Name: Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Leer de fabricage van colorectale kanker organoïden uit de SW1222-cellijn met ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix. Deze methode optimaliseert matrixsamenstellingen voor effectieve groei en draagt bij aan regeneratieve geneeskunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door de King Abdullah University of Science and Technology. De auteurs erkennen KAUST's Seed Fund Grant en KAUST's Innovation Fund toegekend door KAUST's Innovation and Economic Development. De auteurs willen de Bioscience and Imaging Core Labs van KAUST bedanken voor hun ondersteuning van de biologische karakterisering en microscopie-analyses.

1. Buffer en voorbereiding van de oplossing
OPMERKING: Alle vermelde concentraties zijn eindconcentraties.
<ol><li>Voeg foetaal runderserum (FBS) en penicilline-streptomycine toe in een eindconcentratie van respectievelijk 10% en 1% om Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) te bereiden. Maximaal 1 maand in het donker bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Meng MgCl2 (3 mM), sucrose (300 mM) en Triton X-100 (0,5%) in fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) om de permeabilisatiebuffer voor te bereiden. Bewaar deze oplossing maximaal 2 maanden bij 4 °C.</li>
	<li>Combineer runderserumalbumine (BSA, 1%), glycine (0,3 M) en Tween-20 (0,1%) in PBS om een blokkerende buffer te bereiden. Bewaar deze oplossing maximaal 2 maanden bij 4 °C.</li>
	<li>Verdun 10x tot 2x PBS met ultrapuur water onder steriele omstandigheden. Bewaar deze oplossing langer dan 6 maanden bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Steriliseer 3 mg van het peptidepoeder onder ultraviolet licht gedurende 30 minuten. Voeg 500 μL ultrapuur water toe om op te lossen met behulp van een vortexmixer. OPMERKING: De uiteindelijke concentratie moet tweemaal de doelconcentratie zijn, d.w.z. 6 mg/ml, aangezien de concentratie van 1x 3 mg/ml zal zijn.</li>
</ol>2. Colorectale kanker organoïde fabricage van SW1222 in peptide
<ol><li>Ontdooi een aliquot een nacht bij 4 °C en bewaar het in ijs tot het nodig is om de matrixregeling in de kelder voor te bereiden.</li>
	<li>Plaats een druppel van 10 μL van 2x peptideoplossing in het midden van elk putje in een plaat met 24 putjes. Laat de plaat 10 minuten op kamertemperatuur incuberen. U kunt ook 8-10 druppels per putje deponeren in een plaat met 6 putjes. OPMERKING: Monsters die bedoeld zijn om te worden gebruikt in confocale en elektronenmicroscopie zijn toegankelijker om te manipuleren als ze op een steriel dekglaasje worden gezaaid.</li>
	<li>Voeg 10 μL van 2x PBS toe. Meng de PBS-oplossing voorzichtig met behulp van de tip. Laat de gels minstens 20 minuten stabiliseren en zorg ervoor dat de druppels bijna intact blijven. OPMERKING: Het doel van PBS-toevoeging en voorzichtig mengen is om de integriteit van de druppel te behouden en te voorkomen dat de hydrogel zich in een laag verspreidt.</li>
	<li>Maak SW1222-cellen los met 0,125% trypsine-EDTA-oplossing (5 ml). Incubeer de cellen met trypsine bij 37 °C gedurende 5-10 minuten totdat ze loskomen van de kolf. Tik niet op de kolf om celklontering te voorkomen.</li>
	<li>Voeg 5 ml compleet medium toe om de trypsine te inactiveren. Filtreer de celsuspensie met behulp van een celzeef van 30 μm. U kunt ook een injectiespuit met een naald van 25 G gebruiken om de aggregaten te verstoren.</li>
	<li>Bereid een celsuspensie van 0,4 × 106 cellen/ml en injecteer 2 μl van de celsuspensie in elke peptidedruppel met behulp van een micropipet van 10 μl.</li>
	<li>Incubeer de druppels gedurende 30 minuten bij 37 °C, 5% CO2. Voeg na incubatie 0,5 ml bijgevuld medium toe aan elk putje.</li>
	<li>Bereid tijdens het wachten de controle van de basale membraanmatrix voor door de hoofdvoorraad (8-12 mg/ml, afhankelijk van de partij) te verdunnen tot een eindconcentratie van 3 mg/ml met behulp van het bijgevulde medium. Voeg cellen toe aan deze oplossing (800 cellen per 25 μL). NOTITIE: De manipulatie van het basale membraan moet te allen tijde op ijs worden uitgevoerd. De tips moeten worden afgespoeld in ijskoude PBS voordat ze de hydrogel aanraken. Anders vindt polymerisatie plaats in de uiteinden.</li>
	<li>Plaat 20 μL druppeltjes van de basaalmembraanoplossing in elk putje. Laat de druppels geleren door ze 20 minuten bij 37 °C te laten incuberen. Nadat het materiaal is gegeleerd, voegt u 0,5 ml volledig medium toe.</li>
	<li>Vervang het medium elke 3-4 dagen. Observeer de cellen die zich al op dag 4 organiseren en signalen van lumenvorming vertonen.</li>
	<li>Beeldcellen in helderveld op dag 1, dag 4 en dag 7 om de groei van organoïden te evalueren.</li>
</ol>3. Levensvatbaarheid en proliferatie
<ol><li>Bereid drie black-well-platen voor voor de levensvatbaarheidstest en drie black-well-platen voor de proliferatietest. Voeg 25 μL 2x peptideoplossing per putje toe en gelaat met hetzelfde volume van 2x PBS. Zaai de cellen zoals hierboven beschreven.</li>
	<li>Bereid drie putjes voor voor elke formulering van peptidehydrogel die als blanco's in de proliferatieplaat moeten worden gebruikt. Zaai hier geen cellen op.</li>
	<li>Verwijder het medium van de plaat van de levensvatbaarheidsput en was met 1x PBS gedurende 3 x 5 min.</li>
	<li>Verdun Calceïne-AM en ethidiumhomodimeer tot 8 μM uit de levensvatbaarheids-/cytotoxiciteitskit voor zoogdiercellen (zie Materiaaltabel) in dezelfde tegen licht beschermde conische buis. Om 2 ml van deze oplossing te bereiden op 2 ml PBS in een tegen licht beschermde conische buis, voegt u 4 μl van de Calcein-AM-bouillonoplossing en 8 μl van de Ethidiumhomodimeer-1-bouillonoplossing toe.</li>
	<li>Voeg de in stap 3.4 bereide calceïne/ethidiumhomodimeeroplossing toe aan de plaat met 96 putjes. Voeg 100 μL per putje toe. Beschermen tegen licht en 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Was 3 x 5 min met 1x PBS. Afbeelding van minimaal drie velden (midden, boven, onder) bij gebruik van een 4x objectief of minimaal vijf velden (midden, linksboven, rechtsboven, linksonder, rechtsonder) bij gebruik van een 10x en 20x objectief onder een fluorescentiemicroscoop.</li>
	<li>Verwijder het medium van de plaat van de proliferatieput om een eindvolume van 90 μl te garanderen.</li>
	<li>Voeg 10 μL Alamar Blue-oplossing toe (zie Materiaaltabel) om een eindconcentratie van 10% te bereiken.</li>
	<li>Beschermen tegen licht en 2-4 uur incuberen bij 37 °C, 5% CO2</li>
	<li>Gebruik een putplaatlezer om fluorescentie (Ex/Em = 530-560/590 nm/nm) of absorptie (570 nm) te meten. Neem het gemiddelde van de waarden die zijn verkregen voor de lege plekken en trek ze af van de waarden van elk putje dat cellen bevat.</li>
	<li>Bereken proliferatiewaarden door het gemiddelde te nemen van het signaal van elke voorwaarde en het gemiddelde van hun respectievelijke lege plekken af te trekken. Maak grafieken door een geïndexeerde boxplot te genereren van het relatieve absorptie-/fluorescentiesignaal versus de tijd.</li>
</ol>4. Hechtingstest van cellen aan matrix
<ol><li>Bereid 100 μL peptidehydrogels in twee onafhankelijke platen met 96 putjes.</li>
