustratie van actomyosine-gebaseerde remodellering van het cytoplasma, nucleaire agitatie en functionele nucleaire biomoleculaire condensaatremodellering over spatiotemporele schalen. De schaaloverschrijdende hermodellering van nucleaire spikkels verbetert biomoleculaire reacties die verband houden met hun functie (d.w.z. splitsing van pre-mRNA). Merk op dat dit protocol de beoordeling van nucleaire agitatie alleen toestaat op ruimtelijke schalen, maar niet op temporele schalen, aangezien alle beeldvorming wordt gedaan met dezelfde temporele resolutie van 0,5 s tussen beeldframes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig03.jpg"> Figuur 3: Voorbeeldbeelden van de volgroeide eicel en het nucleoplasma. (A) Helderveldbeeld van een volgroeide eicel met chromatine (cyaan) dat de nucleolus omringt. Een witte gestippelde cirkel omlijnt de kern. (B) Levende eicelkern die YFP-Rango tot expressie brengt; Let op de afwezigheid van fluorescentie in de nucleolus. (C) Voorbeeld van een levende eicelkern die SRSF2-GFP tot expressie brengt na micro-injectie van de juiste doses cRNA (linkerpaneel) of hoge doses cRNA (rechterpaneel); Let op de gecondenseerde (druppel) en opgeloste fasen aan de linkerkant en hun afwezigheid in de toestand aan de rechterkant. (D) immunokleuring van nucleaire spikkels in een gefixeerde eicel; let op het endogene expressieprofiel dat vergelijkbaar is met dat in C (linkerpaneel). Schaalbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig04.jpg"> Figuur 4: Plug-in-uitgangen van controle- en verstoorde nucleaire omtrekfluctuaties. (A) Time-lapse van een eicelkern die YFP-Rango tot expressie brengt (boven) en het bijbehorende binaire masker gegenereerd door de Ovocyte_nucleus-plug-in (onder). (B) Principe van metingen van fluctuaties in de kernomtrek in de tijd en in een bepaalde richting. Richtingen worden gedefinieerd door een draaihoek θ van 1° in stappen van 0° tot 360°. Twee representatieve vormen op t=0 s (geel) en t=135 s (paars) zijn weergegeven. De blauwe vorm komt overeen met de gemiddelde vorm in de loop van de tijd. (C) Nucleaire omtrekfluctuaties van een kern in een eicel met verminderde krachten in het cytoskelet als gevolg van verstoring van zowel F-actine (FMN2-mutante muis) als microtubuli (behandeling met nocodazol; zoals in10). Schaalbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65976/65976fig05.jpg"> Figuur 5: Plug-in-uitgangen van controle en verstoorde fluctuaties in het druppeloppervlak. (A) Uitsnede van een controle SRSF2-GFP nucleaire druppel afgebeeld met 500 ms per frame en weergegeven in Ice Look Up Table (LUT) (boven); binair masker van dezelfde druppel gegenereerd door Fiji (midden); en Radioak-plug-in-uitgangen na analyse van oppervlaktefluctuaties van de druppel (onderkant), waarbij groen en rood hoeken aangeven waar de plug-in oppervlakteveranderingen tussen opeenvolgende afbeeldingen heeft gedetecteerd en wit een gebrek aan oppervlakteveranderingen aangeeft. (B) Oppervlaktefluctuaties van een kerndruppel in eicellen met verminderde cytoskeletkrachten als gevolg van verstoring van zowel F-actine als microtubuli (zoals in11). Schaalbalken = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/65976fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullende tabel 1: Voorbeeld van Ovocyte_nucleus output van plug-inanalyses. Dezelfde kern geanalyseerd als die in figuur 4A. Theta (θ) is de hoek in graden en t1 tot t600 komt overeen met het framenummer, dat in tijd kan worden omgerekend. De stralen zijn in μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%201_Ovocyte_nucleus%20output%20example.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 2: Voorbeeldspreadsheet die wordt gebruikt voor de berekening van fluctuaties in de nucleaire omtrek. Dezelfde kern geanalyseerd als die in figuur 4A. Theta (θ) is de hoek in graden en t1 tot t600 komt overeen met het framenummer, dat in tijd kan worden omgerekend. Tab Raw en gemiddelde: De stralen zijn in μm. Tab r-R: De r-R afstanden zijn in μm. Tabel (r-R)2: De fluctuatiewaarden zijn in μm2. Tabs x en y komen overeen met de Cartesiaanse coördinaten van de stralen van de Raw en gemiddelde tab. Ze maken het mogelijk om de gemiddelde vorm van de kern in de loop van de tijd te tekenen op het tabblad Gemiddelde vorm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%202_Nuclear%20outline%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 3: Voorbeeld van de analyse-output van de Radioak-plug-in. Dezelfde druppel geanalyseerd als die in figuur 5A. De gemeten stralen op verschillende tijdstippen en hoeken worden weergegeven. De stralen zijn in μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%203_%20Radioak%20output%20example.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende tabel 4: Voorbeeldspreadsheet die wordt gebruikt voor de berekening van fluctuaties in het oppervlak van kerndruppels. Dezelfde druppel geanalyseerd als die in figuur 5A. Theta (θ) is de hoek in graden en t1 tot t600 komt overeen met het framenummer, dat in tijd kan worden omgerekend. Tab Raw en gemiddelde: De stralen zijn in μm. Tab r-R: De r-R afstanden zijn in μm. Tabel (r-R)2: De fluctuatiewaarden zijn in μm2. Tabs x en y komen overeen met de Cartesiaanse coördinaten van de stralen van de Raw en gemiddelde tab. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65976/Table%204_Droplet%20fluctuations%20analysis%20example_RE.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol biedt een experimenteel kader om de fysieke impact van het cytoskelet op de nucleaire vorm en de interne membraanloze organellen in het eicelsysteem van muizen te documenteren. Het raamwerk kan worden aangepast voor gebruik in andere celtypen en contexten.

Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

A major challenge in understanding the causes of female infertility is to elucidate mechanisms governing the development of female germ cells, named ...

Het lab heeft tot doel de mechanismen die betrokken zijn bij het verwerven van vrouwelijke gammahoeveelheden beter te begrijpen, wat essentieel is voor de reproductie van seksuele soorten met behulp van het modelsysteem voor eicellen van muizen. Onlangs hebben we een nieuw mechanisch transductieproces geïdentificeerd dat de agitatie van de kern en de inhoud ervan bevordert, wat leidt tot de fijne regulatie van maternale RNA's in eicellen van muizen. De beeldvormings- en beeldanalysepijplijn die in dit protocol wordt gepresenteerd, stelt ons in staat om de overdracht van cytoskeletale krachten te benadrukken als een continuüm over schalen van het cytoplasma naar de kern en zijn componenten, inclusief nucleaire RNA-verwerkingslichamen in eicellen van muizen.Dit protocol biedt eenvoudige hulpmiddelen waarmee we voor het eerst de eerste transmissie over meerdere cellulaire schalen in één pijplijn kunnen aanpakken. Aangevuld met biofysische modellering vormt dit protocol een niet-invasieve techniek om veranderingen in nucleaire mechanica en de dissipatie van energie over cellulaire compartimenten aan te pakken.

capturing-cytoskeleton-based-agitation-mouse-oocyte-nucleus-across

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Eicellen zijn gevoelig voor te wijten aan fouten in chromosoom segregatie aneuploïdie tijdens de meiotische rijping. Aneuploïde eieren kan leiden tot onvruchtbaarheid, miskramen of ontwikkelingsstoornissen, zoals het syndroom van Down. Hier beschrijven we methoden om materialen van keuze te introduceren in eicellen en methoden om meiotische rijping onderzoeken en te beoordelen ploïdie.

Eicel muis micro-injectie, rijping en ploïdie Assessment

Hier presenteren we een protocol specifieke siRNA-gemedieerde mRNA afbraak gevolgd door immunofluorescentie analyse meiotische spileenheid en organisatie evalueren muizen oöcyten. Dit protocol is geschikt voor in vitro depletie van transcripties en functionele beoordeling van verschillende spil en / of MTOC geassocieerde factoren in oöcyten.

