Name: Hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuis in proteomische analyses van extracellulaire blaasjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 2 min 36 s
Description: Leer een protocol voor het hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuizen bij de isolatie van extracellulaire blaasjes voor proteomische analyses. Deze methode vermindert afval en kosten in cardiovasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van de National Institutes of Health grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 en R01HL136431, Kowa Company, Ltd., en het Horizon 2020 Research and Innovation Program van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. 101023041 (R. Cahalane). Figuur 1 is gemaakt met Biorender.com. Het huidige reinigingsprotocol is ontwikkeld door een aanbevolen protocol voor buisreiniging te wijzigen dat werd gepresenteerd op de International Society of Extracellular Vesicles 2023 Education Day (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI). Veel dank aan Dr. Kathryn Howe en Dr. Sneha Raju van het University Health Network (University of Toronto, Canada) voor de originele EV-monsters van het halsslagaderweefsel.

1. Reiniging van de buis
OPMERKING: De EV-isolatieprocedure maakt gebruik van zowel afgedekte als niet-afgedekte UC-buizen van polycarbonaat (hieronder beschreven). Dezelfde procedure werd gevolgd voor zowel afgedekte als niet-afgedekte buizen. In het geval van afgedekte buizen werden de dekseldelen afzonderlijk gereinigd en na droging en vooropslag weer in elkaar gezet.
<ol><li>Na het eerste gebruik van de polycarbonaatbuizen en het verwijderen van het monster, dompelt u de UC-buizen onmiddellijk onder in kraanwater om te voorkomen dat het monster aan de zijkant van de buis uitdroogt.</li>
	<li>Breng de buizen over en dompel ze onder in 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) in kraanwater gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Decanteer buisje voor buisje het meeste, maar niet alle, van de SDS-oplossing uit de buis en gebruik een wattenstaafje om het gebied van de buis waar de EV-pellet zich bevond grondig af te vegen. NOTITIE: Gebruik niets met borstelharen. Dit protocol maakte gebruik van normale wattenstaafjes; Voor het reinigen van de buizen kunnen echter gespecialiseerde, pluisarme wattenstaafjes worden gebruikt.</li>
	<li>Spoel minimaal 3x af met heet kraanwater (~50 °C). Zorg ervoor dat u de buis volledig vult en decanteert.</li>
	<li>Spoel 1x af met gedemineraliseerd water met behulp van een spuitfles of een wasfles met smalle hals.</li>
	<li>Spoel 1x af met 70% ethanol met behulp van een spuitfles.</li>
	<li>Laat de tube ondersteboven drogen. OPMERKING: Buisrekken voor het sorteren van fluorescentiecellen werken goed voor het drogen van de UC-buizen.</li>
	<li>Doe de volledig gedroogde buisjes in een schone pot; Ze zijn klaar voor hergebruik. LET OP: Momenteel is het protocol gevalideerd voor hergebruik tot 2x.</li>
</ol>2. EV-verrijking
OPMERKING: Het volgende EV-isolatie- en proteomics-protocol werd gebruikt voor zowel de oorspronkelijke weefsel-EV-isolatie als de "nepmonsters" die werden gebruikt om de blanco (nooit gebruikte) en gereinigde buismonsters te verkrijgen. De oorspronkelijke monsters waren geresuspendeerde, in weefsel ingesloten EV's van halsslagaderplaques van patiënten die halsslagader-enderarterectomieën ondergingen. Chirurgische monsters werden verzameld bij het University Health Network (Toronto, Canada) en werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie. Alle patiënten gaven geïnformeerde toestemming voor het verzamelen van monsters en gegevensanalyse, in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De proefmonsters waren pseudo-pellets die werden verkregen door blanco en gereinigde buizen te behandelen met dezelfde oplossingen en verwerkingsstappen als de EV-isolatiemonsters.
