Name: CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryos met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Leer CRISPR-Cas9 genoombewerking van rattenembryo's met AAV en elektroporatie van 2-celembryo's. Deze methode genereert knock-in ratmodellen met hoge efficiëntie voor genetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Nolan Davis bedanken voor zijn hulp bij videografie en videobewerking.

Alle experimentele procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Missouri (ACUC-protocol #25580) en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen die zijn uiteengezet in de Guide for the Use and Care of Laboratory Animals.
1. AAV-gemedieerde levering van DNA-reparatiesjablonen
<ol><li>Ontwerp het DNA-construct om de gewenste knock-in-sequentie tussen twee homologie-armen te bevatten. Typische homologie-armlengtes zijn 300-500 bp lang. Zorg ervoor dat het volledige DNA-reparatiesjabloon (homologiearmen + gewenste knock-in-sequentie) wordt geflankeerd door omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) door te klonen in een geschikte plasmide-ruggengraat en te verpakken in recombinant ssAAV1 of ssAAV6 (serotypen 1 of 6). OPMERKING: Als de sgRNA-doelsequentie aanwezig is in de DNA-reparatiesjabloon, is het belangrijk om stille mutaties te ontwikkelen om deze sequentie te verstoren en zo CRISPR-Cas9-gemedieerde bewerking van het correct gerichte allel te voorkomen. LET OP: Recombinante AAV-virale vectoren zijn niet-integrerend en geclassificeerd als BSL-1. Standaard aseptische technieken worden gebruikt voor het pipetteren en behandelen van embryo's die zijn blootgesteld aan virussen.</li>
	<li>Voeg gemanipuleerde ssAAV1 of ssAAV6 (verpakt met DNA-reparatiesjabloon) toe aan 30 μL KSOM-R-media27,28 tot een uiteindelijke concentratie van 3 × 107 genoomkopieën (GC)/μL onder minerale olie in een petrischaal van 35 mm.</li>
	<li>Plaats zygoten met zichtbare pronuclei in de KSOM-R-media die gemanipuleerde ssAAV bevatten. OPMERKING: Met behulp van dit protocol is het niet nodig om de zona pellucida te verdunnen, aangezien AAV-serotypen 1 en 6 gemakkelijk kunnen passeren voor een efficiënte levering van DNA-reparatiesjablonen.</li>
	<li>Incubeer bij 37 °C met 5% CO2 en maximale vochtigheid gedurende 18-20 uur om voldoende virale transductie mogelijk te maken.</li>
</ol>2. Voorbereiding van elektroporatie
<ol><li>Maak de volgende dag een elektroporatiemengsel met 100 ng/μL sgRNA en 100 ng/μL Cas9-eiwit verdund in Opti-MEM-media in een steriele RNasevrije buis. Meng voorzichtig.</li>
	<li>Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om RNP-vorming mogelijk te maken.</li>
	<li>Schakel tijdens de incubatietijd de elektroporator in en sluit de draden aan op een glazen schuifelektrode met een spleet van 1.5 mm.</li>
	<li>Stel elektroporatieparameters in zoals beschreven in tabel 1.</li>
</ol>3. Elektroporatie van 2-cellige embryo's
<ol><li>Pipetteer voorzichtig 5 μL van het CRISPR-elektroporatiemengsel tussen de twee elektroden op het objectglaasje en zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de oplossing komen.</li>
	<li>Verwijder het 2-cellige embryo uit de AAV-oplossing. Lijn embryo's met een 2-cellig stadium uit in het mengsel zonder dat ze de zijkanten van de elektroden raken. Dit wordt gedaan om lysis te voorkomen.</li>
	<li>Druk op de Ohm-knop om de impedantie te meten. Controleer of de impedantie tussen 0,100 en 0,300 kΩ ligt. Het reactievolume zal de impedantie veranderen (voeg volume toe om de impedantie te verlagen en trek het volume af om de impedantie te verhogen).</li>
	<li>Druk op Start. Het proces duurt enkele seconden.</li>
	<li>Verwijder de embryo's onmiddellijk na de elektroporatie en was ze 3 keer in verse druppels van 30 μL KSOM-R-media.</li>
	<li>Plaats de embryo's terug in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en maximale vochtigheid voor in-vitrokweek in druppels van 500 μl KSOM-R-media onder minerale olie. U kunt ook embryo's chirurgisch overbrengen naar een 1,5 dag post coïtum (dpc) pseudozwangere vrouwelijke rat om levende nakomelingen te produceren.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig1.jpg"> Figuur 1: Schema van AAV-gemedieerde DNA-afgifte en 2-cel embryo-elektroporatiepijplijn voor CRISPR-Cas9-genoombewerking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<ol><li>Lau, C. H., Tin, C., Suh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+strategies+for+targeted+transgene+knock-in+and+gene+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Fac+Rev%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based strategies for targeted transgene knock-in and gene correction.</a> Fac Rev. 9, 20(2020).</li>
<li>Gutschner, T., Haemmerle, M., Genovese, G., Draetta, G. F., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+Regulation+of+Cas9+during+G1+Enhances+Homology-Directed+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair.</a> Cell Rep. 14 (6), 1555-1566 (2016).</li>
<li>Zhang, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+precise+knockin+with+a+double+cut+HDR+donor+after+CRISPR%2FCas9-mediated+double-stranded+DNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage.</a> Genome Biol. 18 (1), 35(2017).</li>
<li>Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easi-CRISPR+for+creating+knock-in+and+conditional+knockout+mouse+models+using+long+ssDNA+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors.</a> Nat Protoc. 13 (1), 195-215 (2018).</li>
<li>Gu, B., Posfai, E., Gertsenstein, M., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+large-fragment+knock-in+mouse+models+using+2-cell+%282C%29-homologous+recombination+%28HR%29-CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mouse+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of large-fragment knock-in mouse models using 2-cell (2C)-homologous recombination (HR)-CRISPR.</a> Curr Protoc Mouse Biol. 10 (1), e67(2020).</li>
<li>Gu, B., Posfai, E., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+targeted+large+insertions+by+microinjection+into+two-cell-stage+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of targeted large insertions by microinjection into two-cell-stage mouse embryos.</a> Nat Biotechnol. 36 (7), 632-637 (2018).</li>
