Name: Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 42 s
Description: Leer een 3D ex vivo-model van eierstokkanker met behulp van humaan omentum. Dit model behoudt de weefselstructuur en maakt directe interactie met het vetweefselmicroklimaat mogelijk voor onderzoek naar nieuwe therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie wordt gedeeltelijk gefinancierd door The Janet Burros Memorial Foundation. We danken de patiënten en de afdeling Gynaecologische Oncologie van het Karmanos Cancer Institute voor het verzamelen van omentummonsters. We erkennen ook de Biobank en Correlative Sciences Core van het Karmanos Cancer Institute voor de coördinatie van de werving van patiënten en de voorbereiding van pathologiepreparaten. De Biobank and Correlative Sciences Core wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH Center-subsidie P30 CA22453 aan het Karmanos Cancer Institute aan de Wayne State University.

Het volgende onderzoeksprotocol is beoordeeld en goedgekeurd door de Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Voorafgaand aan de operatie werd van alle patiënten geïnformeerde toestemming verkregen. Figuur 1 illustreert de drie algemene stappen in dit protocol.
1. Bereiding van menselijk omentumweefsel
<ol><li>Bereid omentumkweekmedia (DMEM/F12 + 10% foetaal runderserum + 1% penicilline-streptomycine) en bewaar bij 4 °C. Aliquot 30-40 ml van dit medium in een steriele conische buis van 50 ml of een container voor chirurgische monsters.</li>
	<li>Verkrijg chirurgische monsters van omentale biopsie of omentectomiechirurgie. Dompel het steriele monster onmiddellijk na verwijdering in de operatiekamer onder in omentumkweekmedia. Als de workflow dit niet toelaat, plaats het monster dan zo snel mogelijk in omentum kweekmedia. Breng het monster over door het op ijs te leggen en bewaar het bij 4 °C tot het wordt verwerkt. OPMERKING: De grootte van het verwijderde omentummonster bepaalt de hoeveelheid werkbaar weefsel.</li>
	<li>Verwerk het omentummonster binnen 1-2 uur na afname met behulp van een laminaire stroomkap. Zorg ervoor dat alle materialen en gereedschappen steriel of gesteriliseerd zijn.</li>
	<li>Haal het omentum uit de opvangbak en doe het in een kweekschaal van 100 mm. Dompel het monster onder in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS) en was het monster voorzichtig om eventuele bloedstolsels of vuil te verwijderen.</li>
	<li>Snijd het weefsel in stukjes (0,5 cm x 0,5 cm of 100-200 mg; Figuur 2A) met behulp van een kleine chirurgische schaar of een scalpel van 10-15 mm. Gebruik een kleine chirurgische pincet om het weefsel te manipuleren en te voorkomen dat het omentum wordt verpletterd. Als een energieapparaat is gebruikt om het omentum-monster operatief te verwijderen, vermijd dan het gebruik van het vervormde weefsel aan de verzegelde rand.</li>
	<li>Plaats elk stuk gesneden omentum in afzonderlijke putjes van een kweekplaat met 24 putjes en vul de putjes met 500 μL omentum-kweekmedia of tot een volume dat voldoende is om het omentum te bedekken zonder het omentumstuk boven de putbodem te laten zweven (Figuur 2B).</li>
	<li>Bewaar stukjes omentum in verse kweekmedia bij 4 °C tot ze klaar zijn voor injectie.</li>
</ol>2. Bereiding van eierstokkankercellen
<ol><li>Kweek menselijke eierstokkankercellen in een kweekkolf van 75cm2 bij 37 °C en 5% CO2 tot ten minste 75% confluentie op de dag van de afname van het ummentum. OPMERKING: Dit protocol maakt gebruik van mCherry-positieve OCSC1-F2 menselijke eierstokkankercellen die eerder zijn beschreven 15,16,17,18. Het kan worden aangepast aan elke kankercellijn die is gelabeld met een fluorescentiesignaal.</li>
	<li>Bereid de cellen voor in een laminaire stroomkap onmiddellijk na het verzamelen van het omentummonster. Zorg ervoor dat alle materialen en gereedschappen steriel of gesteriliseerd zijn.</li>
	<li>Voeg 10 ml steriele 1x PBS toe aan de kweekkolf en was de cellen door de kolf zachtjes te schudden. Verwijder de 1x PBS en voeg vervolgens 3 ml 0,05% trypsine-EDTA toe.</li>
	<li>Schud de kweekkolf voorzichtig om alle cellen te bedekken en plaats de kolf vervolgens niet langer dan 5 minuten in een incubator (37 °C en 5% CO2). Tik op de kweekkolf om de cellen volledig los te maken en neutraliseer vervolgens trypsine door 3 ml omentum-kweekmedia toe te voegen.</li>
