CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryo's
March 15th, 2024
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde aanpak voor het produceren van genetisch gemodificeerde rattenmodellen. Adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt gebruikt om een DNA-reparatiesjabloon af te leveren, en elektroporatie wordt gebruikt om CRISPR-Cas9-reagentia af te leveren om het genoombewerkingsproces in een 2-cellig embryo te voltooien.
Op CRISPR gebaseerde genoombewerkingstools hebben de productie van genetisch gemanipuleerde rep-modellen aanzienlijk vergemakkelijkt. Het CRISPR-systeem bestaat uit een enkel gids-RNA-complex naar een Cas9-nuclease en kan worden geprogrammeerd om zich te richten op een interessante sequentie binnen het genoom om een dubbelstrengs DNA-breuk te creëren. Door de gelijktijdige levering van een DNA-reparatiesjabloon kan deze DNA-breuk nauwkeurig worden hersteld, samen met de toevoeging van elke gewenste gemanipuleerde DNA-sequentie via een proces dat Homology Directed Repair wordt genoemd.
Het is door dit proces dat we in staat zijn om knock-in rattenmodellen te genereren met gerichte DNA-inserties of -substituties. Met behulp van dit protocol presenteren we een aangepaste aanpak met behulp van adeno-geassocieerd virus om een DNA-reparatiesjabloon aan rattenembryo's te leveren, samen met een daaropvolgende levering van CRISPR Cas9-complexen via elektroporatie van tweecellige embryo's. AAV-serotypen 1 of 6 zijn verpakt met een gemanipuleerd DNA-reparatiesjabloon dat is ontworpen om te worden geïntegreerd in het rattengenoom via het CRISPR-gemedieerde Homology Directed Repair-proces.
De AAV wordt toegevoegd aan een druppel van 30 microliter KSOM-media van ratten in een eindconcentratie van 3 x 10 tot de 7e genoomkopieën per microliter. Vervolgens worden vers verzamelde embryo's in het eencellige stadium met zichtbare pronuclei vervolgens overgebracht naar de media die AAV bevatten, waardoor virale transductie kan plaatsvinden. Met behulp van ons protocol is het niet nodig om de zona pellucida te verdunnen, aangezien AAV-serotypen 1 en 6 gemakkelijk kunnen passeren voor een efficiënte levering van DNA-reparatiesjablonen.
Embryo's worden 's nachts met de AAV gekweekt bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en maximale luchtvochtigheid. De volgende dag wordt een elektroporatiemengsel gemaakt met honderd nanogram per microliter enkelvoudig gids-RNA en honderd nanogram per microliter Cas9-eiwit verdund in OptiMIM-media. Het mengsel wordt gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om de vorming van CRISPR RNP-complexen mogelijk te maken.
Tijdens de incubatietijd wordt de elektroporator ingeschakeld en worden de draden aan de glasplaatjeelektroden bevestigd. Nadat de RNP-formatie is voltooid, wordt vijf microliter elektroporatiemengsel tussen de elektroden gepipetteerd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen luchtbellen in de oplossing komen. Embryo's, nu in het tweecellige stadium, worden verwijderd uit de media die AAV bevatten en voorzichtig verplaatst naar het elektroporatiemengsel tussen de elektroden.
Embryo's worden uitgelijnd, zodat geen van beide elektroden in aanraking komt, omdat dit lysis veroorzaakt tijdens de elektroporatie. Hier is een weergave van deze procedure door de microscoop. Het is ook belangrijk op te merken dat de impedantie zal afnemen naarmate het volume tussen de elektroden toeneemt.
Om deze reden, en om het elektroporatiemengsel niet te verdunnen, moeten zo min mogelijk media samen met de embryo's worden teruggeplaatst. Vervolgens wordt de impedantie gemeten door op de knop met een ohm-symbool erop te drukken. De impedantie moet tussen 0,18 en 0,3 ohm liggen.
Indien binnen bereik, wordt de elektroporatie gestart door op de startknop te drukken. Dit proces duurt maar een paar seconden, en zo ziet het eruit door de microscoop. U zult merken dat er zich snel belletjes vormen op elke elektrode.
Onmiddellijk na de elektroporatie worden embryo's van het glasglaasje verzameld en driemaal gewassen in verse KSOM-media voor ratten. De embryo's kunnen vervolgens worden gekweekt voor in-vitro-onderzoeken of worden overgebracht naar surrogaatvrouwtjes om levende nakomelingen te produceren. Het is belangrijk op te merken dat zwelling van het embryo vaak voorkomt na elektroporatie.
Deze zwelling zou na een paar uur op kweek moeten verdwijnen. Het is ook gebruikelijk om cellulaire fusiegebeurtenissen te zien in maximaal 20% van de tweecellige embryo's na elektroporatie. Celfusie kan doorgaans worden vermeden door een zorgvuldige horizontale asuitlijning van de embryo's tussen de elektroden.
Het testen van ons protocol in rattenembryo's en het screenen van gekweekte blasten voor het inbrengen van een gemanipuleerde korte kunstmatige intronsequentie met twee loxP-sites. We merkten op dat meer dan 60% van de blastocysten het correct gerichte knock-in-allel bevat op basis van sequentieanalyse van de volgende generatie. Vervolgens testen we ons protocol om levende knock-in ratten te produceren verder en ontwerpen we een project om een Cre-recombinase-coatingsequentie te ontwikkelen die gericht is op de ATG-startplaats van het DRD2-gen van de rat.