<li>Kurihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair+protein+RAD51+enhances+the+CRISPR%2FCas9-mediated+knock-in+efficiency+in+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">DNA repair protein RAD51 enhances the CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency in brain neurons.</a> Biochem Biophys Res Commun. 524 (3), 621-628 (2020).</li>
<li>Kaneko, T., Sakuma, T., Yamamoto, T., Mashimo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+knockout+by+electroporation+of+engineered+endonucleases+into+intact+rat+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple knockout by electroporation of engineered endonucleases into intact rat embryos.</a> Sci Rep. 4, 6382(2014).</li>
<li>Chen, S., Lee, B., Lee, A. Y., Modzelewski, A. J., He, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+mouse+genome+editing+by+CRISPR+ribonucleoprotein+electroporation+of+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Highly efficient mouse genome editing by CRISPR ribonucleoprotein electroporation of zygotes.</a> J Biol Chem. 291 (28), 14457-14467 (2016).</li>
<li>Hashimoto, M., Yamashita, Y., Takemoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+Cas9+protein%2FsgRNA+into+early+pronuclear+zygotes+generates+non-mosaic+mutants+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Electroporation of Cas9 protein/sgRNA into early pronuclear zygotes generates non-mosaic mutants in the mouse.</a> Dev Biol. 418 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Cas9+protein+into+mouse+zygotes+through+a+series+of+electroporation+dramatically+increases+the+efficiency+of+model+creation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Delivery of Cas9 protein into mouse zygotes through a series of electroporation dramatically increases the efficiency of model creation.</a> J Genet Genomics. 43 (5), 319-327 (2016).</li>
<li>Troder, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+electroporation+approach+for+efficient+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+murine+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">An optimized electroporation approach for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in murine zygotes.</a> PLoS One. 13 (5), e0196891(2018).</li>
<li>Teixeira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+mice+zygotes+with+dual+guide+RNA%2FCas9+complexes+for+simple+and+efficient+cloning-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Electroporation of mice zygotes with dual guide RNA/Cas9 complexes for simple and efficient cloning-free genome editing.</a> Sci Rep. 8 (1), 474(2018).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+GGTA1-deficient+pigs+by+electroporation+of+the+CRISPR%2FCas9+system+into+in+vitro-fertilized+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of GGTA1-deficient pigs by electroporation of the CRISPR/Cas9 system into in vitro-fertilized zygotes.</a> BMC Biotechnol. 20 (1), 40(2020).</li>
<li>Tanihara, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CD163-edited+pig+via+electroporation+of+the+CRISPR%2FCas9+system+into+porcine+in+vitro-fertilized+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Generation of CD163-edited pig via electroporation of the CRISPR/Cas9 system into porcine in vitro-fertilized zygotes.</a> Anim Biotechnol. 32 (2), 147-154 (2021).</li>
<li>Camargo, L. S. A., Owen, J. R., Van Eenennaam, A. L., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+one-step+knockout+by+electroporation+of+ribonucleoproteins+into+zona-intact+bovine+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Efficient one-step knockout by electroporation of ribonucleoproteins into zona-intact bovine embryos.</a> Front Genet. 11, 570069(2020).</li>
<li>Lin, J. C., Van Eenennaam, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-mediated+genome+editing+of+livestock+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Electroporation-mediated genome editing of livestock zygotes.</a> Front Genet. 12, 648482(2021).</li>
<li>Betters, E., Charney, R. M., Garcia-Castro, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+in+vitro+culture+of+early+rabbit+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Data+Brief%22%5BJournal%5D)">Electroporation and in vitro culture of early rabbit embryos.</a> Data Brief. 21, 316-320 (2018).</li>
<li>Miyasaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLICK%3A+one-step+generation+of+conditional+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">CLICK: one-step generation of conditional knockout mice.</a> BMC Genomics. 19 (1), 318(2018).</li>
<li>Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+engineered+nucleases+with+adeno-associated+viral+vectors+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Combining engineered nucleases with adeno-associated viral vectors for therapeutic gene editing.</a> Adv Exp Med Biol. 1016, 29-42 (2017).</li>
<li>Gaj, T., Epstein, B. E., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+engineering+using+adeno-associated+virus%3A+basic+and+clinical+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genome engineering using adeno-associated virus: basic and clinical research applications.</a> Mol Ther. 24 (3), 458-464 (2016).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-READI%3A+Efficient+generation+of+knockin+mice+by+CRISPR+RNP+electroporation+and+AAV+donor+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">CRISPR-READI: Efficient generation of knockin mice by CRISPR RNP electroporation and AAV donor infection.</a> Cell Rep. 27 (13), 3780-3789 (2019).</li>
<li>Mizuno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-embryo+gene+cassette+knockin+by+CRISPR%2FCAS9-mediated+genome+editing+with+adeno-associated+viral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/CAS9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector.</a> iScience. 9, 286-297 (2018).</li>
<li>Davis, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+DNA+knock-in+using+AAV-mediated+delivery+with+2-cell+embryo+CRISPR-Cas9+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genome+Ed%22%5BJournal%5D)">Efficient DNA knock-in using AAV-mediated delivery with 2-cell embryo CRISPR-Cas9 electroporation.</a> Front Genome Ed. 5, 1256451(2023).</li>