	<li>Zaai 20.000 cellen in elk putje en voeg 100 μL medium toe. Incubeer de platen gedurende 90 minuten bij 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Neem na incubatie slechts één plaat en resuspendeer het medium voorzichtig met een P200-micropipet gedurende 20-30 s. Pas op dat u de hydrogel niet verstoort door de punt van de gel te houden. Als alternatief, als de mechanische eigenschappen van de hydrogel dit toelaten (G' > 8.000 Pa), tik dan op de vier zijden van de putplaat met behulp van een bewegende vortex. OPMERKING: Door de media opnieuw te suspenderen (of met de vortex op de putplaat te tikken) worden zowel niet-aangehechte cellen als cellen met een zwakke hechting aan het oppervlak van de matrix verwijderd. De cellulaire aanhechting vindt binnen 90 minuten plaats, hoewel de sterkte van deze aanhechting zal variëren afhankelijk van de specifieke peptidehydrogels en hun hechtende en bindende eigenschappen. Het is bekend dat colorectale organoïdegroei de voorkeur geniet in matrices met stijfheidswaarden van minder dan 2.000 Pa. Omdat de hydrogels die in dit protocol worden gepresenteerd zacht en broos zijn, maken we er een punt van om zachte mechanische belasting te gebruiken.</li>
	<li>Verwijder 100 μL medium van beide putplaten en voeg één keer wassen toe met 1x PBS.</li>
	<li>Bereid een DAPI-oplossing van 1 μg/ml. Voeg 100 μL van de DAPI-oplossing toe aan alle putjes en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Beeld een representatief aantal velden onder een fluorescentiemicroscoop. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen worden verkregen met hetzelfde objectief om de pixel/afstandsverhouding constant te houden. OPMERKING: Afbeelding negen velden voor een 10x objectief of 15 velden met een 20x objectief.</li>
	<li>Laad de fluorescentiebeelden op beeldanalysesoftware (bijv. ImageJ) en analyseer de deeltjes op alle afbeeldingen.<ol><li>Selecteer in het menu Afbeelding de optie Type en klik op 8-bits.</li>
		<li>Selecteer in het menu Afbeelding de optie Aanpassen en klik op Helderheid/Contrast. Klik op de Auto-knop | Toepassen.</li>
		<li>Selecteer in het menu Afbeelding de optie Aanpassen en klik op Drempelwaarde. Klik op de knop Auto en sluit het venster.</li>
		<li>Klik in het menu Analyseren op Deeltjes analyseren. Vink de optie aan om samen te vatten en klik op OK.</li>
		<li>Plaats in het venster Overzicht de muisaanwijzer op het menu Bestand en klik op Opslaan om de overzichtswaarden op te slaan.</li>
	</ol></li>
	<li>Exporteer de resultaten voor alle afbeeldingen naar standaard statistieksoftware.</li>
	<li>Bereken het percentage van het gebied dat voor en na stress door cellen wordt bedekt. Maak een geïndexeerde boxplot van het percentage van de oppervlakte tegen elke voorwaarde.</li>
</ol>5. Immunokleuring van organoïden in peptide hydrogel
<ol><li>Zaad 800 cellen in druppeltjes peptidehydrogel van 20 μl gedurende 4 dagen, zoals beschreven in stap 2.1-2.10.</li>
	<li>Verwijder op dag 4 het medium en was elk putje 2x met 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 400 μL van een 4% formaldehyde-oplossing toe. Incubeer de putplaat gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de formaldehyde-oplossing met een P1000 en was één keer met 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 1 ml permeabilisatiebuffer toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de permeabilisatiebuffer met een P1000 en was één keer met 1x PBS.</li>
	<li>Voeg 0,5 ml blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de blokkeerbuffer met een P1000 en was met 1x PBS.</li>
	<li>Verdun het primaire antilichaam in de blokkeerbuffer volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Voeg 200 μL toe aan twee putjes.</li>
	<li>Incubeer een nacht bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de kleuroplossing met een P200 en was één keer met 1x PBS.</li>
	<li>Verdun het secundaire antilichaam in de blokkeerbuffer, volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Voeg het falloidineconjugaat toe in een verhouding van 1:40 aan de secundaire antilichaamoplossing.</li>
	<li>Bescherm tegen licht en incubeer niet langer dan 3 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de kleuroplossing met een P200 en was één keer met 1x PBS.</li>
	<li>Bereid een DAPI-oplossing van 1 μg/ml in de blokkeerbuffer. Voeg 300 μL van de DAPI-oplossing toe aan elk putje.</li>
	<li>Bescherm tegen licht en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder de kleuroplossing met een P200 en was één keer met 1x PBS.</li>
	<li>Beschermen tegen licht en tot 7 dagen bewaren bij 4 °C.</li>
</ol>6. Beeldvorming en beeldanalyse van organoïden in matrix
<ol><li>Beeld de gekleurde monsters met een epifluorescentiemicroscoop op 10x. Gebruik alleen de falloidine- en DAPI-kanalen.</li>
	<li>Open de Cellopose software en druk op ctrl + L om een afbeelding te laden. Aangezien de software toegang heeft tot alle bestanden op de locatie van de geselecteerde afbeelding, moet u ervoor zorgen dat u alle fluorescentiebeelden op de exacte locatie opslaat zonder submappen te hebben.</li>
	<li>Typ de gemiddelde diameter van de kolonies in het deelvenster Segmentatie en klik op ENTER.</li>
	<li>Selecteer een aangepast model voor colonorganoïden en klik op de knop Model uitvoeren . OPMERKING: Hier raden we aan om twee vanaf nul modellen te gebruiken in Cellpose2.029,30</li>
	<li>Druk op ctrl + s om de maskers op te slaan als een .npy-bestand.</li>
	<li>Gebruik de pijlen op het toetsenbord om door de afbeeldingen van de map te bladeren en voer het model voor colonorganoïden uit op alle afbeeldingen in de map.</li>
	<li>Maak een kopie van de map en herhaal stap 6.2-6.6 met behulp van een model voor het lumen van de dikke darmorganoïde.</li>
	<li>Open ImageJ en klik op Plugin | Macro's | Rennen... om het imagej_roi_converter.py bestand dat beschikbaar is op de Cellpose Github-site uit te voeren en wacht tot er een venster verschijnt.</li>
	<li>Selecteer het eerste bestand uit de organoïdemap van de dikke darm en klik op Openen.</li>
	<li>Selecteer het bestand seg.npy dat overeenkomt met het eerste bestand en klik op Openen. OPMERKING: ImageJ zet de maskers om in interessante gebieden en overlapt ze met de bijbehorende fluorescentiebeelden.</li>
	<li>Klik op Alles selecteren in het venster ROI Manager en klik op Meten.</li>
	<li>Klik op Bestand | Opslaan als... in het venster Resultaten en sla de resultaten op. OPMERKING: Dit resulteert in een .csv bestand met alle vormeigenschappen van elke kolonie in het veld.</li>
	<li>Herhaal stap 6.8-6.12 voor dezelfde afbeelding in de map voor colon organoïde lumen.</li>
	<li>Laad OriginPro en druk op ctrl + 3 om de Import Wizard te openen. Klik op de knop met de drie puntjes en selecteer beide .csv bestanden die overeenkomen met organoïde- en lumenvormeigenschappen voor dezelfde afbeelding.</li>
	<li>Kopieer en plak de resultaten van de lumenvormeigenschappen in één kolom naast de resultaten van de kolonie om ervoor te zorgen dat elke lumenmeting wordt gekoppeld aan de respectieve kolonie.</li>
	<li>Verdeel in een nieuwe kolom de gebieden van het lumen en de kolonie om het relatieve lumengebied van de bevattende kolonie te verkrijgen.</li>
	<li>Selecteer de kolom die overeenkomt met de rondheid van elke kolonie en het lumengebied. Klik op Plot | Basis 2D | Verspreiden.</li>
	<li>Klik met de rechtermuisknop op het plotvenster en selecteer Plotdetails. Klik op het tabblad Zwaartepunt (PRO) en vink de opties aan: Zwaartepunt weergeven voor subset, Verbinden met gegevenspunten en Ellips weergeven.</li>
</ol>