	<li>Meng de celsuspensie door te pipetteren en breng de suspensie vervolgens over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 1.200 x g bij 24 °C. Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 6 ml verse omentum kweekmedia.</li>
	<li>Tel de cellen met behulp van een hemacytometer. Verdun de celsuspensie tot ten minste 100.000 cellen per 100-200 μL suspensie. Dit is het volume van de injectie in elk gesneden stuk omentum.</li>
	<li>Breng een passend aantal cellen over in een nieuwe kweekkolf om de celpassage voort te zetten.</li>
</ol>3. Injectie van eierstokkankercellen
<ol><li>Gebruik een spuit van 1 ml om de celsuspensie op te zuigen en bevestig vervolgens een naald van 26 G. Trek de celsuspensie niet op met de naald, omdat dit de cellen kan fragmenteren.</li>
	<li>Gebruik een kleine chirurgische pincet om een stuk gesneden omentum op te pakken. Breng het omentum over in een aparte steriele schaal om de injectie te vergemakkelijken. Prik voorzichtig met de punt van de naald in het omentum en injecteer een klein volume celsuspensie in het weefsel (figuur 2C).</li>
	<li>Herhaal de injectie over verschillende delen van het omentum tot een totaal volume van ten minste 100 μL of 100.000 cellen. Merk op dat een groot deel van de celsuspensie zich rond het monster lijkt te verzamelen. Als er bezorgdheid bestaat over de kwaliteit van de injectie, herhaal dan de injectie of injecteer een groter volume celsuspensie in het monster.</li>
	<li>Plaats de geïnjecteerde omentummonsters terug in elk putje van een kweekplaat met 24 putjes. Houd er rekening mee dat het volume van de omentum-kweekmedia op een niveau is dat het omentum bedekt zonder het te laten drijven. Behandel de plaat voorzichtig en plaats deze in een incubator (37 °C en 5% CO2).</li>
	<li>OPTIONEEL: Gebruik Matrigel (basaalmembraanmatrix) om ommentumweefsel in een vaste matrix op te schorten om gemakkelijker te kunnen injecteren en meer geconcentreerde celsuspensie af te geven.<ol><li>Ontdooi de basaalmembraanmatrix bij 4 °C en meng direct voor gebruik in een verhouding van 1:1 met de omentumcultuurmedia. Bewaar het basaalmembraanmatrixmengsel tot injectie op ijs of bij 4 °C. Vul lege putjes met voldoende basaalmembraanmatrixmengsel om een gesneden stuk omentum onder te dompelen.</li>
		<li>Plaats de monsters in het basaalmembraanmatrixmengsel en plaats vervolgens de kweekplaat met 24 putjes gedurende 20 minuten in een incubator (37 °C en 5% CO2). Zodra het mengsel gestold is, gaat u verder met injecteren zoals hierboven beschreven.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestig een succesvolle injectie met behulp van fluorescerende beeldvorming. Zorg ervoor dat een streep fluorescerend signaal wordt gevisualiseerd op de injectieplaatsen (Figuur 2D). Merk op dat het werkelijke aantal cellen dat na injectie aan het omentum is gehecht, onvoorspelbaar is.</li>
</ol>4. Co-cultuur van menselijke omentum- en eierstokkankercellen
<ol><li>Vervang het medium elke 48-72 uur door 500-2000 μL verse omentum-kweekmedia toe te voegen. Pipetteer geen media rechtstreeks op het omentumweefsel, omdat dit kankercellen kan verdringen. Houd er rekening mee dat als de mediakleur geel wordt, u de media wijzigt. OPMERKING: De frequentie van mediawisseling hangt af van het volume van de gebruikte media en het traject van de groei van kankercellen. Zodra de kankercellen het omentum hebben gezaaid, is het niet meer belangrijk of het stuk omentum al dan niet drijft.</li>
	<li>OPTIONEEL: Als een basaalmembraanmatrix werd gebruikt, zou de matrix doorgaans worden opgelost tegen de tijd van de eerste mediawissel.</li>
	<li>Bewaak de groei van eierstokkankertumoren met behulp van fluorescerende beeldvorming. De frequentie van beeldvorming is ter beoordeling van de onderzoeker. Anticipeer op tekenen van kleine tumoren met ongeveer 14 dagen (Figuur 3A-C). De resultaten kunnen variëren afhankelijk van de kwaliteit van de injectie.</li>
	<li>Beëindig het experiment op basis van het eindpunt van het experiment. OPMERKING: Tumorgroei en integriteit van omentumweefsel zijn waargenomen in de afgelopen 50 dagen.</li>
</ol>

Het opstellen van een 3D ex vivo-model voor de interactie tussen eierstokkanker en Omentum