<ol><li>Ontdooi EV-monsters of proefmonsters in PBS op ijs.</li>
	<li>Maak een NTE-buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,137 M NaCl pH 7,4) en een steriel filter.</li>
	<li>Draai de monsters gedurende 10 minuten bij 10.000 × g bij 4 °C.</li>
	<li>Verplaats het supernatans in een open buis van polycarbonaat van 1 ml.</li>
	<li>Centrifugeer het supernatans bij 100.000× g gedurende 1 uur bij 4 °C.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 150 μL steriel gefilterde NTE-buffer met proteaseremmer.</li>
	<li>Breng over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en voeg NTE-buffer toe om een totaal monstervolume van 1,5 ml te bereiken.</li>
	<li>Bewaar de monsters op ijs.</li>
</ol>3. Voorbereiding van dichtheidsgradiënten en dichtheidsgradiëntscheiding
OPMERKING: Dit EV-isolatieprotocol is eerder beschreven door Blaser et al.9 In het kort:
<ol><li>Bereid vijf oplossingen van Iodixanol Density Gradient Medium (10%, 15%, 20%, 25% en 30%) met NTE-buffer als verdunningsmiddel.</li>
	<li>Leg de oplossingen met vijf dichtheid achtereenvolgens in afgedekte ultracentrifugebuis(sen) met 30% aan de onderkant en 10% aan de bovenkant.</li>
	<li>Bevestig de doppen op de buis(en) en beweeg ze voorzichtig naar een stabiele horizontale positie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verplaats de buis(en) na 1 uur voorzichtig naar een verticale positie op ijs gedurende 30 minuten om de gradiënt af te koelen.</li>
	<li>Voeg 1,5 ml van het monster of nepmonster (NTE-buffer) toe aan de bovenkant van de voorbereide dichtheidsgradiëntbuis(en).</li>
	<li>Ultracentrifugebuis(sen) bij 250.000 × g gedurende 40 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Verwijder de bovenste fracties van de dichtheidsgradiënt (2,4 ml) naar de niet-afgedekte ultracentrifugebuis(sen). Vul tot 9 ml met steriel gefilterde NTE-buffer.</li>
	<li>Pelleteer de EV's door ultracentrifugeren bij 100.000 × g gedurende 1 uur bij 4 °C. NOTITIE: Omcirkel de locatie van de zichtbare EV-pellet of verwachte locatie met een markering. Hierdoor kunt u het gebied van de pellet direct met het wattenstaafje reinigen.</li>
	<li>Zuig het supernatans op terwijl u de buis gedurende 3 minuten ondersteboven beweegt. Verwijder de resterende druppeltjes met een wattenstaafje voordat u de slang met de goede kant naar boven draait.</li>
	<li>Resuspendeer de EV-pellet in 12 μL lysebuffer in de kit waarnaar wordt verwezen.</li>
</ol>4. Peptidepreparaat voor proteomics
OPMERKING: De voorbereiding van Proteomics-monsters werd uitgevoerd volgens het kitprotocol met interne aanpassingen voor eiwitmonsters met een lage overvloed. Het gewijzigde protocol is als volgt:
<ol><li>Lyseer, denatureer, reduceer en alkylaat de monsters door ze gedurende 10 minuten in lysebuffer bij 95 °C te verwarmen.</li>
	<li>Vergist de monsters met behulp van de Lys-C/trypsine-digestoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C met behulp van 10 μl lyseoplossing uit het monster en 10 μl digestieoplossing.</li>
	<li>Zuiver peptiden door een cartridge door hydrofiele en hydrofobe verontreinigingen uit te wassen en gezuiverde peptiden af te geven met behulp van kitoplossingen.</li>
	<li>Droog de gezuiverde peptiden in een snelheidsvacuüm bij 45 °C gedurende 45 minuten of tot ze droog zijn. OPMERKING: Vermijd overdrogen van de peptiden.</li>
	<li>Bewaar monsters bij -80 °C tot het moment van massaspectrometrie-sequencing.</li>
	<li>Voeg 17 μL LC-load oplossing toe aan de gedroogde peptiden.</li>
	<li>Laat de monsters 1 uur op ijs staan.</li>
	<li>Draai de monsters kort en soneer vervolgens gedurende 5 minuten in een ultrasoon waterbad.</li>
	<li>Centrifugeer de LC-belastingsmonsters bij 16.000 × g gedurende 1 minuut, zuig 15 μl vanaf de bovenkant op en scheid ze in een nieuwe buis.</li>
</ol>5. Vloeistofchromatografie en sequencing van tandem-massaspectrometrie
<ol><li>Injecteer 2 μL LC-load peptide-oplossing op een massaspectrometer.</li>
	<li>Fractioneer de peptiden met behulp van een opstelling met twee kolommen.</li>
	<li>Verwarm de kolom bij een constante temperatuur van 45 °C.</li>
	<li>Voer de analytische gradiënt uit met 300 nL/min van 5% naar 21% Solvent B (acetonitril/0,1% mierenzuur) gedurende 60 minuten, gevolgd door 10 minuten van 21% tot 30% Solvent B en nog eens 10 minuten van een decoupeerzaagwassing van 95%-5%.</li>