Evaluatie van biofunctionele zelfassemblerende peptiden voor celadhesie en morfologie

<ol><li>Susapto, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide+bioinks+support+automated+printing+of+large-scale+constructs+assuring+long-term+survival+of+printed+tissue+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide bioinks support automated printing of large-scale constructs assuring long-term survival of printed tissue constructs.</a> Nano Letters. 21 (7), 2719-2729 (2021).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemically+well-defined%2C+self-assembling+3D+substrate+for+long-term+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">A chemically well-defined, self-assembling 3D substrate for long-term culture of human pluripotent stem cells.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (4), 1406-1412 (2019).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+proteins+and+peptides+as+scaffolds+for+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Self-assembled proteins and peptides as scaffolds for tissue regeneration.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (16), 2557-2586 (2015).</li>
<li>Loo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+bioink%3A+self-assembling+nanofibrous+scaffolds+for+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Peptide bioink: self-assembling nanofibrous scaffolds for three-dimensional organotypic cultures.</a> Nano Letters. 15 (10), 6919-6925 (2015).</li>
<li>Ho, B. X., Pek, N. M. Q., Soh, B. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+using+3D+organoids+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease modeling using 3D organoids derived from human induced pluripotent stem cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 936(2018).</li>
<li>Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+based+personalized+medicine%3A+from+bench+to+bedside%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Organoid based personalized medicine: from bench to bedside.</a> Cell Regeneration. 9 (1), 21(2020).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+extracellular+matrix+hydrogels+as+alternatives+to+Matrigel+for+culturing+gastrointestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tissue extracellular matrix hydrogels as alternatives to Matrigel for culturing gastrointestinal organoids.</a> Nature Communications. 13 (1), 1692(2022).</li>
<li>Kaushik, G., Ponnusamy, M. P., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+current+status+of+three-dimensional+organoids+as+preclinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: current status of three-dimensional organoids as preclinical models.</a> Stem Cells. 36 (9), 1329-1340 (2018).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Hauser, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+tri-+to+hexapeptides+self-assemble+in+water+to+amyloid+beta-type+fiber+aggregates+by+unexpected+alpha-helical+intermediate+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Natural tri- to hexapeptides self-assemble in water to amyloid beta-type fiber aggregates by unexpected alpha-helical intermediate structures.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1361-1366 (2011).</li>
<li>Lakshmanan, A., Zhang, S., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+self-assembling+peptides+as+building+blocks+for+modern+nanodevices%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Short self-assembling peptides as building blocks for modern nanodevices.</a> Trends in Biotechnology. 30 (3), 155-165 (2012).</li>
<li>Rauf, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+tetrameric+peptides+allow+in+situ+3D+bioprinting+under+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Self-assembling tetrameric peptides allow in situ 3D bioprinting under physiological conditions.</a> Journal of Materials Chemistry B. 9 (4), 1069-1081 (2021).</li>
<li>Bilalis, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dipeptide-based+photoreactive+instant+glue+for+environmental+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Dipeptide-based photoreactive instant glue for environmental and biomedical applications.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 15 (40), 46710-46720 (2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Moretti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectively+positioned+catechol+moiety+supports+ultrashort+self-assembling+peptide+hydrogel+adhesion+for+coral+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Selectively positioned catechol moiety supports ultrashort self-assembling peptide hydrogel adhesion for coral restoration.</a> Langmuir. 39 (49), 17903-17920 (2023).</li>
<li>Alhattab, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+three-dimensional+bone+marrow+niche-like+acute+myeloid+Leukemia+disease+model+by+an+automated+and+controlled+process+using+a+robotic+multicellular+bioprinting+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Research%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a three-dimensional bone marrow niche-like acute myeloid Leukemia disease model by an automated and controlled process using a robotic multicellular bioprinting system.</a> Biomaterials Research. 27 (1), 111(2023).</li>
<li>Abdelrahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+cues+on+the+metabolomic+and+transcriptomic+profiles+of+human+dermal+fibroblasts+cultured+in+ultrashort+self-assembling+peptide+3D+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical cues on the metabolomic and transcriptomic profiles of human dermal fibroblasts cultured in ultrashort self-assembling peptide 3D scaffolds.</a> ACS Nano. 17 (15), 14508-14531 (2023).</li>
<li>Habibi, N., Kamaly, N., Memić, A., Shafiee, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembled+peptide-based+nanostructures%3A+smart+nanomaterials+toward+targeted+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">Self-assembled peptide-based nanostructures: smart nanomaterials toward targeted drug delivery.</a> Nano Today. 11 (1), 41-60 (2016).</li>
<li>Yan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+osteogenesis+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+by+a+functionalized+silk+fibroin+hydrogel+for+bone+defect+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Enhanced osteogenesis of bone marrow-derived mesenchymal stem cells by a functionalized silk fibroin hydrogel for bone defect repair.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (3), 1801043(2018).</li>
<li>Kisiday, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+hydrogel+fosters+chondrocyte+extracellular+matrix+production+and+cell+division%3A+implications+for+cartilage+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide hydrogel fosters chondrocyte extracellular matrix production and cell division: implications for cartilage tissue repair.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (15), 9996-10001 (2002).</li>
<li>Hogrebe, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+control+of+matrix+adhesiveness+and+stiffness+within+a+3D+self-assembling+peptide+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Independent control of matrix adhesiveness and stiffness within a 3D self-assembling peptide hydrogel.</a> Acta Biomaterialia. 70, 110-119 (2018).</li>
<li>Wu, F. J., Lin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis%2C+self-assembly%2C+and+cell+responses+of+aromatic+IKVAV+peptide+amphiphiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis, self-assembly, and cell responses of aromatic IKVAV peptide amphiphiles.</a> Molecules. 27 (13), 4115(2022).</li>
<li>Cringoli, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioadhesive+supramolecular+hydrogel+from+unprotected%2C+short+d%2Cl-peptides+with+Phe-Phe+and+Leu-Asp-Val+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Bioadhesive supramolecular hydrogel from unprotected, short d,l-peptides with Phe-Phe and Leu-Asp-Val motifs.</a> Chemical Communications. 56 (20), 3015-3018 (2020).</li>
<li>Pulat, G. O., Gökmen, O., Çevik, Z. B. Y., Karaman, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+functionalized+self-assembled+peptide+hydrogels+in+in+vitro+vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Role of functionalized self-assembled peptide hydrogels in in vitro vasculogenesis.</a> Soft Matter. 17 (27), 6616-6626 (2021).</li>
<li>Pérez-Pedroza, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+lumen-forming+colorectal+cancer+organoids+using+a+newly+designed+laminin-derived+bioink%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Fabrication of lumen-forming colorectal cancer organoids using a newly designed laminin-derived bioink.</a> International Journal of Bioprinting. 9 (1), 633(2022).</li>
<li>Ashley, N., Yeung, T. M., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+differentiation+and+lumen+formation+in+colorectal+cancer+cell+lines+and+primary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem cell differentiation and lumen formation in colorectal cancer cell lines and primary tumors.</a> Cancer Research. 73 (18), 5798-5809 (2013).</li>
<li>Yeung, T. M., Gandhi, S. C., Wilding, J. L., Muschel, R., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+from+colorectal+cancer-derived+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells from colorectal cancer-derived cell lines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3722-3727 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Pachitariu, M., Stringer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose+2.0%3A+how+to+train+your+own+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose 2.0: how to train your own model.</a> Nature Methods. 19 (12), 1634-1641 (2022).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+a+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nature Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
<li>Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+and+cytotoxicity+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation and cytotoxicity assays.</a> Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).</li>
<li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate adhesion assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 9, Unit 9.1 (2001).</li>
<li>Munevar, S., Wang, Y. -l, Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+frontal+and+rear+cell-substrate+adhesions+in+fibroblast+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of frontal and rear cell-substrate adhesions in fibroblast migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 12 (12), 3947-3954 (2001).</li>
<li>Djomehri, S., Burman, B., González, M. E., Takayama, S., Kleer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+scaffold-free+3D+organoid+model+to+study+neoplastic+progression+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">A reproducible scaffold-free 3D organoid model to study neoplastic progression in breast cancer.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 13 (1), 129-143 (2018).</li>
<li>Puschhof, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoid+cocultures+with+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoid cocultures with microbes.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4633-4649 (2021).</li>
<li>Matthews, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OrganoID%3A+A+versatile+deep+learning+platform+for+tracking+and+analysis+of+single-organoid+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">OrganoID: A versatile deep learning platform for tracking and analysis of single-organoid dynamics.</a> PLOS Computational Biology. 18 (11), 1010584(2022).</li>
<li>Herpers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+patient-derived+organoid+screenings+identify+MCLA-158+as+a+therapeutic+EGFR+%C3%97+LGR5+bispecific+antibody+with+efficacy+in+epithelial+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cancer%22%5BJournal%5D)">Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR × LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors.</a> Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).</li>
<li>Borten, M. A., Bajikar, S. S., Sasaki, N., Clevers, H., Janes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+brightfield+morphometry+of+3D+organoid+populations+by+OrganoSeg%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automated brightfield morphometry of 3D organoid populations by OrganoSeg.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5319(2018).</li>
<li>Bergdorf, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+of+cancer+spheroids+and+fine-needle+aspiration-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining of cancer spheroids and fine-needle aspiration-derived organoids.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100578-100578 (2021).</li>
<li>Yang, Z., Xu, H., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+self-assembling+peptide+hydrogels+to+engineer+3D+cell+microenvironments+for+cell+constructs+formation+and+precise+oncology+remodeling+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">Designer self-assembling peptide hydrogels to engineer 3D cell microenvironments for cell constructs formation and precise oncology remodeling in ovarian cancer.</a> Advanced Science. 7 (9), 1903718(2020).</li>
<li>Yadav, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrashort+peptide-based+hydrogel+for+the+healing+of+critical+bone+defects+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrashort peptide-based hydrogel for the healing of critical bone defects in rabbits.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 14 (48), 54111-54126 (2022).</li>