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).</li>
<li>Berek, J. S., Renz, M., Kehoe, S., Kumar, L., Friedlander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+of+the+ovary%2C+fallopian+tube%2C+and+peritoneum%3A+2021+update%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Gynaecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum: 2021 update.</a> Int J Gynaecol Obstet. 155 (Suppl 1), 61-85 (2021).</li>
<li>Ledermann, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+diagnosed+and+relapsed+epithelial+ovarian+carcinoma%3A+ESMO+clinical+practice+guidelines+for+diagnosis%2C+treatment+and+follow-up%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Newly diagnosed and relapsed epithelial ovarian carcinoma: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up.</a> Ann Oncol. 24 (Suppl 6), vi24-32 (2013).</li>
<li>Jelovac, D., Armstrong, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+diagnosis+and+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the diagnosis and treatment of ovarian cancer.</a> CA Cancer J Clin. 61 (3), 183-203 (2011).</li>
<li>Morgan, R. J. Jr, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer.+Clinical+practice+guidelines+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Compr+Canc+Netw%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer. Clinical practice guidelines in oncology.</a> J Natl Compr Canc Netw. 6 (8), 766-794 (2008).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nat Med. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Motohara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolving+story+of+the+metastatic+voyage+of+ovarian+cancer+cells%3A+cellular+and+molecular+orchestration+of+the+adipose-rich+metastatic+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">An evolving story of the metastatic voyage of ovarian cancer cells: cellular and molecular orchestration of the adipose-rich metastatic microenvironment.</a> Oncogene. 38 (16), 2885-2898 (2019).</li>
<li>Di Nicola, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omentum+a+powerful+biological+source+in+regenerative+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Omentum a powerful biological source in regenerative surgery.</a> Regen Ther. 11, 182-191 (2019).</li>
<li>Meza-Perez, S., Randall, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+functions+of+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological functions of the omentum.</a> Trends Immunol. 38 (7), 526-536 (2017).</li>
<li>Liu, M., Silva-Sanchez, A., Randall, T. D., Meza-Perez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+immune+responses+in+the+peritoneal+cavity+and+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Specialized immune responses in the peritoneal cavity and omentum.</a> J Leukoc Biol. 109 (4), 717-729 (2021).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+facilitate+ovarian+cancer+premetastatic+niche+formation+in+the+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils facilitate ovarian cancer premetastatic niche formation in the omentum.</a> J Exp Med. 216 (1), 176-194 (2019).</li>
<li>Cardenas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+microenvironment+promotes+Bclxl+expression+and+confers+chemoresistance+in+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Adipocyte microenvironment promotes Bclxl expression and confers chemoresistance in ovarian cancer cells.</a> Apoptosis. 22 (4), 558-569 (2017).</li>
<li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-associated+adipocytes%3A+key+players+in+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Cancer-associated adipocytes: key players in breast cancer progression.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 95(2019).</li>
<li>Zhang, Z., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue%3A+The+dysfunctional+adipocyte+-+a+cancer+cell%27s+best+friend%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue: The dysfunctional adipocyte - a cancer cell's best friend.</a> Nat Rev Endocrinol. 14 (3), 132-134 (2018).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRX-E-002-1+Induces+c-Jun-dependent+apoptosis+in+ovarian+cancer+stem+cells+and+prevents+recurrence+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">TRX-E-002-1 Induces c-Jun-dependent apoptosis in ovarian cancer stem cells and prevents recurrence in vivo.</a> Mol Cancer Ther. 15 (6), 1279-1290 (2016).</li>
<li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+approach+for+the+detection+of+intraperitoneal+micrometastasis+using+an+ovarian+cancer+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Novel approach for the detection of intraperitoneal micrometastasis using an ovarian cancer mouse model.</a> Sci Rep. 7, 40989(2017).</li>
<li>Craveiro, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+modifications+in+ovarian+cancer+stem+cells+following+Paclitaxel+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic modifications in ovarian cancer stem cells following Paclitaxel treatment.</a> Cancer Med. 2 (6), 751-762 (2013).</li>