<li>Smirnikhina, S. A., Zaynitdinova, M. I., Sergeeva, V. A., Lavrov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+homology-directed+repair+in+genome+editing+experiments+by+influencing+the+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving homology-directed repair in genome editing experiments by influencing the cell cycle.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), (2022).</li>
<li>Takata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+non-homologous+end-joining+pathways+of+DNA+double-strand+break+repair+have+overlapping+roles+in+the+maintenance+of+chromosomal+integrity+in+vertebrate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells.</a> EMBO J. 17 (18), 5497-5508 (1998).</li>
<li>Men, H., Stone, B. J., Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+optimization+to+promote+rat+embryonic+development+to+the+blastocyst+stage+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Media optimization to promote rat embryonic development to the blastocyst stage in vitro.</a> Theriogenology. 151, 81-85 (2020).</li>
<li>Men, H., Amos-Landgraf, J. M., Bryda, E. C., Franklin, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KSOM-R+supports+both+mouse+and+rat+preimplantation+embryo+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">KSOM-R supports both mouse and rat preimplantation embryo development in vitro.</a> Theriogenology. 198, 69-74 (2023).</li>
<li>Romeo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+diffuses+across+zona+pellucida+for+effortless+gene+delivery+to+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">AAV diffuses across zona pellucida for effortless gene delivery to fertilized eggs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 526 (1), 85-90 (2020).</li>
<li>Fulka, J., Moor, R. M., Fulka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrofusion+of+mammalian+oocytes+and+embryonic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Electrofusion of mammalian oocytes and embryonic cells.</a> Methods Mol Biol. 48, 309-316 (1995).</li>
<li>Rems, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+electrofusion+using+nanosecond+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cell electrofusion using nanosecond electric pulses.</a> Sci Rep. 3, 3382(2013).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Het CRISPR-Cas-genoombewerkingssysteem heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van genetische manipulatie door de efficiënte productie van zowel eenvoudige als complexe, op maat gemaakte genetische modificaties in een verscheidenheid aan diersoorten mogelijk te maken. Frequente verfijningen en verbeteringen in technieken die verband houden met genoombewerking vergroten de veelzijdigheid ervan. Hier hebben we een nieuwe aanpak beschreven met behulp van ssAAV-gemedieerde DNA-afgifte samen met 2-cellige embryo-elektroporatie van CRISPR-Cas9-reagentia in 2-cellige knaagdierembryo's. We hebben aangetoond dat dit een effectieve manier is om gerichte knock-in diermodellen te produceren.
Een groot voordeel van het gebruik van AAV is dat het mogelijk is om grotere DNA-reparatiesjablonen in embryo's af te leveren zonder dat er micro-injectietechnieken nodig zijn. AAV-gemedieerde toediening helpt ook om de beperkingen van de DNA-sjabloongrootte van elektroporatie alleen enigszins te omzeilen. Er zijn echter enkele belangrijke overwegingen bij het gebruik van AAV. De zona pellucida, de verharde glycoproteïnematrix rond de bevruchte eicel, dient als een fysieke barrière die de afgifte van nucleïnezuren vaak bemoeilijkt. Het uitdunnen van de zona pellucida is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt voor een betere toegang tot het embryo. Sommige onderzoeken hebben echter gemeld dat de ontwikkeling van het embryo wordt belemmerd door infectie met hogere doses (1 × 107 GC/μL tot 1 × 109 GC/μL) AAV in embryo's waarin de zona pellucida was verdund voorafgaand aan AAV-infectie22. Er zijn echter enkele serotypen van AAV die zich over de zona pellucida29 kunnen verspreiden. Ons protocol omvat geen verdunning van de zona pellucida en maakt gebruik van AAV met serotypen 1 en 6 in een concentratie van 3 × 10,7 GC/μl om knock-in-percentages te bereiken die hoger zijn dan eerder gepubliceerde rapporten. We hebben onder deze omstandigheden geen verminderde embryonale ontwikkeling opgemerkt.
De hoge knock-in-efficiëntie die wordt bereikt door elektroporatie van 2-cellige embryo's is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan de verlengde G2-fase in embryo's in dit ontwikkelingsstadium, waardoor dit een optimale ontwikkelingsfase is om elektroporatie uit te voeren. Een mogelijke complicatie is echter de waargenomen cellulaire fusie die wordt waargenomen in sommige 2-cellige embryo's tijdens het elektroporatieproces. Deze observatie is niet verwonderlijk, aangezien elektrofusieprocedures vaak worden gebruikt voor het samensmelten van zoogdiercellen en fusie mogelijk kan worden vermeden door een zorgvuldige horizontale in plaats van verticale asuitlijning tussen de elektroden30,31. Bovendien, wanneer genoombewerking in een later stadium van de ontwikkeling plaatsvindt, zoals 2-cel in plaats van 1-cel, is er een groter potentieel voor meer mozaïcisme. Met behulp van onze 2-cellige elektroporatiebenadering zagen we een lichte toename van mozaïcisme in vergelijking met pronucleaire injectie (86% voor AAV-benadering en 67% voor PNI-benadering) in een 1-cellig stadium, maar waren we nog steeds in staat om kiembaantransmissie van het gemodificeerde allel te bereiken in alle geteste stichterdieren. Een ander potentieel punt van zorg is de mogelijkheid van tandem-concatemer-integratie van AAV-afgeleide DNA-sjablonen. Hoewel we geen long-read sequencing hebben uitgevoerd voor de modellen die in dit protocol worden beschreven, hebben we wel een enkele integratie van de DNA-sjablonen voor alle modellen bevestigd met behulp van druppel-digitale PCR (ddPCR) kopienummervariatie.
Ten slotte, hoewel onze methode AAV-afgifte van interessante DNA-sequenties omvatte, zou het mogelijk moeten zijn om andere virale en niet-virale gemedieerde DNA-afgiftebenaderingen te gebruiken in combinatie met embryo-elektroporatie om embryo's met succes genetisch te manipuleren. Concluderend kan worden gesteld dat het combineren van ssAAV-gemedieerde DNA-afgifte en elektroporatie van CRISPR-Cas9 RNP's in embryo's in het 2-cellige stadium een efficiënte en gemakkelijk aanpasbare methode is voor het efficiënt genereren van knock-in rattenmodellen.