<li>Alshehri, S., Susapto, H. H., Hauser, C. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffolds+from+self-assembling+tetrapeptides+support+3D+spreading%2C+osteogenic+differentiation%2C+and+angiogenesis+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Scaffolds from self-assembling tetrapeptides support 3D spreading, osteogenic differentiation, and angiogenesis of mesenchymal stem cells.</a> Biomacromolecules. 22 (5), 2094-2106 (2021).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Het enorme potentieel van SAP's in biomedisch onderzoek wordt onderstreept door hun kneedbaarheid en aanpassingsvermogen door biofunctionalisatie. Met zo'n uitgebreid scala aan permutaties ontstaat de uitdaging om efficiënt te testen en de meest veelbelovende configuraties te bepalen voor specifieke toepassingen, vooral in organoïdenonderzoek. Een snelle, kosteneffectieve oplossing is van het grootste belang. De SW1222-cellijn, afgeleid van humaan colorectaal adenocarcinoom, komt naar voren als een cruciale kandidaat voor een dergelijke intensieve evaluatie. Hier presenteerden we een methode voor de evaluatie en karakterisering van organoïden gekweekt in een op peptiden gebaseerde matrix. Dit protocol belooft een integratieve, kosteneffectieve strategie die zich richt op monitoring en analyse van organoïden met behulp van levensvatbaarheids- en proliferatiebeoordelingen, adhesietests, vormanalyse en immunocytochemie. De selectie van variërende peptideconcentraties in onze celcultuurexperimenten wordt ondersteund door een zorgvuldig overwogen grondgedachte die aansluit bij specifieke experimentele doelstellingen en aanzienlijk bijdraagt aan het bevorderen van ons begrip van organoïdecultuur binnen de context van peptidematrices. Ons onderzoekstraject is in de loop van de tijd geëvolueerd, waardoor een diverse aanpak nodig is om verschillende formuleringen te verkennen. Ten eerste werd het gebruik van een reeks peptideconcentraties, van 1,5 mg/ml tot 4,5 mg/ml, gemotiveerd door de wens om een spectrum van mogelijke uitkomsten te onderzoeken. Door lagere concentraties te gebruiken, wilden we de minimale peptideconcentratie beoordelen die nodig is om de groei en ontwikkeling van organoïden effectief te ondersteunen. Deze informatie is van vitaal belang voor het begrijpen van de haalbaarheid van kosteneffectieve toepassingen met minimale middelen. Omgekeerd werden hogere concentraties gekozen om de bovengrenzen van de peptideconcentratie en de mogelijke impact ervan op het gedrag van organoïden te onderzoeken, waarbij vragen over verzadigingseffecten en mogelijke nadelen van overmatige peptideconcentraties werden beantwoord.
Ten tweede hebben we onze keuzes geleid door specifieke experimentele doelen. Bij het onderzoeken van celadhesie werden bijvoorbeeld peptideconcentraties gebruikt om de breuk van de hydrogel onder stress te verminderen. Omgekeerd werden in onderzoeken die zich richtten op levensvatbaarheid op lange termijn en weefselrijping, lagere concentraties gebruikt om de laagst mogelijke reologische waarden te bereiken en toch een gel te leveren. Bovendien werden proliferatiewaarden gekozen om de verschillende profielen weer te geven die in de loop van de tijd op de organoïdecultuur zijn verkregen bij het gebruik van vergelijkbare formuleringen. Het belang van deze diverse aanpak ligt in het vermogen om een uitgebreide dataset op te leveren die een breed spectrum aan voorwaarden en resultaten omvat. Door de effecten van verschillende peptideconcentraties op organoïdecultuur te onderzoeken, kunnen we de genuanceerde wisselwerking tussen matrixeigenschappen en organoïdegedrag beter begrijpen.
De eerste evaluatie omvat het monitoren van de progressie van SW1222-cellen gedurende een week in een plaat met 24 putjes met behulp van helderveldbeeldvorming. De algemene analyse van de morfologie en de celdichtheid is een routinetechniek voor organoïde lijnen9 die op de cellijn wordt toegepast. Het niet-invasieve karakter van dit protocol zorgt voor ononderbroken observatie van de celcultuur, waardoor we cruciale gegevens over morfologische veranderingen en celdichtheid voor elke specifieke kolonie kunnen vastleggen. Deze eerste analyse kan waardevolle inzichten opleveren in de geschiktheid van de ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix. Deze waarnemingen leggen de basis voor verdere diepgaande analyses, die de geschiktheid van de peptidematrix aantonen als een effectieve steiger voor het ondersteunen van de ontwikkeling en groei van organoïden van colorectale kanker. Bovendien kunnen interessante waarnemingen voortkomen uit het monitoren van de groei en veranderingen in elke kolonie. In figuur 4 kunnen we bijvoorbeeld zien dat kolonies die in Matrigel groeien met elkaar kunnen botsen, maar het lijkt erop dat een grens consequent wordt gehandhaafd. Cellen die in peptiden worden gekweekt, reorganiseren het peptide echter op zo'n manier dat op dag 7 de cellocaties niet precies hetzelfde zijn als voorheen. Dit is iets om rekening mee te houden als dit protocol zou worden geëxporteerd naar een geautomatiseerd systeem dat de groei van de organoïden zou taggen en opvolgen.
Het daaropvolgende onderzoek omvat het beoordelen van de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen met behulp van een levensvatbaarheidstest op basis van calceïne en ethidiumhomodimeer. De levensvatbaarheidstest zal kwalitatieve informatie opleveren over de populatie van levende cellen in vergelijking met de dode cellen. De proliferatietest zal kwantitatieve informatie verschaffen over de metabolische toestand van de cellen om de celdeling te beoordelen31. Dit zijn standaardtests die veel worden gebruikt in celcultuur en geven een algemeen overzicht van de proliferatieve status van de cellen. Hoewel uitgebreid is aangetoond dat SAP-matrices biocompatibel zijn, is bekend dat organoïden een verminderde levensvatbaarheid vertonen als gevolg van suboptimale kweekomstandigheden, inclusief de matrix waarin ze zijn ingebed. Bovendien kunnen de mechanische eigenschappen van de peptidematrices de levensvatbaarheid van de cellen beïnvloeden. Als de matrix te stijf of stijf is, kan dit de cellen blootstellen aan mechanische spanning, wat mogelijk kan leiden tot celbeschadiging. Omgekeerd, als de matrix te zacht of onstabiel is, kan deze niet voldoende ondersteuning bieden voor celadhesie en overleving. Bovendien kunnen de bioactieve motieven of functionele groepen die in de peptiden aanwezig zijn, interageren met specifieke celreceptoren of signaalroutes, wat mogelijk kan leiden tot celdood. Daarom is het van cruciaal belang om de levensvatbaarheid en proliferatie van cellen continu te controleren.
In eerdere studies25 vertoonden Peptide 1 en Peptide 2 vergelijkbare niveaus van celdood in vergelijking met Matrigel (Figuur 5). Er werden echter fluctuaties waargenomen in de proliferatieprofielen van cellen in het moederpeptide met variërende concentraties. Met name de proliferatiesnelheid van dag 4 tot dag 7 bleef constant in plaats van toe te nemen, wat suggereert dat de cellen mogelijk een minder actieve fase ingaan. Bovendien bleven de veranderingen in de levensvatbaarheid van de cellen die tussen dag 4 en dag 7 werden waargenomen ook relatief consistent, wat wijst op een mogelijk plateau in groei en reproductie.
Om door te gaan met de evaluatie en karakterisering, gebruikten we een adhesietest die is aangepast voor 3D-cultuur, die afhankelijk is van mechanische stress om de effecten van celloslating te beoordelen32. De methode om mechanische belasting op te wekken moet worden gekozen op basis van de mechanische eigenschappen van de hydrogel. De effectiviteit van de methode is inherent verbonden met het gekozen modelsysteem, en de verkregen inzichten zijn afhankelijk van hoe goed het de biologische context weergeeft. Variabiliteit in hechting en organoïde eigenschappen kan het gevolg zijn van talrijke fysische en chemische interacties, die kunnen worden beïnvloed door factoren zoals de hydrogelsamenstelling en de hechteigenschappen van de nanovezels. Deze factoren hebben het potentieel om de generaliseerbaarheid van onze bevindingen te beïnvloeden33. Als de lezer dit protocol echter zou aanpassen voor stijvere of zeer ductiele hydrogels, overweeg dan om een robuustere stressmethode te gebruiken.
We gebruikten deze techniek om de algehele kleefkracht van het biofunctionele motief aan de SAP te beoordelen (Figuur 6). We zagen twee fenomenen. Ten eerste vertoonden de peptiden variërende initiële adhesieve eigenschappen. In het bijzonder bleken het IKVAV-motief en hydrogels die een hoge concentratie van het biofunctionele peptide bevatten, cellen over meer dan 40% van hun oppervlak te hechten. Ten tweede ondervonden sommige peptiden na de toepassing van geïnduceerde stress een aanzienlijk verlies van gehechte cellen. Met name de retentiecapaciteit was relatief hoog in peptiden die hoge concentraties van het niet-gebiofunctionaliseerde peptide bevatten. Het IKVAV-ligand en het SAP bieden dus verschillende soorten hechting van de cellen aan de matrix. Deze methode maakt het mogelijk om patronen te vinden en het hechtingsmechanisme van het materiaal op te helderen. Verdere technieken kunnen worden gebruikt, zoals het meten van de kleefkracht met behulp van atoomkrachtmicroscopie, die kan worden gebruikt om de kleefkrachten tussen een sondepunt en een monsteroppervlak op nanoschaalniveau te onderzoeken, wat waardevolle informatie oplevert over de hechtingseigenschappen van materialen en biologische monsters.
Het vermogen van verschillende peptidematerialen om organoïdevorming te induceren werd geëvalueerd door middel van de circulariteit van de kolonie en het relatieve lumengebied van de organoïden die in dergelijke peptidehydrogels werden gekweekt. Circulariteit verwijst naar de ronding of vorm van een object. In de context van organoïden kan circulariteit worden gebruikt om de morfologie en symmetrie van de structuur te beoordelen. Verschillende studies hebben de cirkelvormige morfologieën van organoïden genoemd. Organoïden van borstkanker hebben bijvoorbeeld de neiging om strikte cirkelvormige morfologieën te hebben met koordachtige basolateraleperiferieën34. Dit suggereert dat circulariteit kan worden gebruikt als een parameter om de vorm van organoïden te evalueren. Lumengrootte verwijst naar de centrale holte of ruimte in een organoïde. Het is een essentieel kenmerk omdat het de differentiatie en rijping van de organoïde weerspiegelt. Tijdens het differentiatieproces ondergaan organoïden een afname van de lumengrootte en een toename van de dikte van de epitheellaag35. Dit geeft aan dat de lumengrootte kan worden gebruikt als een indicator van het ontwikkelingsstadium van de organoïde. Het beoordelen van circulariteit en lumengrootte kan waardevolle informatie opleveren over de structurele en functionele kenmerken van organoïden. Cirkelvormige organoïden met goed gedefinieerde lumen zijn meer representatief voor de natuurlijke weefselarchitectuur en kunnen de orgaanfunctie beter nabootsen36.
Deze eigenschappen kunnen worden geëvalueerd door fluorescentiebeelden van het cytoskelet en de kernen te verkrijgen van de eerder gekleurde monsters. De afbeeldingen werden gesegmenteerd met behulp van Cellpose en vormmetingen van de resulterende maskers werden verkregen met behulp van ImageJ. Vormanalyse van met cytoskelet gekleurde monsters na 4 dagen cultuur onthulde verder organoïde kenmerken. Vergelijkbare methoden, voornamelijk gericht op helderveldbeeldvorming, zijn gebruikt om de reacties van de organoïden op hun omgeving te bepalen op basis van vormanalyse en bepaling van kenmerken van de organoïde door beeldanalyse 36,37,38. Ten slotte gebruikten we immunocytochemie om de celpolariteit met verschillende polariteitsmarkers te evalueren. Met name het gebruik van een peptide-hydrogel zal de behandeling van het monster verminderen, omdat hiervoor geen matrix hoeft te worden verwijderd en de organoïden niet hoeven te worden opgehaald39.
Het belang van deze methode berust op de veelzijdigheid van biofunctionele SAP-hydrogels in vergelijking met andere dierlijke matrices om methoden te ontwikkelen die de vertaling van peptidehydrogels naar matrices voor organoïdecultuur mogelijk maken. Een vergelijking van de ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix met traditionele matrices zoals Matrigel of collageen onthult tal van voordelen. Ten eerste biedt de peptidematrix een superieure reproduceerbaarheid, aangezien de peptidesequentie nauwkeurig kan worden gecontroleerd en gesynthetiseerd, waardoor consistente eigenschappen en prestaties in verschillende batches worden gegarandeerd40. Bovendien vertoont het een hoge stabiliteit in termen van mechanische eigenschappen en weerstand tegen degradatie, waardoor de structurele integriteit gedurende langere perioden behouden blijft en een stabiele micro-omgeving biedt voor de groei van organoïden41. Bovendien maakt de ultrakorte peptidematrix een nauwkeurige controle en fijnafstemming van de micro-omgeving mogelijk. De peptidesequentie kan worden gewijzigd om specifieke bioactieve motieven of functionele groepen op te nemen, die de gewenste signalen voor celdifferentiatie presenteren42.
Samenvattend ligt het belang van de methode in het potentieel om het rationele ontwerp van op peptiden gebaseerde hydrogels voor het bevorderen van organoïdecultuur te informeren. Door het gedrag van cellen systematisch te evalueren, vergemakkelijkt dit protocol de identificatie van veelbelovende peptidesamenstellingen voor het optimaliseren van de groei van organoïden. Dergelijke inzichten staan op het punt zich uit te breiden naar bredere onderzoeksgebieden en bij te dragen aan de vooruitgang van op organoïden gebaseerde studies en benaderingen van regeneratieve geneeskunde.