Van de 11 geboren nakomelingen waren er 10 positief door PCR-analyse in de vijf primaire homologie-arm, drie primaire homologie-arm en een interne PCR-test om Cre-recombinase te detecteren. Samenvattend over zeven verschillende projecten hebben we een gemiddeld slagingspercentage van 76% bereikt bij stichterdieren, zoals bepaald door PCR-analyse over homologie-armovergangen en DNA-sequentieverificatie. Met behulp van deze AAV-gemedieerde DNA-afgifte en elektroporatiepijplijn voor tweecellige embryo's hebben we aanzienlijk hogere knock-in-efficiënties ervaren dan traditionele benaderingen voor DNA-inserties tot drie KB lang.
Het is ook belangrijk op te merken dat, hoewel we het gebruik van deze procedure in rattenembryo's hebben aangetoond, het ook effectief kan worden toegepast op andere soorten voor het genereren van gerichte DNA-inserties.
Overzicht
Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde aanpak voor het produceren van genetisch gemodificeerde ratmodellen met behulp van CRISPR-technologie. Adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt gebruikt om een DNA-reparatiesjabloon af te leveren, terwijl elektroporatie wordt toegepast om CRISPR-Cas9 reagentia in 2-cellig embryo's te introduceren voor genoombewerking.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genetische manipulatie
- Neurowetenschappen
- Modelorganismen
Achtergrond
- Op CRISPR gebaseerde genoombewerkingshulpmiddelen maken nauwkeurige wijzigingen in het genoom mogelijk.
- Het systeem gebruikt een geleidings-RNA en Cas9-nuclease om gerichte DNA-breuken te creëren.
- Homologie-gestuurde reparatie maakt de integratie van gemanipuleerde DNA-sequenties mogelijk.
- Adeno-geassocieerd virus dient als aflevermechanisme voor DNA-reparatiesjablonen.
Doel van het onderzoek
- Om een gewijzigde aanpak te presenteren voor het genereren van knock-in ratmodellen.
- Om AAV te gebruiken voor efficiënte aflevering van DNA-reparatiesjablonen.
- Om de effectiviteit van elektroporatie voor CRISPR-Cas9-aflevering aan te tonen.
Gebruikte methoden
- Aflevering van AAV-serotypen 1 of 6 met gemanipuleerde DNA-reparatiesjablonen.
- Elektroporatie van CRISPR-Cas9 complexen in rat 2-cellig embryo's.
- Toepassing van Homologie-gestuurde reparatie voor nauwkeurige genoombewerking.
- Evaluatie van de efficiëntie van het gewijzigde protocol in het genereren van genetisch gemodificeerde ratten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle integratie van DNA-reparatiesjablonen in het ratgenoom.
- Generatie van gerichte knock-in ratmodellen met gewenste genetische modificaties.
- Demonstratie van de effectiviteit van AAV en elektroporatie bij embryobewerking.
- Validatie van de efficiëntie van het protocol in vergelijking met traditionele methoden.
Conclusies
- Het gewijzigde protocol verbetert de productie van genetisch gemodificeerde ratmodellen.
- AAV en elektroporatie zijn effectieve hulpmiddelen voor genoombewerking in embryo's.
- Deze aanpak kan toekomstig onderzoek in genetische manipulatie en neurowetenschappen vergemakkelijken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Efficient generation of genetically engineered rat models is critical for translational research and preclinical validation in biopharma pipelines. This protocol leverages AAV-mediated DNA delivery and 2-cell embryo electroporation to streamline CRISPR-Cas9 genome editing, reducing technical barriers and improving knock-in efficiency. The approach enhances predictive confidence and accelerates the creation of disease-relevant models for target validation and mechanistic studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid generation of knock-in rat models for functional target interrogation.
- Supports mechanistic de-risking by facilitating precise genetic modifications.
- Improves predictive confidence in target validation through high-efficiency genome editing.
Screening & Assay Development
- Provides validated animal models for downstream phenotypic screening and assay development.
- Enhances reproducibility and standardization by minimizing embryo manipulation variability.
- Delivers quantitative genotyping outputs for reliable model characterization.
Translational & Preclinical Research
- Enables creation of disease-relevant rat models for translational biomarker studies.
- Facilitates continuity from genetic discovery to preclinical validation in vivo.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust in vivo data.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling efficient generation of genetically modified models for hypothesis testing and lead validation.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification via targeted genome editing.
- Screening: Supplies reproducible animal models for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative genotyping and sequencing outputs for model verification.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases with disease-relevant in vivo systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for generating diverse genetic models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflow, enhances reproducibility, and minimizes technical skill requirements.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and efficient resource allocation across programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryo handling and CRISPR-Cas9 reagent preparation.
- Needs access to electroporation equipment and AAV production capabilities.
- Demands cross-team standardization for reproducible embryo alignment and electroporation parameters.
- Adaptable to other species with consideration of species-specific embryo properties.
- Potential for cellular fusion events and embryo swelling requires careful procedural control.