De ontwikkeling van op CRISPR gebaseerde genoombewerkingstools heeft ons vermogen versneld om efficiënt nieuwe en meer geavanceerde genetisch gemanipuleerde rattenmodellen te genereren. Single-guide RNA, samen met Cas9-nuclease, wordt gecombineerd om Ribonucleoproteïne (RNP)-complexen te vormen die zich richten op DNA-sequenties die van belang zijn binnen het genoom en resulteren in dubbelstrengs DNA-breuken. Omdat cellulaire DNA-reparatiemechanismen foutgevoelig zijn, worden inserties en deleties (INDEL's) geïntroduceerd tijdens het reparatieproces die de functie van een doelgen kunnen verstoren. Wanneer er sprake is van gelijktijdige afgifte van een gewenste gemanipuleerde DNA-sequentie (reparatiesjabloon) samen met genoombewerkingsreagentia, vindt het inbrengen van de reparatiesjabloon in het gebied met de dubbelstrengs DNA-breuk plaats via een proces dat homologiegerichte reparatie (HDR) wordt genoemd. Dit is een effectieve strategie voor het genereren van diermodellen met gerichte DNA-inserties/-substituties (knock-ins). Een beperking is dat knock-in-sequenties vaak groot zijn, waarvan is aangetoond dat het de efficiëntie van het bewerken van genen vermindert, waardoor het genereren van het gewenste model moeilijker wordt1. Strategieën om de knock-in-efficiëntie te verhogen, omvatten linearisatie van zowel dubbelstrengs DNA (dsDNA) als enkelstrengs DNA (ssDNA) reparatiesjablonen en chemische modificatie van DNA-reparatiesjablonen 2,3,4. Bovendien zijn pronucleaire micro-injectie samen met HDR-stimulerende verbindingen, toepassing van elektrische pulsen in combinatie met micro-injectie en getimede micro-injectie in 2-cellige embryo's allemaal 5,6,7 geprobeerd. Ondanks het succes van sommige van deze benaderingen blijft de integratie van DNA-sequenties groter dan 1,0 kb technisch uitdagend.
Elektroporatie, een veelgebruikte methode om reagentia in gekweekte cellijnen te brengen, biedt een alternatief voor micro-injectie voor het afleveren van CRISPR-Cas9-componenten in embryo's. Embryo-elektroporatie, voor het eerst aangetoond in rattenembryo's8, is sindsdien met succes gebruikt als toedieningsmethode bij muizen 9,10,11,12,13, varkens 14,15 en andere diermodelorganismen 16,17,18 . Embryo's, gesuspendeerd in het medium dat CRISPR-Cas9-reagentia bevat, worden in een cuvet of op een glasplaatje tussen twee elektroden geplaatst en onderworpen aan directe pulsen van elektrische stromen. Hierdoor ontstaan voorbijgaande openingen in de zona pellucida en het plasmamembraan van het embryo waardoor de CRISPR-Cas9-componenten de embryo's binnendringen. Meestal worden elektrische "poring"-pulsen op middelhoog niveau gebruikt om de tijdelijke openingen te creëren, gevolgd door elektrische "overdrachtspulsen" op een lager niveau die de beweging van de negatief geladen genoombewerkingscomponenten vergemakkelijken. Embryo-elektroporatie is efficiënt, heeft een hoge doorvoer en is eenvoudig uit te voeren. Hoewel is aangetoond dat embryo-elektroporatie zeer succesvol is voor de introductie van kleine (<200 bp) ssDNA-reparatiesjablonen, zijn er weinig meldingen van succesvolle elektroporatie van grotere (>1,0 kb) reparatiesjablonen13,19. Deze beperking van de grootte vormt een belangrijke beperking van de elektroporatie van embryo's voor het genereren van knock-in diermodellen die grote inserties vereisen.
In de context van gentherapie worden adeno-geassocieerde virussen (AAV's) al lang gebruikt als voertuigen om genetisch materiaal af te leveren vanwege hun efficiënte in vivo infectiviteit van zowel delende als niet-delende cellen, gebrek aan pathogeniteit en zeldzame genomische integratie20,21. Onlangs hebben meer studies AAV's gecombineerd met CRISPR-Cas9-technologie om DNA-reparatiesjablonen en CRISPR-reagentia te introduceren 22,23,24. Deze aanpak maakt het mogelijk om grotere DNA-reparatiesjablonen te leveren zonder dat er micro-injectietechnieken nodig zijn.
De HDR-route is actiever in de late S- en G2-fasen van de celcyclus25,26. In in vitro uitgevoerde onderzoeken werd een significante toename van de knock-in-efficiëntie bereikt door afgifte van CRISPR-Cas9 RNP's en DNA-reparatiesjablonen in G2-gesynchroniseerde cellen of door beperking van de aanwezigheid van Cas9-eiwit tot late S- en G2-fasen met behulp van een Cas9-Geminin-fusie-eiwit2. Bovendien is er een belangrijke zygote genoomactivering (ZGA) die optreedt tijdens de verlengde G2-fase van het embryo in het 2-cellige stadium, en dit wordt geassocieerd met een open chromatinetoestand. Er wordt gespeculeerd dat dit de CRISPR-Cas9 RNP's en reparatiesjablonen een grotere toegankelijkheid van het genomische DNA geeft.
Ons doel was om voort te bouwen op al deze observaties, door de AAV-benadering te combineren met embryo-elektroporatie om CRISPR-Cas9 RNP's te introduceren in het 2-cellige stadium van embryo-ontwikkeling. Deze strategie maakt gebruik van de grotere capaciteit voor het afleveren van DNA-reparatiesjablonen van AAV, het technische gemak van elektroporatie en het meer optimale 2-cellige tijdstip voor genomische toegankelijkheid tijdens de ontwikkeling van embryo's om een efficiënte methode te creëren voor gerichte genetische manipulatie van DNA-inserties. Zoals benadrukt in dit protocol, maakt onze geoptimaliseerde methode de productie mogelijk van gerichte knock-in rattenmodellen met inserties van DNA-sequenties van 1,2 tot 3,0 kb groot zonder dat micro-injectietechnieken nodig zijn.