	<li>Stel de MS1 in op een resolutie van 120 K (maximale injectietijd, 25 ms), stel de bovenste voorloperionen (binnen een cyclustijd van 3,0 s) in op HCD-isolatiebreedte 1,2 m/z, dynamische uitsluiting ingeschakeld (60 s) en stel de MS2-resolutie in op 60 K (maximale injectietijd, automatisch; genormaliseerde botsingsenergie, 24%, 26% en 28%).</li>
	<li>Stel het acquisitiebereik van MS1 en MS2 in op respectievelijk 400 m/z-1.200 m/z en 120 m/z-1.200 m/z.</li>
</ol>6. Peptide/eiwit identificatie
<ol><li>Doorzoek de verkregen peptidespectra met een proteomische zoeksoftware met behulp van een commercieel zoekalgoritme tegen een menselijke uniProt-database.</li>
	<li>Stel het spijsverteringsenzym in op trypsine en laat maximaal twee gemiste splitsingen toe.</li>
	<li>Stel de voorlopertolerantie in op 10 ppm en het fragmenttolerantievenster op 0,02 Da.</li>
	<li>Stel methionine-oxidatie en N-terminale acetylering in als variabele modificaties en cysteïne-carbamidomethylering als vaste modificatie.</li>
	<li>Filter de peptiden op basis van een false discovery rate (FDR)-drempel van 1,0% zoals berekend door het Percolator-algoritme.</li>
	<li>Beschouw peptiden die aan een bepaalde eiwitgroep zijn toegewezen en die in geen enkele andere eiwitgroep zijn gedetecteerd als uniek en gebruik ze voor verdere analyses.</li>
	<li>Neem slechts minimaal twee unieke peptiden voor elk eiwit op in de analyses.</li>
	<li>Maximaliseer ID's met detectie van voorloperionen.</li>
	<li>Voer chromatografische uitlijning uit met een maximale retentietijdverschuiving van 10 minuten, massatolerantie van 10 ppm en minimaal 5 signaal-ruis.</li>
	<li>Normaliseer de peptideovervloed op basis van de totale hoeveelheid peptiden.</li>
</ol>

Efficiënte recycling van polycarbonaat ultracentrifugebuisjes voor proteomics

<ol><li>van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shedding+light+on+the+cell+biology+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+sample+collection%2C+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2 (1), 20360(2013).</li>
<li>Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+extracellular+vesicles%3A+general+methodologies+and+latest+trends%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends.</a> BioMed Research International. 2018, e854347(2018).</li>
<li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (8), E968-E977 (2016).</li>
<li>Karimi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+analysis+of+the+plasma+extracellular+vesicle+proteome+after+separation+from+lipoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detailed analysis of the plasma extracellular vesicle proteome after separation from lipoproteins.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2873-2886 (2018).</li>
<li>Lischnig, A., Bergqvist, M., Ochiya, T., Lässer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+identifies+proteins+enriched+in+large+and+small+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics identifies proteins enriched in large and small extracellular vesicles.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 21 (9), 100273(2022).</li>
<li>van Herwijnen, M. J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteomic+analysis+of+human+milk-derived+extracellular+vesicles+unveils+a+novel+functional+proteome+distinct+from+other+milk+components%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteomic analysis of human milk-derived extracellular vesicles unveils a novel functional proteome distinct from other milk components.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (11), 3412-3423 (2016).</li>
<li>Blaser, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiomics+of+tissue+extracellular+vesicles+identifies+unique+modulators+of+atherosclerosis+and+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Multiomics of tissue extracellular vesicles identifies unique modulators of atherosclerosis and calcific aortic valve stenosis.</a> Circulation. 148 (8), 661-678 (2023).</li>
<li>Kristensen, K., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+of+cationic+peptides+to+solid+surfaces+of+glass+and+plastic%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adsorption of cationic peptides to solid surfaces of glass and plastic.</a> PLOS ONE. 10 (5), e0122419(2015).</li>
<li>Use and care of centrifuge tubes and bottles. Beckman Coulter. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles">https://www.beckman.com/supplies/tubes-and-bottles</a> (2014).</li>
<li>R&D & Technology Department chemical resistance of polycarbonate products. PALRAM. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf">http://ilgbcatalog.org/wp-content/uploads/2015/02/PC-chemical-resistance.pdf</a> (2015).</li>