In de afgelopen jaren zijn zelfassemblerende peptiden (SAP's) naar voren gekomen als veelbelovende biomaterialen voor weefselmanipulatietoepassingen. SAP's bezitten unieke eigenschappen, waaronder spontane vorming van nanovezels, biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en niet-immunogeniciteit, waardoor ze aantrekkelijke kandidaten zijn voor de ontwikkeling vansteigers1. SAP's zijn eerder gebruikt in combinatie met verschillende soorten cellen, en met name gerapporteerde ultrakorte SAP's hebben de inkapseling van stamcellen vergemakkelijkt terwijl ze hun pluripotentie gedurende langere perioden van meer dan 30 passages omvatten en met een minimale incidentie van chromosomale afwijkingen 2,3,4. Het aanpassen van SAP's voor hun gebruik in organoïdecultuur vormde dus een rationele volgende stap.
Organoïden zijn complexe driedimensionale structuren die ontstaan uit enkele pluripotente cellen. Deze structuren geven aanleiding tot verschillende celtypen, die zichzelf vervolgens organiseren om de ontwikkelingsprocessen van embryonale en weefselgroei in vitro te repliceren 5. Dit innovatieve raamwerk is uitgegroeid tot een formidabel hulpmiddel voor in-vitro-onderzoeken, waarbij de genetische, fenotypische en gedragskenmerken die kenmerkend zijn voor in vivo organen efficiënt wordenbehouden. Desalniettemin is een belangrijk obstakel bij de overgang van tafel naar bed van op organoïden gebaseerde bevindingen de noodzaak van reproduceerbaarheid7. Deze variatie in resultaten wordt voornamelijk toegeschreven aan de moeilijkheid om menselijke pluripotente stamcellen volledig te differentiëren in gespecialiseerde cellijnen, verergerd door de afwezigheid van authentieke weefselarchitectuur en de inherente complexiteit die wordt aangetroffen in organoïde modellen. Gezien de toenemende populariteit van op stamcellen en organoïden gebaseerde studies8, is er een geëscaleerde vraag naar biomaterialen met dynamische mechanische eigenschappen en integrine-achtige hechtingsplaatsen of steigers met gecontroleerde afbreekbaarheid 7,9. Deze kenmerken kunnen effectief worden afgestemd door het strategische gebruik van biofunctionele SAP's.
SAP's zijn korte sequenties van aminozuren met het inherente vermogen om zich spontaan te organiseren tot goed gedefinieerde structuren10. Deze peptiden bevatten vaak afwisselend hydrofobe en hydrofiele residuen, die hun zelfassemblage aansturen door middel van niet-covalente interacties, waaronder waterstofbruggen, elektrostatische interacties en hydrofobe effecten11,12. Het zelfassemblageproces van deze peptiden wordt voornamelijk gedreven door de noodzaak om de vrije energie van het systeem te minimaliseren. In een waterige omgeving hebben de hydrofobe residuen de neiging om samen te clusteren om hun blootstelling aan water te minimaliseren, terwijl de hydrofiele residuen interageren met de omringende watermoleculen. Dit fenomeen leidt tot de vorming van verschillende nanostructuren. In dit geval vormen ultrakorte zelfassemblerende peptiden nanovezels met kenmerken die afhankelijk zijn van de peptidesequentie en omgevingsomstandigheden 2,12,13,14,15,16. Deze peptiden nemen een β-turn conformatie aan, waarbij individuele peptidestrengen parallel of antiparallel aan elkaar worden uitgelijnd, gestabiliseerd door waterstofbruggen (Figuur 1). De aanwezigheid van positieve ionen versnelt de zelfassemblageprocessen die leiden tot de vorming van nanovezels.
Van peptide-nanovezels is vastgesteld dat ze een aangeboren vermogen hebben om aanzienlijke hoeveelheden water vast te houden. Deze eigenschap vergemakkelijkt de aanmaak van een hydrogel, die zich vervolgens manifesteert als een biocompatibele en biologisch afbreekbare driedimensionale ruimte die bevorderlijk is voor cellulaire proliferatie en groei. Deze zelfassemblerende peptide-nanovezels bootsen op ingewikkelde wijze de topografische kenmerken na die inherent zijn aan de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) -omgeving1. Deze gelijkenis geeft cellen een omgeving die hun fysiologische habitat imiteert, waardoor optimale cellulaire activiteiten verder worden bevorderd17. Bovendien maakt de veelzijdigheid die inherent is aan deze peptiden een aanzienlijke mate van afstembaarheid mogelijk4. Een dergelijk aanpassingsvermogen maakt veranderingen mogelijk in de eigenschappen van de matrix, zoals stijfheid, geleringskinetiek en porositeit. Deze aanpassingen worden bereikt door modificaties in de peptidesequentie. Bijgevolg zijn zelfassemblerende peptiden (SAP's) naar voren gekomen als cruciale componenten in de hedendaagse biomateriaalwetenschap, die op grote schaal worden gebruikt als steigers voor weefselregeneratie en cellulaire cultuur13,17.
Een van de cruciale voordelen van zelfassemblerende peptiden is hun vermogen om gemakkelijk op moleculair niveau te worden gesynthetiseerd en gemodificeerd. Dit voordeel maakt het mogelijk om specifieke functionele groepen of bioactieve motieven in de peptidesequentie op te nemen, waardoor peptiden met op maat gemaakte eigenschappen en functionaliteiten kunnen worden ontworpen 18,19,20 (Figuur 1B). Biofunctionaliseerde SAP's kunnen bijvoorbeeld worden ontworpen om de ECM na te bootsen en differentiatie te bevorderen met behulp van het RGD-peptide19,21. Van peptide Ben-IKVAV is ook gemeld dat het de expressie van neuronale-specifieke markers aanzienlijk verhoogt vanwege de ligandspecifieke motiety22. Deze peptiden kunnen ook worden gemanipuleerd om bioactieve moleculen weer te geven, zoals integrine-bindende peptiden, om de overleving van cellen te verbeteren23. Ten slotte zijn andere biofunctionaliseerde SAP's ontwikkeld om angiogenese te bevorderen door de IKVAV- en YIGSR-motieven in hun structuren op te nemen24.
Biofunctionaliseerde SAP's die in een eerdere publicatie zijn gerapporteerd, laten zien dat zelfassemblage verder kan worden gemodificeerd door het naïeve peptide op te nemen waaruit de gebiofunctionaliseerde SAP is afgeleid25. Deze SAP-mengsels kunnen ook een breed scala aan SAP-formuleringen leveren die variëren in hun biochemische activiteit en fysisch-chemische eigenschappen. Het amfifiele peptide IIFK is bijvoorbeeld een ultrakorte SAP die bestand is tegen biofunctionalisatie met verschillende motieven, geïllustreerd door de integratie van het IKVAV-motief (Figuur 1B). Beide peptiden kunnen nanovezels vormen, zowel alleen als gecombineerd. Elke formulering resulteert in hydrogels met verschillende fysische eigenschappen (Figuur 2)
Vanwege het uitgebreide scala aan mogelijke permutaties en alternatieven die worden verkregen uit de biofunctionalisering van SAP's, is er echter behoefte aan een snelle en kosteneffectieve optie voor het testen van organoïden. Een kandidaat voor zo'n intensieve en kosteneffectieve organoïde-evaluatie is de SW1222-cellijn, afgeleid van humaan colorectaal adenocarcinoom26,27. SW1222-cellen bezitten kenmerken die hun aggregatie tot 3D-structuren die lijken op organoïden mogelijk maken, waardoor ze een ideaal model zijn voor het bestuderen van weefselontwikkeling en toepassingen in regeneratieve geneeskunde. Van SW1222-cellen is vastgesteld dat ze in staat zijn organoïden te genereren vanwege hun intrinsieke overexpressie van het LGR5-gen 27. De creatie van organoïden uit individuele LGR5+-stamcellen is al eerder overtuigend aangetoond, evenals de neiging van SW1222-cellen om morfologische kenmerken van een organoïde van colorectale kanker te bereiken28.
In dit methodedocument presenteren we gedetailleerde protocollen voor het evalueren en karakteriseren van de effecten van verschillende biofunctionele peptiden op celadhesie en lumenvorming met behulp van SW1222-cellen (Figuur 3). Door stapsgewijze procedures en beeldvormende analysemethoden aan te bieden, hopen we waardevolle inzichten te bieden in de biofabricage van organoïden en de evaluatie van simplistische SAP-matrices voor organoïdencultuur.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate, tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>07-200-83</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td><td>Thermo Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate, tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>09-761-146</td><td></td></tr><tr><td>96-well black plate, tissue culture treated</td><td>Corning</td><td>07-200-565</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue Cell Viability Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>DAL1025</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal</td><td>Abcam</td><td>ab40839</td><td>Secondary used: anti-rabbit Dylight 633</td></tr><tr><td>Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab16505</td><td>Secondary used: anti-rabbit Alexa 488</td></tr><tr><td>Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal</td><td>Abcam</td><td>ab190085</td><td>Secondary used: anti-goat Alexa 488</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Cellpose 2.0</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose</td></tr><tr><td>Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan</td><td>ZEISS</td><td>LSM 880</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Cytiva</td><td>GE17-1323-01</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633</td><td>Invitrogen</td><td>35562</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 1.54f</td><td>NIH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix.</td></tr><tr><td>Microscope, brightfield</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope, EVOS</td><td>Thermo Scientific</td><td>EVOS M7000</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154</td><td>OriginLab Corp</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2)</td><td>Lab-made</td><td>NA</td><td>Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.</td></tr><tr><td>Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2)</td><td>Lab-made</td><td>NA</td><td>Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.</td></tr><tr><td>Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2)</td><td>Lab-made</td><td>NA</td><td>Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem.</td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>Round Cover Slip, 10 mm diameter</td><td>VWR</td><td>631-0170</td><td></td></tr><tr><td>Scanning Electron Microscope</td><td>Thermo Fisher - FEI</td><td>TENEO VS</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 30 &mu;m strainer</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1888</td><td></td></tr><tr><td>SW1222 cell line</td><td>ECACC</td><td>12022910</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>Thermo Scientific</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure water</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr></tbody></table>

fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de sw1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Fabrication and Characterization of Colorectal Cancer Organoids from SW1222 Cell Line in Ultrashort Self&#45;Assembling Peptide Matrix

Ultrakorte zelfassemblerende peptiden (SAP's) kunnen spontaan nanovezels vormen die lijken op de extracellulaire matrix. Deze vezels maken de vorming van hydrogels mogelijk die biocompatibel, biologisch afbreekbaar en niet-immunogeen zijn. We hebben eerder bewezen dat SAP's, wanneer ze worden gebiofunctionaliseerd met van eiwitten afgeleide motieven, de extracellulaire matrixkenmerken kunnen nabootsen die de vorming van colorectale organoïden ondersteunen. Deze biofunctionele peptidehydrogels behouden de mechanische eigenschappen, afstembaarheid en printbaarheid van het oorspronkelijke ouderpeptide, terwijl ze aanwijzingen bevatten die cel-matrixinteracties mogelijk maken om de celadhesie te vergroten. Dit artikel presenteert de protocollen die nodig zijn om de effecten van verschillende biofunctionele peptidehydrogels op celadhesie en lumenvorming te evalueren en te karakteriseren met behulp van een adenocarcinoomkankercellijn die in staat is om op kosteneffectieve wijze organoïden van colorectale kanker te vormen. Deze protocollen zullen helpen bij het evalueren van biofunctionele peptide-hydrogeleffecten op celadhesie en luminale vorming met behulp van immunokleuring en fluorescentiebeeldanalyse. De cellijn die in deze studie is gebruikt, is eerder gebruikt voor het genereren van organoïden in van dieren afkomstige matrices.