<li>Sumi, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+for+non-invasive+imaging+to+detect+and+monitor+ovarian+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model for non-invasive imaging to detect and monitor ovarian cancer recurrence.</a> J Vis Exp. (93), e51815(2014).</li>
<li>Agarwal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+migration+inhibitory+factor+expression+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Obstet+Gynecol%22%5BJournal%5D)">Macrophage migration inhibitory factor expression in ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 196 (4), 348.e1-348.e5 (2007).</li>
<li>Kelly, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR-4+signaling+promotes+tumor+growth+and+paclitaxel+chemoresistance+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">TLR-4 signaling promotes tumor growth and paclitaxel chemoresistance in ovarian cancer.</a> Cancer Res. 66 (7), 3859-3868 (2006).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CBX7+binds+the+E-box+to+inhibit+TWIST-1+function+and+inhibit+tumorigenicity+and+metastatic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">CBX7 binds the E-box to inhibit TWIST-1 function and inhibit tumorigenicity and metastatic potential.</a> Oncogene. 39 (20), 3965-3979 (2020).</li>
<li>Tedja, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+epithelial-mesenchymal+hybrid+cancer+cells+with+tumorigenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Generation of stable epithelial-mesenchymal hybrid cancer cells with tumorigenic potential.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 15030684(2023).</li>
<li>Dauleh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cultured+mesothelial+cells+derived+from+the+murine+adult+omentum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cultured mesothelial cells derived from the murine adult omentum.</a> PLoS One. 11 (7), e0158997(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Met behulp van dit protocol werd een preklinisch model van peritoneale carcinomatose voor eierstokkanker ontwikkeld met behulp van een combinatie van basale in vitro en ex vivo technieken. Een progressieve tumorgroei werd waargenomen gedurende 50 dagen co-cultuur na het zaaien van omentum-monsters met mCherry+ OCSC1-F2 menselijke eierstokkankercellen. Deze methode is ontwikkeld en geoptimaliseerd in verschillende experimentele onderzoeken met verschillende omentum-monsters. Succesvolle tumorgroei hing af van de kwaliteit van het omentum, de levensvatbaarheid van kankercellen en de effectiviteit van de injectie. In dit rapport hebben we alleen mCherry+ OCSC1-F2-cellen en mCherry+ R182-lijnen voor menselijke eierstokkanker gebruikt die eerder in verschillende publicaties zijn gerapporteerd 12,15,16,17,18,19,20,21,22. Met behulp van deze twee cellijnen met verschillende verdubbelingstijden (16 uur voor OCSC1-F2 en 36 uur voor R182) werd een verschil opgemerkt in de tijd die nodig was om logaritmische groei in het omentale weefsel te bereiken. Toch zijn we erin geslaagd om beide cellijnen in het co-cultuursysteem tot stand te brengen.
Efficiënte communicatie tussen onderzoekers, onderzoekscoördinatoren en chirurgische teams was van cruciaal belang voor het verzamelen en verwerken van omentummonsters. De onderzoeker identificeerde protocolkandidaten, de onderzoekscoördinatoren kregen toestemming van patiënten vóór de operatie en de onderzoeker verzamelde de monsters uit de operatiekamer. Gezien deze workflow moest het schema van de onderzoeker flexibel zijn, aangezien veel patiëntzijdige factoren die van invloed waren op de verzameling onvoorspelbaar waren (bijv. operatie geannuleerd, tijdstip van operatie gewijzigd, ontoereikend of geen omentum verwijderd). Directe visualisatie en selectie van weefsels uit de operatiekamer zorgden voor de integriteit van het monster, chirurgische steriliteit en tijdige verwerking. Aanvankelijk werd het verzamelen van specimens gedelegeerd aan onderzoekscoördinatoren; Nadat er echter een paar monsters waren verzameld, merkten we op dat de verwerkingstijd vertraagd was (d.w.z. >4 uur) en dat de kwaliteit van Omentum schromelijk inferieur was (bijv. weefsel was in stukken). In één experimenteel onderzoek werd omentaal weefsel gedurende 48 uur voorafgaand aan de injectie bij 4 °C bewaard, omdat kankercellen niet op tijd klaar waren. Vergelijkbare tumorgroei werd nog steeds waargenomen, maar deze sequentie werd niet herhaald omdat bekend is dat temperatuurveranderingen de micro-omgeving van de tumor (TME) beïnvloeden.