<table><tbody><tr><td>Leads with alligator clips for electrodes</td><td>NepaGene</td><td>C117</td><td></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>MilliporeSigma</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>NepaGene21 Super Electroporator&nbsp;</td><td>NepaGene</td><td>NEPA21</td><td></td></tr><tr><td>Platinum plate electrodes on slide glass</td><td>NepaGene</td><td>CUY501P1-1.5</td><td></td></tr><tr><td>PURedit Cas9 Protein</td><td>MilliporeSigma</td><td>PECAS9</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA (chemically-modified)</td><td>Synthego</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ssAAV1 or ssAAV6 packaged DNA repair template</td><td>Vectorbuilder</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas9 genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (aav) en elektroporatie van 2-celembryo's

CRISPR-Cas9 Genome Editing of Rat Embryos using Adeno-Associated Virus (AAV) and 2-Cell Embryo Electroporation

Genoombewerkingstechnologie wordt veel gebruikt om genetisch gemodificeerde dieren, waaronder ratten, te produceren. Cytoplasmatische of pronucleaire injectie van DNA-reparatiesjablonen en CRISPR-Cas-reagentia is de meest gebruikelijke toedieningsmethode in embryo's. Dit type micromanipulatie vereist echter toegang tot gespecialiseerde apparatuur, is arbeidsintensief en vereist een bepaald niveau van technische vaardigheid. Bovendien leiden micro-injectietechnieken vaak tot een lagere overleving van het embryo vanwege de mechanische belasting van het embryo. In dit protocol hebben we een geoptimaliseerde methode ontwikkeld om grote DNA-reparatiesjablonen te leveren die kunnen werken in combinatie met CRISPR-Cas9-genoombewerking zonder dat micro-injectie nodig is. Dit protocol combineert AAV-gemedieerde DNA-afgifte van enkelstrengs DNA-donorsjablonen samen met de afgifte van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne (RNP) door elektroporatie om 2-cellige embryo's te modificeren. Met behulp van deze nieuwe strategie hebben we met succes gerichte knock-in rattenmodellen geproduceerd met insertie van DNA-sequenties van 1,2 tot 3,0 kb groot met een efficiëntie tussen 42% en 90%.