Eerst evalueerden we de cellen die gedurende 7 dagen in een plaat met 24 putjes werden gekweekt met behulp van helderveldbeeldvorming. We identificeerden kleine clusters van cellen die zich in de loop van de week tot organoïden verzamelden, zoals te zien is in figuur 4. Een gecontroleerde scanmethode kan de beweeglijkheid van de cellen en de organoïden tussen verschillende dagen volgen. Over het algemeen keken we naar de evolutie van de morfologie van de cellen gedurende de hele week. Van SW1222 afgeleide organoïden moeten een ronde morfologie en een licht uiterlijk hebben. Een donkerder uiterlijk duidt op een ongewenste hogere celdichtheid, zoals te zien is in sommige van de kolonies die zijn gekweekt in Peptide P, dag 7 (Figuur 4).
Figuur 5 toont de resultaten van de levensvatbaarheids- (figuur 5A) en proliferatietests (figuur 5B), die respectievelijk wijzen op de hoeveelheid dode en levende cellen en de metabolische activiteit. Hier gebruikten we een op calceïne en ethidiumhomodimeer gebaseerde levensvatbaarheidstest en merkten op dat deze cellen op dag 7 een kleine populatie dode cellen vertoonden wanneer ze in Matrigel werden gekweekt. Dit fenomeen was ook aanwezig in alle hydrogels op basis van peptiden, maar niet in de 2D-cultuur. Proliferatieresultaten toonden een totale toename van de metabolische activiteit tussen dag 1 en dag 7. Bovendien vonden we een lichte afname van de activiteit tussen dag 4 en dag 7 voor verschillende aandoeningen. Deze waarneming correleert met de toename van de dode celpopulatie die wordt waargenomen in de levensvatbaarheidstest (Figuur 5A).
Voor een voorlopige evaluatie van de interactie tussen de cellen en de biofunctionalisatie van de peptidehydrogels, voerden we een adhesietest uit op basis van mechanische stress om celloslating te induceren. Zoals te zien is in figuur 6, had het gebruik van verschillende concentraties van het biofunctionele peptide P2 een significante invloed op het aantal cellen dat voor en na het loslatingsproces werd vastgehouden. Hier gebruikten we een peptide die alleen het biofunctionele motief van peptide P2 bevat als positieve controle. We gebruikten ook het niet-biofunctionele peptide P als negatieve controle. Zoals in de grafiek te zien is, hadden cellen gezaaid in peptide P een relatief lage initiële adhesie en een lage retentiewaarde. Bovendien was de verandering in de verhouding van het biofunctionele peptide P2 gecorreleerd met de hoeveelheid cellen die na de stress overbleven. Daarom kunnen we met behulp van deze test concluderen dat het P2-peptide de celadhesie beïnvloedde die al dan niet werd aangedreven door het biofunctionele motief, maar gecorreleerd was met de hoeveelheid biofunctioneel peptide die in het mengsel aanwezig was.
Vervolgens onderzochten we het effect van de matrices in de gefabriceerde organoïden. We evalueerden de cirkelvormigheid van de kolonie en de relatieve grootte van het lumen ten opzichte van de grootte van de kolonie door vormanalyse uit te voeren van met cytoskelet gekleurde monsters die gedurende 4 dagen waren gekweekt. De datapunten hadden een bepaalde verdeling langs de x- en y-as, en elke voorwaarde had een zwaartepunt met een bepaalde waarde voor circulariteit en relatief lumengebied. Figuur 7 laat zien dat de in 2D gekweekte cellen een zeer hoge variatie hadden in de circulariteit van de kolonie. Daarentegen hadden de in Matrigel gekweekte cellen een uitgebreidere verdeling voor de relatieve grootte van het lumen.
Interessant is dat de zwaartepuntwaarden voor alle peptide-bevattende hydrogels een zeer vergelijkbare positie hadden. De afstand tussen de datapunten vertoonde echter verschillende verdelingsprofielen. Het P3-peptide had bijvoorbeeld een kleinere verdeling over de drie peptide-hydrogels, terwijl de datapunten van het niet-biofunctionele peptide P een grotere verdeling leken te hebben. Deze gegevens suggereren dat zowel hydrogels met P1 als P3 het potentieel hebben om te worden geoptimaliseerd voor organoïdecultuur.
Ten slotte evalueerden we de expressie van specifieke markers met behulp van immunocytochemie op een monster gekleurd voor de apicale markers ZO-1 en ezrin. Deze markers maakten de evaluatie van de polarisatie van de cellen binnen elke organoïde mogelijk. We evalueerden ook pan-cadherine-markers om cel-celjuncties te visualiseren en een cytoskelet-specifieke marker (phalloidine) om het lumen te visualiseren. Figuur 8A toont de organoïden die worden aangetroffen in niet-biofunctioneel peptide P, gebiofunctionaliseerd peptide P1 en Matrigel op dag 4 en dag 7. ZO-1- en ezrin-markers moeten worden gelokaliseerd in de apicale en basolaterale membranen van de organoïde; Een goede celpolarisatie stelt ons in staat om de expressie van beide moleculen op dag 4 in de buurt van het lumengebied te observeren, anders onzichtbaar. Zoals te zien is in figuur 8, bevonden ZO-1- en ezrin-markers zich inderdaad in de apicale membranen van de organoïden die in Matrigel waren gekweekt. Interessant is dat ezrin-markers nauwelijks zichtbaar waren in het niet-biofunctionele peptide P. Hieruit leiden we af dat de inefficiënte polarisatie van de cellen resulteerde in een lage expressie van deze moleculen in peptide P.
Bovendien was de dispersie van de kernen meestal onregelmatig in de peptidehydrogels, terwijl de organoïden ingebed in Matrigel een enkele, asymmetrische laag kernen vormden. Deze beschrijving komt overeen met de ideale morfologie voor een colorectale organoïde; hoewel de oriëntatie van de kernen niet volledig asymmetrisch was in de peptide-hydrogels, werden dichtere kolonies met meerdere lagen kernen voornamelijk gevonden in het niet-biofunctionele peptide P. Daarentegen moeten cel-celjuncties loodrecht op de apicale en basolaterale membranen worden gelokaliseerd (Figuur 8B). Met deze marker konden we de randen van alle cellen in de kolonie observeren. Wanneer gekweekt in Matrigel, hadden cellen op dag 7 een bijna perfecte radiale verdeling van pan-cadherine (cel-celovergangen). Daarentegen vertoonden niet-gepolariseerde kolonies, zoals die in peptide P, een ongeordende rangschikking van cellen en expressie van cel-celverbindingen in de buurt van het basale en apicale membraan.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig01.jpg"> Figuur 1: Ultrakorte zelfassemblerende peptiden die nanovezels vormen. (A) Weergave van het zelfassemblerende proces voor alifatische ultrakorte peptiden. (B) Chemische structuur van ultrakort SAP IIFK gebiofunctionaliseerd met het IKVAV-ligand. Dit cijfer is aangepast van Loo et al.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig02.jpg"> Figuur 2: Structuur en eigenschappen van peptiden. (A) De chemische structuren van het moederpeptide IIFK en het biofunctionele peptide P2 worden geïllustreerd. (B) De testresultaten van de omgekeerde injectieflacon laten kritische verschillen in geleringsconcentratie en geleringstijd zien. P2 vormt een doorschijnende gel met een hogere CGC dan het moederpeptide IIFK. Met name het IIFK:P2 (1:1) mengsel vertoont een nog hogere CGC en een langere geleringstijd dan elk peptide afzonderlijk. (C) Scanning-elektronenmicrofoto's geven visueel inzicht in de structurele kenmerken van IIFK, P2 en het IIFK:P2 (1:1) mengsel. (D) De topografische beelden van de hoogte van de atoomkrachtmicroscopie tonen de geleerde peptiden met een concentratie van 8 mM, en bieden een gedetailleerd beeld van hun oppervlaktekenmerken. (E) Circulaire dichroïsmespectroscopie onthult de conformationele veranderingen van het IIFK:P2-mengsel bij verschillende concentraties, wat licht werpt op hun secundaire structuurveranderingen. (F) Reologische analyses meten de stijfheid van de geleerde peptiden bij verschillende concentraties, wat waardevolle inzichten oplevert in hun mechanische eigenschappen. Dit cijfer is overgenomen van Perez-Pedroza et al.25. Schaalbalken = 1 μm (C), 200 nm (D). Afkorting: CGC = kritische geleerconcentratie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig03.jpg"> Figuur 3: Diagram met peptidebereiding en celzaaiing voor de fabricage en karakterisering van organoïden op basis van levensvatbaarheid, hechting, organoïdevormend vermogen en immunokleuring in peptidehydrogels. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig04.jpg"> Figuur 4: Helderveldmicroscopiebeelden vastgelegd van SW1222-cellen gekweekt in peptidehydrogels gelabeld als P en P1 in vergelijking met Matrigel-controle. Interessant is dat organoïden die in de peptidehydrogels worden gekweekt, op de zevende dag een overwegend bolvormige morfologie vertonen. Daarentegen lijken degenen die zich in de Matrigel bevinden een verlaagde celdichtheid te vertonen, wat te zien is aan hun heldere lichaam, vergeleken met het donkere lichaam van de organoïdencultuur in SAP (zwarte pijlpunten). Niettemin vertonen ze een schijnbare clustering tussen aangrenzende kolonies. Bovendien wordt het duidelijk dat de migratiecapaciteit van cellen binnen de Matrigel-omgeving relatief verminderd is. Schaalbalken = 650 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig05.jpg"> Figuur 5: Levensvatbaarheids- en proliferatietesten van SW1222-cellen in gebiofunctionaliseerd SAP in verschillende concentraties. (A) Levensvatbaarheidsbeoordeling van cellen gekweekt in biofunctioneel peptide P1 en P2, vergeleken met Matrigel en 2D. (B) Proliferatiebeoordeling van celcultuur in niet-biofunctioneel peptide P1 en biofunctioneel peptide P2, vergeleken met Matrigel en 2D-controles. Hier zien we een gedrag dat vergelijkbaar is met dat van de cellen die in Matrigel groeien voor de levend/dood-test. Een lichte toename van dode cellen (gele pijlpunten) wordt gevonden bij verschillende aandoeningen, voornamelijk Matrigel. Voor proliferatie variëren de trends afhankelijk van het type en de concentratie van het peptide, maar over het algemeen is er een positieve trend. Schaal balken = 250 μm. Dit cijfer is een bewerking van Perez-Pedroza et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig06.jpg"> Figuur 6: Effecten van het peptide op het aantal losgemaakte cellen. (A) Fluorescentiebeelden van cellen gekleurd met DAPI voor en na mechanische spanning. Hier gebruiken we peptide P, gemodificeerd peptide P2 en het IKVAV-motief. (B) Verandering in celadhesie werd bepaald door het bedekte gebied in ImageJ te meten. Uit de vergelijkende analyse bleek dat het gebiofunctionaliseerde peptide P2 een verhoogde retentiecapaciteit had in vergelijking met het niet-biofunctionele peptide P. Schaalbalken = 100 μm. Dit cijfer is een bewerking van Perez-Pedroza, et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig07.jpg"> Figuur 7: Evaluatie van het organoïdevormend vermogen door centroïde berekening van de relatieve oppervlakte van het lumen versus circulariteit. Het zwaartepunt en de spreiding van de gegevens varieerden tussen de behandelingen. Zoals verwacht was de slechtst presterende toestand die van de 2D-metingen, die zich uitbreidden in een uitgebreid bereik van circulariteitswaarden en het laagste relatieve oppervlak van het lumen hadden. Matrigel had niet alleen de hoogste circulariteit, maar ook de grootste lumen. De peptidecondities varieerden enigszins in beide waarden, maar de P3-conditie bevatte de meest verwaarloosbare variatie van de gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66060/66060fig08.jpg"> Figuur 8: Confocale microscopiebeelden van organoïden op dag 4 en dag 7 voor verschillende markers. (A) ZO-1 (groen), ezrin (rood) en DAPI (blauw) markers worden gebruikt om de apicale verdeling van de cellen in de organoïden te vinden. Zoals te zien is in de Matrigel-controle, zijn deze moleculen meestal gelokaliseerd in de apicale en basolaterale membranen. Niet-biofunctioneel peptide P vertoont de expressie van deze moleculen pas op dag 7. (B) Cel-cel junctiemarkers gekleurd met pan-cadherine (groene) antilichamen moeten loodrecht staan op de basolaterale en apicale membranen van de organoïden. Celkernen (blauw) en cytoskelet (rood) worden gebruikt als tegenkleuring. Het niet-biofunctionele peptide P induceerde de expressie van de cel-celovergang in het basolaterale membraan, in tegenstelling tot de andere twee behandelingen (P3 en Matrigel). Schaalbalken = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66060/66060fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol heeft tot doel biofunctionele zelfassemblerende peptiden te evalueren voor celadhesie, organoïde morfologie en genexpressie door immunokleuring. We zullen een colorectale kankercellijn gebruiken om een kosteneffectieve manier te bieden om organoïden te verkrijgen voor intensieve tests.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Ultrashort self-assembling peptides (SAPs) can spontaneously form nanofibers that resemble the extracellular matrix. These fibers allow the formation of ...