Vóór het verzamelen van monsters was het belangrijk om voldoende confluente kankercellen te hebben volgens het operatieschema. Omdat het aantal monsters dat elke maand werd verzameld varieerde, werden actieve culturen van eierstokkankercellen niet altijd gehandhaafd. De ingevroren cellen werden minstens 1 week van tevoren ontdooid, geplateerd volgens een standaardprotocol en vervolgens minstens één keer langs de cellen gegaan om de levensvatbaarheid te garanderen. De cellijnen die in dit protocol werden gebruikt, waren relatief veerkrachtig; We kwamen echter nog steeds gevallen tegen waarin cellen op de dag van de operatie niet waren hersteld en niet konden worden geïnjecteerd. In deze studie werd geen poging gedaan om kankercellen te injecteren die minder dan 50% confluent waren. Latere vertragingen met betrekking tot celvoorbereiding werden verzacht door gebruik te maken van een goede steriele techniek en cellen te splitsen in verhoudingen om de samenvloeiing te behouden, afhankelijk van het verwachte schema voor het verzamelen van monsters. We hebben het protocol beperkt tot slechts twee fluorescerend gelabelde kankercellijnen, maar het is belangrijk op te merken dat andere gevestigde kankercellijnen of primaire kankercellen zonder fluorescerende eiwitten ook kunnen worden gebruikt.
Ten slotte was de snelheid van tumorgroei gecorreleerd met de samenvloeiing van kankercellen naast en in adipocyten onmiddellijk na injectie. Dit werd bepaald door fluorescerende beelden te maken van alle omentummonsters na injectie. Vergeleken met tumorcelinoculatie van vaste organen of onderhuidse weefsels, was het injecteren van kankercellen in omentaal weefsel een grotere uitdaging. De losse structuur en vetconsistentie van omentum voorkomen dat het weefsel effectief volumes celsuspensie vasthoudt zonder te lekken. Wanneer een kleinere naald (d.w.z. 30 G of smaller) werd gebruikt om te injecteren, was er bezorgdheid over celfragmentatie omdat de celproliferatie werd verminderd. We hebben verschillende injectietechnieken, celaantallen en celsuspensievolumes getest en consistente resultaten gevonden met het hierboven beschreven protocol. Tegelijkertijd erkennen we dat dergelijke variaties in het protocol waarschijnlijk nog steeds vergelijkbare resultaten zullen opleveren, gezien de kwaadaardige aard van de cellen. De toevoeging van Matrigel maakte de injectiestap gemakkelijker omdat de extracellulaire matrix de celsuspensie beter vasthield; Deze methode is echter duurder en produceerde niet consequent een hogere tumorbelasting in de monsters. Over het algemeen was het zeldzaam dat een van de omentum-exemplaren geen tumoren liet groeien, maar het aantal tumoren en de groeisnelheid varieerden.
Dit model simuleerde een kenmerk van tumorigenese van eierstokkanker door vroege metastase te repliceren naar vetrijke peritoneale weefsels. Dit protocol maakt variatie mogelijk zonder vereiste vaardigheid, is gemakkelijk te repliceren en genereert een systeem met potentiële translationele waarde. Vergeleken met bestaande in vitro en ex vivo modellen bij eierstokkanker, combineert de hier beschreven methode verschillende technieken om een model te produceren dat de tumorarchitectuur en TME gedurende een lange levensduur behoudt. Bovendien zagen we dat wanneer een omentum-monster met meerdere tumoren werd overgebracht naar een nieuw putje en werd gekweekt met kankervrij omentum (d.w.z. niet geïnjecteerd), het naïeve omentum binnen 7 dagen werd bezaaid met kankercellen. Deze bevinding suggereert dat de gerepliceerde tumoren metastatisch potentieel behouden via epitheliale-mesenchymale overgang. We hebben in de literatuur geen vergelijkbare eierstokkankermodellen geïdentificeerd die weefselbiopten gedurende langere tijd kweekten. Deze benadering wordt ondersteund door een eerdere bevinding dat mesotheelcellen geïsoleerd uit muizenomentum na verzameling gedurende meer dan 30 passages kunnen worden gekweekt23.
Het model dat in deze studie wordt beschreven, kan worden gebruikt om het effect van directe interactie tussen eierstokkankercellen en de cellen in het vetrijke omentum beter te begrijpen. Kankercellen kunnen worden losgekoppeld van de omentumweefsels en worden verkregen voor transcriptomische of immunohistochemische (IHC) analyse. Bovendien kunnen cellen worden gebruikt voor onderzoeken naar de respons op geneesmiddelen.
De belangrijkste beperkingen van dit model zijn dat het aantal tumoren, de snelheid van tumorgroei en de locatie van tumoren onvoorspelbaar waren. Gebrek aan standaardisatie en variatie tussen steekproeven zou de toepassing van dit model kunnen beperken. We hebben ook een aantal observaties gedaan die verder moeten worden onderzocht tijdens de ontwikkeling van dit protocol. De "controle"-replicaten in één experiment waren bijvoorbeeld niet echt kankervrij, omdat de patiënt vervolgens werd gediagnosticeerd met omentale micrometastase; De niet-geïnjecteerde tumoren bleven echter levensvatbaar gedurende de experimentele periode. Toekomstige toepassingen van dit model zijn onder meer moleculaire studies van de TME tijdens vroege tumorigenese, manipulatie van de TME door het injecteren van immuuncellen en onderzoek naar de respons van geneesmiddelen. Samenvattend zijn we van mening dat het hier beschreven preklinische model een aanvulling zal zijn op het repertoire van bestaande onderzoeksinstrumenten en zal helpen bij het ophelderen van moleculaire mechanismen van TME bij eierstokkanker.