Meiotische Spil Assessment in Muis Eicellen door siRNA-gemedieerde silencing

We presenteren protocollen voor het verzamelen, voorbereiden en beeldvorming van volwassen Drosophila eicellen. Deze methoden maken de visualisatie van chromosoomgedrag en spindelassemblage en -functie tijdens meiose mogelijk.

Technieken voor Imaging prometaphase metafase van de meiose I in Fixed<em&gt; Drosophila</em&gt; Eicellen

Hier presenteren we een protocol voor niet-invasieve beoordeling van ontwikkelingsstoornissen bekwaamheid oöcyt uitgevoerd tijdens hun rijping in vitro van het vesikel germinal aan de metafase-II. Deze methode combineert time-lapse imaging met particle image velocimetry (PIV) en neurale netwerk analyses.

Een neuraal netwerk-gebaseerde identificatie van ontwikkelingsachterstand bevoegde of incompetente muis volgroeide eicellen

Als de genetische varianten die zijn gekoppeld aan ziekten bij de mens begint te worden blootgelegd, wordt het steeds belangrijker systemen waarmee snel evalueren de biologische betekenis van deze geïdentificeerde varianten te ontwikkelen. Dit protocol wordt beschreven methoden voor de evaluatie van menselijke genfunctie tijdens vrouwelijke meiose ik met behulp van de muis eicellen.

Met behulp van de muis eicellen te beoordelen van menselijke genfunctie tijdens de meiose I

In Drosophilaondergaat de oöcytkern microtubuli-afhankelijke migratie tijdens oogenese. Hier beschrijven we een protocol dat is ontwikkeld om de migratie te volgen door live beeldvorming uit te voeren op eierkamers ex-vivo. Onze procedure houdt de eierkamers 12 uur in leven om multi-position 3D time-lapse films te verkrijgen met behulp van spinning-disk confocale microscopie.

Nucleaire migratie in de Drosophila Oocyte

Er wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd dat de uitputting van cytoplasmatische microtubuli organiserende centra in muizenoöcyten tijdens metafase I mogelijk maakt met behulp van een nabij-infrarode femtosecondelaser.

Multi-foton laserablatie van cytoplasmatische microtubule organiserende centra in muizenoöcyten

Fout in chromosoomsegregatie is een veel voorkomend kenmerk in eicellen. Daarom geeft het bestuderen van het controlepunt voor de spindelassemblage belangrijke aanwijzingen over de mechanismen die nodig zijn om gezonde eieren te produceren. Het huidige protocol beschrijft drie complementaire testen om de integriteit van het controlepunt van de spindelassemblage in muizenoöcyten te evalueren.

Evaluatie van de integriteit van het spindelassemblagecontrolepunt in muizenoöcyten

Meiotische fouten in synapsen en recombinatie komen vaak voor bij eicellen van zoogdieren. Grondige analyse van eiwitten die bij deze processen betrokken zijn, is essentieel om te begrijpen hoe en waarom oögenese vaak fout gaat. De hier gepresenteerde technieken maken een uitgebreide monitoring van recombinatie en synapsen mogelijk om de eicelkwaliteit bij muizen te evalueren.

Voorbereiding van meiotische chromosoomspreads van eicellen van muizen voor beoordeling van synapsis en recombinatie

Orthotope diermodellen van kanker van de eierstokken te repliceren beter mens-en vaatziekten en daardoor meer inzicht in de progressie van kanker en tumor respons op therapie. Een muis model krijgt een intrabursale injectie van luciferase-expressie ovarium tumorcellen. De behandeling wordt toegediend via orale sondevoeding. Tumorgroei wordt bewaakt...

In vivo beeldvorming en therapeutische behandelingen in een orthotope Muis Model van eierstokkanker

Ontdek hoe cytoskeletkrachten de kernvorm en RNA-dynamiek in muizeicellen beïnvloeden met behulp van geavanceerde beeldvorming. Deze methode biedt inzicht in vrouwelijke gametbiologie en celmechanica.

Het vastleggen van op cytoskelet gebaseerde agitatie van de eicelkern van muizen op ruimtelijke schalen

Meer video's verkennen