Volgens het protocol is er een effectieve AAV-gemedieerde afgifte van de DNA-reparatiesjabloon, waardoor zeer efficiënte HDR mogelijk is nadat 2-cellige embryo's zijn geëlektropoleerd met CRISPR-Cas9 RNP's. Zoals te zien is in de video, resulteert een succesvol elektroporatieproces in de vorming van luchtbellen op elke elektrode (figuur 2C) en blijft de impedantie binnen het bereik van 0,100 en 0,300 kΩ. Na elektroporatie is het niet ongebruikelijk dat embryo's opzwellen en de perivitelline-ruimte in de zona pellucida vullen (figuur 3). Deze zwelling zou na een paar uur in cultuur moeten verdwijnen. Het is ook niet ongewoon om een klein percentage (tot 20%) van cellulaire fusiegebeurtenissen te zien na het elektropoleren van 2-cellige embryo's (Figuur 3). Celfusie kan mogelijk worden vermeden door een zorgvuldige horizontale asuitlijning in plaats van verticale asuitlijning tussen de elektroden (Figuur 2B). Meestal gooien we echter alle gefuseerde embryo's gewoon weg na het elektroporatieproces.
Onze AAV-gemedieerde DNA-afgifte met 2-cellige embryo CRISPR-Cas9 RNP-elektroporatietechniek heeft bewezen zeer effectief te zijn voor het genereren van knock-in rattenmodellen met gerichte inserties. Bij het testen van onze methode in rattenembryo's en het screenen van gekweekte blastocysten voor het inbrengen van een gemanipuleerd kort kunstmatig intron met loxP-sites, merkten we op dat meer dan 60% van de blastocysten het correct gerichte knock-in-allel bevatte op basis van Next Generation Sequence (NGS)-analyse (Figuur 4). Verder, bij het testen van onze methode om levende knock-in ratten te produceren, hebben we een project ontworpen om een Cre-recombinase-coderende sequentie te ontwikkelen die gericht is op de ATG-startplaats van het Drd2-gen van de rat. Het AAV-verpakte DNA-donorsjabloon bestond uit ITR-sequenties die nodig zijn voor AAV-verpakking, een 5'-homologie-arm (422 bp lang), een Cre-pA-sequentie (1,339 bp lang) en een 3'-homologie-arm (477 bp lang) (Figuur 5A). Van de 11 geboren nakomelingen waren er 10 positief door PCR-analyse voor de correct ingebrachte Cre-pA-sequentie in de ATG-startplaats van rat Drd2 (Figuur 5B-D). De gerichte insertie werd later bevestigd door DNA-sequentieanalyse. Samenvattend over 7 verschillende projecten hebben we een gemiddeld slagingspercentage van 76% bereikt bij stichterdieren, zoals bepaald door PCR-analyse over homologie-armjuncties en DNA-sequentieverificatie (tabel 2).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Spanning [V]</td>
			<td>Pulslengte [msec]</td>
			<td>Pulsinterval [msec]</td>
			<td># van peulvruchten</td>
			<td>Verval snelheid [%]</td>
			<td>Polariteit</td>
		</tr><tr><td>Poring Puls</td>
			<td>40</td>
			<td>3.5</td>
			<td>50</td>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>+</td>
		</tr><tr><td>Puls overbrengen</td>
			<td>5</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>5</td>
			<td>40</td>
			<td>+/-</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Elektroporatieparameters. Zorg ervoor dat de stroomlimiet AAN is tijdens de elektroporatie.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig2.jpg"> Figuur 2: Elektroporatieproces van 2-cellige embryo's. (A) Elektrode van objectglaasjes. (B) Embryo's die zijn gesuspendeerd in CRISPR-Cas9-reagentia voor genoombewerking en voorafgaand aan elektroporatie in de glasplaatje-elektrode zijn geladen. (C) Vorming van luchtbellen op elke elektrode tijdens elektroporatie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig3.jpg"> Figuur 3: Uiterlijk van het embryo na elektroporatie. Celfusie wordt opgemerkt in maximaal 20% van de 2-cellige embryo's na elektroporatie. Embryonale cellen kunnen ook opzwellen in de zona pellucida en de perivitelline-ruimte vullen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig4.jpg"> Figuur 4: AAV-gemedieerde DNA-afgifte en 2-cellige elektroporatie van embryo's knock-in efficiëntie in kweekblastocysten van ratten. Gegevens gepresenteerd als percentage blastocysten dat positief is voor correct knock-in-allel gedetecteerd door Next Generation Sequencing (NGS). N=28 blastocysten (controlegroep met alleen kweek), N=37 blastocysten (controlegroep met alleen elektroporatie (EP)) en N=35 blastocysten (AAV+EP-groep). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66069/66069fig5.jpg"> Figuur 5: Creatie van een Drd2-Cre knock-in rattenmodel. (A) Targeting van het Drd2-gen van de rat. Het RNP-complex is ontworpen om zich te richten op Exon 2, dat de startsite van de coderingsregio bevat. De AAV-donorsjabloon bevatte virale omgekeerde terminale herhalingssequenties (ITR), 5' en 3' Drd2-genhomologiearmen (HA) en het Cre-gen met een polyA-sequentie. Succesvolle integratie van het donorsjabloon klopt in het Cre-gen 3' naar de startplaats binnen Exon 2. Dit plaatst het Cre-gen onder controle van de Drd2-promotor en schakelt tegelijkertijd het Drd2-gen uit. De locatie van PCR-primers die worden gebruikt voor bevestiging van een succesvolle knock-in worden aangegeven met paarse pijlen. (B) PCR-analyse van mogelijk genoombewerkte dieren (Lanes B10-C8) met primers die zich uitstrekken over de 5'-homologie-arm. Baan C9: wildtype (negatieve controle); Rijstrook C10: geen sjabloon (negatieve controle). De verwachte amplicongrootte voor knock-in-positieve dieren is 601 bp. (C) PCR-analyse van mogelijk genoombewerkte dieren (Lanes D8-E6) met primers die zich uitstrekken over de 3'-homologiearm. Rijstrook E7: wildtype; Rijstrook E8: geen sjablooncontrole. De verwachte amplicongrootte voor knock-in-positieve dieren is 676 bp. (D) Detectie van Cre-genen. De verwachte amplicongrootte is 381 bp. Banen C7-D5: potentiële oprichters; Baan D6: wildtype; Baan D7: geen sjablooncontrole. PCR-reacties werden geanalyseerd door middel van capillaire elektroforese met 15bp-3kb uitlijningsmarkers (aangegeven in groen). De QX DNA-groottemarker wordt links van elke afbeelding weergegeven met een piekgrootte die overeenkomt met de grootte van het PCR-amplicon in basenparen (bp). Dit cijfer is gewijzigd met toestemming van referentie24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66069/66069fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Beschrijving van het project</td>
			<td>Nakomelingen positief voor knock-in (%)</td>
		</tr><tr><td>Oprm1-P2A-Flp (1,7 kb invoegen)</td>
			<td>5/5 (100%)</td>
		</tr><tr><td>Drd2-Cre (1,3 kb invoegen)</td>
			<td>10/11 (91%)</td>
		</tr><tr><td>Triml2-P2A-Cre (1,3 kb invoegen)</td>
			<td>9/16 (56%)</td>
		</tr><tr><td>Cxcl15-iCre (1,3 kb invoegen)</td>
			<td>6/6 (100%)</td>
		</tr><tr><td>Opn4-P2A-Cre (1,2 kb invoegen)</td>
			<td>6/8 (75%)</td>
		</tr><tr><td>Vipr1-FLEX-EGFP (1,4 kb invoegen)</td>
			<td>5/12 (42%)</td>
		</tr><tr><td>Rosa26-FLEX-MTS-KillerRed (3.1 kb invoegen)</td>
			<td>5/7 (71%)</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Slagingspercentages van het knock-in-model

Dit protocol presenteert een geoptimaliseerde aanpak voor het produceren van genetisch gemodificeerde rattenmodellen. Adeno-geassocieerd virus (AAV) wordt gebruikt om een DNA-reparatiesjabloon af te leveren, en elektroporatie wordt gebruikt om CRISPR-Cas9-reagentia af te leveren om het genoombewerkingsproces in een 2-cellig embryo te voltooien.

CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryo's

Genome editing technology is widely used to produce genetically modified animals, including rats. Cytoplasmic or pronuclear injection of DNA repair ...

Op CRISPR gebaseerde genoombewerkingstools hebben de productie van genetisch gemanipuleerde rep-modellen aanzienlijk vergemakkelijkt. Het CRISPR-systeem bestaat uit een enkel gids-RNA-complex naar een Cas9-nuclease en kan worden geprogrammeerd om zich te richten op een interessante sequentie binnen het genoom om een dubbelstrengs DNA-breuk te creëren. Door de gelijktijdige levering van een DNA-reparatiesjabloon kan deze DNA-breuk nauwkeurig worden hersteld, samen met de toevoeging van elke gewenste gemanipuleerde DNA-sequentie via een proces dat Homology Directed Repair wordt genoemd.Het is door dit proces dat we in staat zijn om knock-in rattenmodellen te genereren met gerichte DNA-inserties of -substituties. Met behulp van dit protocol presenteren we een aangepaste aanpak met behulp van adeno-geassocieerd virus om een DNA-reparatiesjabloon aan rattenembryo's te leveren, samen met een daaropvolgende levering van CRISPR Cas9-complexen via elektroporatie van tweecellige embryo's. AAV-serotypen 1 of 6 zijn verpakt met een gemanipuleerd DNA-reparatiesjabloon dat is ontworpen om te worden geïntegreerd in het rattengenoom via het CRISPR-gemedieerde Homology Directed Repair-proces.De AAV wordt toegevoegd aan een druppel van 30 microliter KSOM-media van ratten in een eindconcentratie van 3 x 10 tot de 7e genoomkopieën per microliter. Vervolgens worden vers verzamelde embryo's in het eencellige stadium met zichtbare pronuclei vervolgens overgebracht naar de media die AAV bevatten, waardoor virale transductie kan plaatsvinden. Met behulp van ons protocol is het niet nodig om de zona pellucida te verdunnen, aangezien AAV-serotypen 1 en 6 gemakkelijk kunnen passeren voor een efficiënte levering van DNA-reparatiesjablonen.Embryo's worden 's nachts met de AAV gekweekt bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide en maximale luchtvochtigheid. De volgende dag wordt een elektroporatiemengsel gemaakt met honderd nanogram per microliter enkelvoudig gids-RNA en honderd nanogram per microliter Cas9-eiwit verdund in OptiMIM-media. Het mengsel wordt gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd om de vorming van CRISPR RNP-complexen mogelijk te maken.Tijdens de incubatietijd wordt de elektroporator ingeschakeld en worden de draden aan de glasplaatjeelektroden bevestigd. Nadat de RNP-formatie is voltooid, wordt vijf microliter elektroporatiemengsel tussen de elektroden gepipetteerd, waarbij ervoor wordt gezorgd dat er geen luchtbellen in de oplossing komen. Embryo's, nu in het tweecellige stadium, worden verwijderd uit de media die AAV bevatten en voorzichtig verplaatst naar het elektroporatiemengsel tussen de elektroden.Embryo's worden uitgelijnd, zodat geen van beide elektroden in aanraking komt, omdat dit lysis veroorzaakt tijdens de elektroporatie. Hier is een weergave van deze procedure door de microscoop. Het is ook belangrijk op te merken dat de impedantie zal afnemen naarmate het volume tussen de elektroden toeneemt.Om deze reden, en om het elektroporatiemengsel niet te verdunnen, moeten zo min mogelijk media samen met de embryo's worden teruggeplaatst. Vervolgens wordt de impedantie gemeten door op de knop met een ohm-symbool erop te drukken. De impedantie moet tussen 0,18 en 0,3 ohm liggen.Indien binnen bereik, wordt de elektroporatie gestart door op de startknop te drukken. Dit proces duurt maar een paar seconden, en zo ziet het eruit door de microscoop. U zult merken dat er zich snel belletjes vormen op elke elektrode.Onmiddellijk na de elektroporatie worden embryo's van het glasglaasje verzameld en driemaal gewassen in verse KSOM-media voor ratten. De embryo's kunnen vervolgens worden gekweekt voor in-vitro-onderzoeken of worden overgebracht naar surrogaatvrouwtjes om levende nakomelingen te produceren. Het is belangrijk op te merken dat zwelling van het embryo vaak voorkomt na elektroporatie.Deze zwelling zou na een paar uur op kweek moeten verdwijnen. Het is ook gebruikelijk om cellulaire fusiegebeurtenissen te zien in maximaal 20% van de tweecellige embryo's na elektroporatie. Celfusie kan doorgaans worden vermeden door een zorgvuldige horizontale asuitlijning van de embryo's tussen de elektroden.Het testen van ons protocol in rattenembryo's en het screenen van gekweekte blasten voor het inbrengen van een gemanipuleerde korte kunstmatige intronsequentie met twee loxP-sites. We merkten op dat meer dan 60% van de blastocysten het correct gerichte knock-in-allel bevat op basis van sequentieanalyse van de volgende generatie. Vervolgens testen we ons protocol om levende knock-in ratten te produceren verder en ontwerpen we een project om een Cre-recombinase-coatingsequentie te ontwikkelen die gericht is op de ATG-startplaats van het DRD2-gen van de rat.Van de 11 geboren nakomelingen waren er 10 positief door PCR-analyse in de vijf primaire homologie-arm, drie primaire homologie-arm en een interne PCR-test om Cre-recombinase te detecteren. Samenvattend over zeven verschillende projecten hebben we een gemiddeld slagingspercentage van 76% bereikt bij stichterdieren, zoals bepaald door PCR-analyse over homologie-armovergangen en DNA-sequentieverificatie. Met behulp van deze AAV-gemedieerde DNA-afgifte en elektroporatiepijplijn voor tweecellige embryo's hebben we aanzienlijk hogere knock-in-efficiënties ervaren dan traditionele benaderingen voor DNA-inserties tot drie KB lang.Het is ook belangrijk op te merken dat, hoewel we het gebruik van deze procedure in rattenembryo's hebben aangetoond, het ook effectief kan worden toegepast op andere soorten voor het genereren van gerichte DNA-inserties.