Eierstokkanker is wereldwijd de dodelijkste gynaecologische maligniteit1. Het levenslange risico om deze kanker te ontwikkelen is ongeveer 1 op 70, met de mediane leeftijd van diagnose op 63-jarige leeftijd2. Primaire ovariële maligniteiten worden histologisch geclassificeerd als epitheliaal of niet-epitheel. Epitheliale eierstokkankers (EOC) vertegenwoordigen meer dan 90% van de tumoren en het meest voorkomende subtype is hooggradig sereus carcinoom (HGSC), dat goed is voor ongeveer 70%-80% van de EOC's. Momenteel zijn er geen effectieve screeningsmethoden om ziekten vroegtijdig op te sporen. De meeste patiënten worden dus in een vergevorderd stadium gediagnosticeerd (d.w.z. Fédération Internationale de Gynécologie et d'Obstétrique [FIGO] stadium III of IV) nadat de kanker zich door de peritoneale holte heeft verspreid2.
Standaard eerstelijnsbehandeling is cytoreductieve chirurgie om alle zichtbare macroscopische ziekten te verwijderen, gevolgd door adjuvante chemotherapie op basis van platina om eventuele resterende microscopische ziekte te vernietigen. Hoewel er de afgelopen twee decennia veel vooruitgang is geboekt in de behandeling van eierstokkanker, zal ongeveer 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte binnen 3 jaarna de behandeling terugvallen. Gezien de over het algemeen slechte prognose van deze patiënten, zijn lopende en toekomstige translationele onderzoeksinspanningen in EOC gericht op het identificeren van biomarkers voor vroege detectie, het voorkomen van metastase, het verbeteren van huidige therapieën om resistentie te omzeilen en het ontwikkelen van nieuwe gepersonaliseerde kankerbehandelingen.
Gegeneraliseerde metastase in de peritoneale holte en de bijbehorende chemoresistentie zijn twee van de belangrijkste beperkingen voor de verbetering van de behandeling van patiënten met eierstokkanker 4,5. Het omentum, een vette schortachtige structuur die vanuit de maag over de darmen naar beneden hangt, is een belangrijke plaats van uitzaaiingen van eierstokkanker 6,7. Naast zijn functie als fysieke barrière, is aangetoond dat het omentum regeneratieve en angiogene capaciteiten heeft en immuunactiviteiten bezit, die samen de vascularisatie bevorderen, wondgenezing versnellenen infectie beperken. Het bevat een hoge concentratie stamcellen die kunnen differentiëren in verschillende celtypen en kunnen helpen bij het herstellen van beschadigde weefsels. Het omentum kan ontstoken raken als reactie op letsel of infectie, wat de migratie van immuuncellen naar de plaats van verwonding activeert9. Deze immuuncellen geven groeifactoren en andere moleculen af die helpen om het herstel en de regeneratie van beschadigd weefsel te bevorderen. Immuuncellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen, gelokaliseerd in het omentum zijn structuren die bekend staan als "melkachtige vlekken", die verantwoordelijk zijn voor het detecteren en aanvallen van ziekteverwekkers en het reguleren van peritoneale immuniteit. Van het omentum is ook aangetoond dat het een rol speelt bij het induceren van immuuntolerantie10, het vermogen van het immuunsysteem om zelfantigenen te tolereren en gezonde weefsels niet aan te vallen. Dezelfde immuungerelateerde activiteiten zijn echter ook betrokken bij pathologische reacties, zoals de groei van omentale tumoren, metastase en ontsnapping aan immuunsurveillance 9,11. Eerdere studies van ons laboratorium en anderen hebben een unieke en actieve rol van de vetmicro-omgeving aangetoond bij de remming van antitumorale immuunresponsen en bij het verwerven van chemoresistentie12,13,14. Helaas hebben we beperkte informatie over de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee het omentum een pro-tumorale micro-omgeving biedt.
Om de interacties tussen kankercellen en het omentum beter te begrijpen, werd een 3D-kweeksysteem ontwikkeld dat bestaat uit menselijke eierstokkankercellen en van patiënten afgeleide omentum-explantaten. Het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een nieuw ex vivo model van peritoneale carcinomatose. Dit model bootst de natuurlijke progressie van tumorigenese van eierstokkanker na in dit vetrijke weefsel. Het voorgestelde model is eenvoudig te genereren, goedkoop en mogelijk toepasbaar op translationeel onderzoek in onderzoek naar eierstokkanker.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Insulin Syringe met 26 G afneembare naald</td><td>BD</td><td>329652</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Serologische pipetten</td><td>CELLTREAT</td><td>229010B</td><td></td></tr><tr><td>100 mm weefselkweekschaal</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Centrifugeerbuis</td><td>CELLTREAT</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>24 Welcelkweekplaat</td><td>Costar</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Centrifugeerbuis</td><td>CELLTREAT</td><td>229421</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 weefselkweekkolf</td><td>CELLTREAT</td><td>229341</td><td></td></tr><tr><td>Corning Celteller</td><td>Corning</td><td>9819000</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 imager</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L natriumbicarbonaat</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum, gekwalificeerd</td><td>Gibco</td><td>1043028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>Nr. 10 roestvrijstalen wegwerp scalpel</td><td>Integra-Miltex</td><td>4410</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaatgebufferd zout, pH 7.4 (1x)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Revolve microscoop</td><td>Echo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Eierstokkanker is de dodelijkste gynaecologische maligniteit. Het omentum speelt een sleutelrol bij het bieden van een ondersteunende micro-omgeving voor uitgezaaide eierstokkankercellen, evenals immuunmodulerende signalen die tumortolerantie mogelijk maken. We hebben echter beperkte modellen die de interactie tussen eierstokkankercellen en vetrijke weefsels nauw nabootsen. Om meer inzicht te krijgen in de cellulaire en moleculaire mechanismen waarmee het omentum een pro-tumorale micro-omgeving biedt, hebben we een uniek 3D ex vivo-model ontwikkeld van de interactie tussen kankercellen en omentum. Met behulp van menselijk omentum zijn we in staat om eierstokkankercellen te kweken in deze vetrijke micro-omgeving en de factoren te volgen die verantwoordelijk zijn voor tumorgroei en immuunregulatie. Naast het bieden van een platform voor de studie van deze vetrijke tumormicro-omgeving, biedt het model een uitstekend platform voor de ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen om uitgezaaide kankercellen in deze niche aan te pakken. Het voorgestelde model is eenvoudig te genereren, goedkoop en toepasbaar op translationele onderzoeken.