Ons onderzoek is gericht op het evalueren van ultrakorte zelfassemblerende peptiden als matrices voor organoïde culturen van colorectale kanker. We behandelen vragen over organoïde morfologie, voor levensvatbaarheid, proliferatie en de hechting en de impact van biofunctionalisatie. Het doel is om de samenstelling van peptidematrixen te optimaliseren voor effectieve groei van organoïden en bij te dragen aan regeneratieve geneeskunde.Geavanceerde technologieën in ons vakgebied omvatten 3D-bioprinten voor nauwkeurige organische fabricage, microfluïdische platforms voor dynamische kweekomgevingen en geavanceerde beeldvormingstools zoals atoomkrachtmicroscopie en multifotonenmicroscopie. CRISPR-Cas9-genbewerking verfijnt genetische modificatie, terwijl single cell RNA-sequencing diepgaande moleculaire inzichten biedt. De huidige experimentele uitdagingen zijn onder meer het verbeteren van de reproduceerbaarheid van organoïden, het verfijnen van vascularisatie voor grotere constructies en het nabootsen van complexe weefselarchitectuur.Het overwinnen van deze beperkingen in langdurige kweek en het opnemen van immuuncomponenten in modellen zijn actieve gebieden. Het bereiken van gestandaardiseerde protocollen en het aanpakken van ethische bezwaren tegen de voortdurende uitdagingen op dit gebied. Belangrijke bevindingen in ons vakgebied zijn onder meer het aantonen van de geschiktheid van ultrakorte zelfassemblerende peptiden voor organoïde culturen.We hebben de veelzijdigheid, reproduceerbaarheid en stabiliteit van deze peptiden aangetoond en een platform geboden voor het verfijnen van micro-omgevingen. Dit draagt bij aan het bevorderen van op organoïden gebaseerde studies, regeneratieve geneeskunde en biofunctioneel hydrogelonderzoek. Ons protocol overbrugt een onderzoekskloof, waarbij een systematische benadering wordt geboden voor het evalueren van organoïden in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrices.Het richt zich op de behoefte aan gestandaardiseerde methoden voor het beoordelen van celgedrag binnen deze matrices, wat helpt bij het ontwerp van op peptiden gebaseerde hydrogels voor optimale groei van organoïden en het bevorderen van studies naar regeneratieve geneeskunde.

fabrication-characterization-colorectal-cancer-organoids-from-sw1222

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

This video describes the detailed protocol for generating 3D organoids from murine-model derived colorectal cancer cells by propagating them on artificial extracellular matrix coated plates. These CRC organoids can be used as a model to study the primary growth of human tumor cells and metastasis.

CRC Organoid Culture: A Method to Obtain 3D Organoids from Colorectal Cancer Cells

This video describes the technique of generating CRC organoids transduced by GFP lentiviral particles for enabling fluorescent imaging. These GFP labeled organoids, when placed in animal models, help to study tumor invasion and metastasis.

CRC Organoid Cell Labeling: A Method to Generate GFP Lentivirus-transduced Colorectal Cancer Organoid Cells

This video describes the protocol to establish a spontaneous metastasis mouse model of colorectal cancer patient-derived xenografts or PDXs. These xenograft models partially mimic the features of human carcinomas and understand the critical aspects of human malignancies, including invasion and metastasis.

Spontaneous Metastasis Mouse Models: A Platform to Study the Metastatic Potential of Orthotopically Injected Colorectal Cancer Cells

The video describes the laser dissection of the 3D organotypic co-culture model with micron-level precision. In 3D organotypic models, stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimensionally co-cultured with cancer epithelial cells. The 3D model serves as an experimental tool that enables invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser Microdissection: A Technique to Isolate Invading Colorectal Cancer cells from a 3D Organotypic Culture Model

Een eenvoudige methode om primaire murine colon tumor organoïde stellen beschreven. Deze methode maakt gebruik van de functie die colon tumorcellen overleven en te groeien in organoids in media die beperkte groei factoren, terwijl de normale colon epitheel niet doen.

In vitro organoïde Cultuur van primaire Mouse Colon Tumoren

Moleculaire profilering van laser gemicrodissecteerde cellen en stroma van synthetische, weefselengineering darmkanker modellen vertegenwoordigt een nieuwe benadering en manipuleerbaar te karakteriseren en ontleden de kenmerkende biologie op het grensvlak tussen tumorcellen aan de voorzijde en invasieve kanker geassocieerd stromacellen.

Molecular Profiling van de invasieve tumor micro in een 3-dimensionaal model van colorectale kanker cellen en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Fibroblasts

Om zeer gevoelige detectie van de verspreiden menselijke colorectaal carcinoom (CRC) cellen koloniseren van weefsels, tonen we hierin een protocol voor efficiënte transductie van groen fluorescent proteïne (GFP) lentivirale deeltjes in PDX-afgeleide CRC organoid cellen voorafgaand aan hun injectie in ontvangende muizen, met stereo-fluorescentie microscopische observatie.

Hoog-gevoeligheids detectie van micrometastasen gegenereerd door GFP Lentivirus-getransduceerde Organoids gekweekt uit een patiënt-afgeleide dikke darm Tumor

Dit protocol beschrijft de orthotope implantatie van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen. Het model recapituleert gevorderde uitgezaaide ziekte van colorectale kanker en maakt de evaluatie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen mogelijk in een klinisch relevant scenario van long- en levermetastasen.

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Het protocol beschrijft een methode voor het creëren van een van patiënten afgeleid organoïdemodel voor colorectale kanker (CRC), gekweekt in co-cultuur met tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's) om hun interacties en therapeutisch potentieel te bestuderen. Dit model biedt een preklinisch platform om immuunresponsen in de micro-omgeving van de tumor te onderzoeken en om de werkzaamheid van op TIL gebaseerde therapie voor gepersonaliseerde CRC-behandeling te voorspellen.

Oprichting van een co-cultuursysteem van patiënt-afgeleide colorectale tumororganoïden en tumor-infiltrerende lymfocyten (TIL's)

De extracellulaire matrix ondergaat ingrijpende verbouwing tijdens de wondgenezing, ontsteking en het ontstaan ​​van tumoren. Wij presenteren een nieuwe intravitale immunofluorescentie microscopie benadering van de dynamiek van fibrillaire en mesh-achtige matrix componenten met hoge ruimtelijke en temporele resolutie met behulp van epifluorescentie of twee-foton microscopie visualiseren.

Langdurige Intravitale Immuunfluorescentie beeldvorming van Tissue Matrix Bestanddelen met Epifluorescentie en twee-foton microscopie

Leer de fabricage van colorectale kanker organoïden uit de SW1222-cellijn met ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix. Deze methode optimaliseert matrixsamenstellingen voor effectieve groei en draagt bij aan regeneratieve geneeskunde.

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix (Video) | JoVE Journal

Fabricage en karakterisering van organoïden van colorectale kanker uit de SW1222-cellijn in ultrakorte zelfassemblerende peptidematrix

Meer video's verkennen