crispr-cas9-genome-editing-rat-embryos-using-adeno-associated-virus

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

In Utero Intraventriculaire injectie en elektroporatie van de E16 Rat embryo&#39;s

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

Een eenvoudige en efficiënte microinjection protocol voor het bewerken van het gen in channel catfish embryo's met behulp van de CRISPR/Cas9-systeem wordt gepresenteerd. In dit protocol, begeleiden RNAs en Cas9 eiwit in de dooier van één-cel embryo's waren microinjected. Dit protocol is gevalideerd door kloppen uit twee channel catfish immuun-gerelateerde genen.

Microinjection van CRISPR/Cas9 eiwit in Channel Catfish, Ictalurus punctatus, embryo's voor Gene Editing

Met behulp van een voorgemonteerd Cas9 is ribonucleoprotein complex (RNP) een krachtige methode voor het bewerken van nauwkeurige en efficiënte genoom. Hier, wijzen wij op het nut ervan over een breed scala van cellen en organismen, met inbegrip van de primaire menselijke cellen en beide klassieke en opkomende modelorganismen.

Verbeterde genoom bewerken met Cas9 Ribonucleoprotein in verschillende cellen en organismen

Hier bieden we een gedetailleerd protocol te verrichten in vivo cardiale gene bewerken in muizen met behulp van recombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-gemedieerde levering van CRISPR. Dit protocol biedt een veelbelovende therapeutische strategie voor de behandeling van Dystrofe cardiomyopathie in Duchenne spierdystrofie en kan worden gebruikt voor het genereren van cardiale-specifieke knock-out in de postnatale muizen.

Adeno-Associated Virus-gemedieerde levering van CRISPR voor cardiale Gene bewerken in muizen

Hier gepresenteerd is een protocol voor efficiënte SCHERPEr/Cas9 ribonucleoproteã-gemedieerde gen bewerken in zoogdiercellen met behulp van buis Electroporation.

SCHERPEr/Cas9 Ribonucleoproteã-gemedieerde nauwkeurige Gene bewerking door buis Electroporation

Ontwikkeling van Murine modellen met specifieke genen gemuleerd in hoofd-en nekkanker patiënten is nodig voor het begrijpen van neoplasie. Hier presenteren we een protocol voor in vitro transformatie van primaire muriene tong cellen met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem om Murine HNC cellijnen met specifieke genomische veranderingen te genereren.

In vitro oprichting van een genetisch gemanipuleerde Muriene hoofd en nekkanker cellijn met behulp van een adeno-geassocieerde virus-Cas9 systeem

Dit artikel is bedoeld om de methodologie voor lentivirale transgenese in rattenembryo's met behulp van meerdere injecties van een virussuspensie in de zygote perivitelline ruimte. Vrouwelijke ratten die zijn gepaard met een vruchtbare mannelijke stam met een andere dominante vacht kleur wordt gebruikt om pseudozwangere pleegmoeders te genereren.

Generatie transgene ratten met behulp van een Lentivirale Vector Approach

Hier presenteren we een aangepaste methode voor cryopreservatie van eencellige embryo's, evenals een protocol dat het gebruik van gevriesontdooide embryo's en elektroporatie koppelt voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen.

Gebruik van gevriesde embryo's voor hoogrendementproductie van genetisch gemodificeerde muizen

Hier bieden we een gedetailleerd, stapsgewijs protocol voor CRISPR/ Cas9-gebaseerde genoomengineering van primaire menselijke B-cellen voor gen knock-out (KO) en knock-in (KI) om biologische functies van genen in B-cellen en de ontwikkeling van B-celtherapieën te bestuderen.

Genoomtechniek van primaire menselijke B-cellen met CRISPR/Cas9

Hier beschrijven we een eenvoudige techniek die bedoeld is voor de efficiënte generatie van genetisch gemodificeerde muizen, CRISPR RNP Electroporation of Zygotes (CRISPR-EZ). Deze methode levert bewerkingsreagentia door elektroporatie in embryo's met een efficiëntie van bijna 100%. Dit protocol is effectief voor puntmutaties, kleine genomische inserties en deleties in zoogdierembryo's.

Efficiënte genoombewerking van muizen door CRISPR-elektroporatie van zygoten

Leer CRISPR-Cas9 genoombewerking van rattenembryo's met AAV en elektroporatie van 2-celembryo's. Deze methode genereert knock-in ratmodellen met hoge efficiëntie voor genetisch onderzoek.

CRISPR-Cas9 Genoombewerking van rattenembryo's met behulp van adeno-geassocieerd virus (AAV) en elektroporatie van 2-celembryo's

Meer video's verkennen