Succesvolle vestiging van eierstokkankercellen in omstreeks dag 14 was duidelijk (Figuur 3A-C). Per verzameld monster werden ten minste 24 replicaten geprepareerd en geïnjecteerd om verdere experimenten mogelijk te maken. De tumorgroei werd gevolgd door fluorescerende beelden te maken (Figuur 3D,E). Beelden moesten zorgvuldig worden geïnterpreteerd, aangezien er ook een monolaag kankercellen groeide op de bodem van elk putje dat niet aan het omentum was bevestigd. We gaven er de voorkeur aan om foto's van het omentum te maken wanneer het in media was opgehangen om overlappende fluorescerende signalen met de monolaag van de kankercel te voorkomen.
De afwezigheid van een fluorescerend signaal op dag 14 kan worden beschouwd als mislukte injecties. Er werd waargenomen dat de kankercellen zich aanvankelijk gedurende de eerste 7 dagen over het oppervlak van het omentum verspreidden, maar na verloop van tijd kwamen ze samen om tumoren te vormen (Figuur 3A-D). Een surrogaatmaat voor tumorbelasting tussen monsters was de snelheid waarmee de omentumkweekmedia van kleur veranderden van rood naar geel (Figuur 3F). We gebruikten fluorescerende beeldvorming, histologische beoordeling en grove inspectie om de tumorgroei en de levensvatbaarheid van het omentale weefsel na 50 dagen co-cultuur te bevestigen (Figuur 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig01.jpg"> Figuur 1: Illustratie van algemene stappen in het protocol. (A) Stap 1: Voorbereiding van het omentum; (B) Stap 2: injectie van kankercellen; (C) Stap 3: totstandbrenging van de micro-omgeving van kankercellen en omtentum. (Figuur opgesteld in BioRender.com). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig02.jpg"> Figuur 2: Bereiding en injectie van kankercellen in het omentum . (A) Omentum wordt in stukken van 1x1 cm gesneden. (B) Elk stuk wordt in een putje met een plaat met 24 putjes geplaatst en bedekt met 500 μL media. (C) Injectie van kankercellen in het stuk van het umentum. (D) Na injectie wordt een streep fluorescerende kankercellen waargenomen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig03.jpg"> Figuur 3: Representatieve beelden na 14 en 25 dagen co-cultuur. (A-C) Representatieve beelden na 14 dagen co-cultuur: (A) fase, (B) mCherry-kanaal, (C) samengevoegd. (D-E) Representatieve beelden na 25 dagen co-cultuur. (F) Verandering in mediakleur van roze naar geel is een indicatie van succesvolle injectie van kankercellen en het opzetten van co-cultuur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66031/66031fig04.jpg"> Figuur 4: Bruto morfologie en hematoxyline en eosine (H&E) kleuring. (A,B) Representatieve brutomorfologie van co-culturen op dag 50; pijlen wijzen naar groeiplaatsen van mCherry+ eierstokkankercellen. (C,D) Representatieve H&E-kleuring van co-culturen op dag 50. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66031/66031fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft de opstelling van een driedimensionaal (3D) ex vivo model van de interactie tussen kankercellen en omtentum. Het model biedt een platform voor het ophelderen van pro-tumormechanismen binnen de vetniche en voor het testen van nieuwe therapieën.

Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

Huidige studies maken gebruik van co-cultuursystemen die bestaan uit geïsoleerde adipocyten en eierstokkankercellen. Deze adipocyten worden in vitro onderscheiden van pre-adipocyten. Deze cellen worden vervolgens gescheiden door middel van een transwell-insert en missen daarom direct cel-tot-celcontact.Deze ex vivo kweekmethode biedt een model om de directe interactie van kankercellen met de vetmicro-omgeving te bestuderen. Ons model behoudt de structuur van het menselijk momentum en handhaaft daarom de verschillende celtypen die zich typisch in dit orgaan bevinden. Naast adipocyten omvatten deze cellen zowel ondersteunende fibroblasten als immuuncellen.Dit model handhaaft ook deze cellen in hun inherente matrix. Dit model biedt een uitstekend platform voor de ontwikkeling en evaluatie van nieuwe therapeutische benaderingen om gemetastaseerde kankercellen in deze niche aan te pakken.

an-ex-vivo-model-ovarian-cancer-peritoneal-metastasis-using-human

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

De mesotheelcellen klaring test hier beschreven maakt gebruik van fluorescent gelabelde cellen en time-lapse video-microscopie kwantitatief te visualiseren en meten van de interacties van eierstokkanker meercellige sferoïden en mesotheelcellen cel monolagen. Deze test modelleert de eerste stappen van eierstokkanker metastase.

In vitro Mesothelial Ontruiming Assay dat de modellen van de vroege stappen van eierstokkanker Metastase

In this video, we demonstrate the development of  an in vitro  three-dimensional model of the lining of the peritoneal cavity. This organotypic culture can help to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Modeling Ovarian Cancer Metastasis in Peritoneal Cavity Lining: A Method To Establish an In Vitro 3D Model of the Peritoneal Lining

This video describes the protocol to isolate primary human mesothelial cells from the human omentum specimen. The mesothelial cells can be used to establish an in vitro ovarian cancer model to investigate ovarian cancer cell adhesion, invasion, and proliferation.

Mesothelial Cell Isolation: A Technique to Isolate Primary Mesothelial Cells From Human Omentum Tissue Specimen

In this video, we establish an ex vivo omental organ culture overlaid with GFP-expressing ovarian cancer cells to study ovarian cancer colonization within the omental explant. This protocol analyzes immune cell structures within the omentum known as milky spots that promote metastases.

Modeling Ovarian Cancer Cell Colonization of Omentum: An Ex Vivo Method to Establish Milky Spot Colonization of Fluorescently Labeled Ovarian Cancer Cells in Murine Omentum Explants

This video describes the protocol for creating a murine experimental model to study tumor development and peritoneal metastasis. This ovarian cancer model is generated by the orthotopic inoculation of human epithelial ovarian cancer cells into the ovaries of a female mouse.

Orthotopic Inoculation of Ovarian Cancer Cells into Murine Ovary: A Procedure to Establish an Ovarian Cancer Mouse Model to Study Peritoneal Dissemination of Cells

We schetsen een protocol dat zowel in vivo als ex vivo benaderingen implementeert om de kolonisatie van peritoneale vetweefsels door eierstokkanker te bestuderen, met name het omentum. Bovendien presenteren we een protocol om immuuncelstructuren in het omentum, bekend als melkvlekken, te kwantificeren en te analyseren, die metastasen van peritoneale vetweefsels bevorderen.

In vivo en ex vivo benaderingen van eierstokkanker uitgezaaide Kolonisatie van Milky Spot Structuren Bestudeer in peritoneale Adipose

Eierstokkankermetastase wordt gekenmerkt door talrijke diffuse intra-peritoneale laesies, waardoor nauwkeurige visuele kwantificering van de tumorbelasting een uitdaging is. Hierin beschrijven we een methode voor in situ en ex vivo kwantificering van de metastatische tumorbelasting met behulp van rood fluorescerend proteïne (RFP)-gelabelde tumorcellen en optische beeldvorming.

Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Hier presenteren we een protocol om een driedimensionaal in vitro model te construeren van de bekleding van de peritoneale holte, samengesteld uit primaire humane mesotheliële cellen en fibroblasten, bedekt met extracellulaire matrix, als een hulpmiddel om de adhesie, invasie en proliferatie van ovariële kankercellen te onderzoeken.

Modelleren van de eerste stappen van eierstokkanker Verspreiding in een Organotypische Cultuur van de menselijke buikholte

Het meerstaps proces van peritoneale verspreiding van ovariumcarcinoom verduidelijken de huidige studie beschrijft een murine experimenteel model van originele tumorontwikkeling en metastase via orthotope peritoneale inoculatie met deze tumorcellen.

Murine Experimental Model van de oorspronkelijke tumor Ontwikkeling en peritoneale metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotope Inenting met ovariumcarcinoom Cells

Dit manuscript beschrijft de ontwikkeling van een diermodel dat directe testen van de effecten van tumorhypoxie op metastase en het ontcijferen van de werkingsmechanismen mogelijk maakt. Hoewel de hier beschreven experimenten zich richten op Ewing-sarcoom, kan een vergelijkbare aanpak worden toegepast op andere tumortypen.

In vivo model voor het testen Effect van hypoxie op tumormetastase

Leer een 3D ex vivo-model van eierstokkanker met behulp van humaan omentum. Dit model behoudt de weefselstructuur en maakt directe interactie met het vetweefselmicroklimaat mogelijk voor onderzoek naar nieuwe therapieën.

Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Meer video's verkennen