<li>Wang, L., Zhang, J., Hou, S., Sun, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+quantifying+polycarbonate+and+polyethylene+terephthalate+microplastics+in+environmental+samples+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology+Letters%22%5BJournal%5D)">A simple method for quantifying polycarbonate and polyethylene terephthalate microplastics in environmental samples by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Environmental Science & Technology Letters. 4 (12), 530-534 (2017).</li>
<li>Schittek, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dermcidin%3A+a+novel+human+antibiotic+peptide+secreted+by+sweat+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dermcidin: a novel human antibiotic peptide secreted by sweat glands.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1133-1137 (2001).</li>
<li>Blaydon, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+CSTA%2C+encoding+Cystatin+A%2C+underlie+exfoliative+ichthyosis+and+reveal+a+role+for+this+protease+inhibitor+in+cell-cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutations in CSTA, encoding Cystatin A, underlie exfoliative ichthyosis and reveal a role for this protease inhibitor in cell-cell adhesion.</a> American Journal of Human Genetics. 89 (4), 564-571 (2011).</li>
<li>Henry, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hornerin+is+a+component+of+the+epidermal+cornified+cell+envelopes%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hornerin is a component of the epidermal cornified cell envelopes.</a> FASEB Journal. 25 (5), 1567-1576 (2011).</li>
<li>Bolling, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generalized+ichthyotic+peeling+skin+syndrome+due+to+FLG2+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Generalized ichthyotic peeling skin syndrome due to FLG2 mutations.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 138 (8), 1881-1884 (2018).</li>
<li>Jin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAMP+molecules+S100A9+and+S100A8+activated+by+IL-17A+and+house-dust+mites+are+increased+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">DAMP molecules S100A9 and S100A8 activated by IL-17A and house-dust mites are increased in atopic dermatitis.</a> Experimental Dermatology. 23 (12), 938-941 (2014).</li>
<li>Gläser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antimicrobial+protein+psoriasin+%28S100A7%29+is+upregulated+in+atopic+dermatitis+and+after+experimental+skin+barrier+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The antimicrobial protein psoriasin (S100A7) is upregulated in atopic dermatitis and after experimental skin barrier disruption.</a> Journal of Investigative Dermatology. 129 (3), 641-649 (2009).</li>
<li>Molhave, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((House+dust+in+seven+Danish+offices%5BTitle%5D)+AND+%22Atmospheric+Environment%22%5BJournal%5D)">House dust in seven Danish offices.</a> Atmospheric Environment. 34, 4767-4779 (1999).</li>
<li>Buschow, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-associated+proteins+in+B-cell+exosomes+and+potential+functional+implications+for+exosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">MHC class II-associated proteins in B-cell exosomes and potential functional implications for exosome biogenesis.</a> Immunology and Cell Biology. 88 (8), 851-856 (2010).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Hier beschrijven en valideren we een protocol voor het reinigen van polycarbonaat UC-buizen voor EV-verrijking en proteomische toepassingen. We toonden de succesvolle verwijdering van resteiwit van het vorige UC-buismonster aan in vergelijking met een gereinigde pseudo-pelletanalyse onder de detectielimiet van dit massaspectrometrie-acquisitieprotocol en toonden de proteomische gelijkenis aan van lege, nooit gebruikte UC-buis in vergelijking met gereinigde UC-buispseudopellets.
Ten eerste, om de onbedoelde adsorptie van eiwit aan de binnenste polycarbonaatwand te voorkomen, werden UC-buizen onmiddellijk ondergedompeld in H2O10. Het met de hand wassen van de polycarbonaat UC-buizen wordt aanbevolen door de fabrikanten11. Andere wasmiddelen, zoals Lisol, moeten met voorzichtigheid worden gebruikt. Het is een gepatenteerd laboratoriumwasmiddel dat bestaat uit een mengsel van wasmiddel, oppervlakteactieve stof en chelaatvormers met een niet-neutrale pH. Daarom werd voor deze stap een wasmiddel dat compatibel is met massaspectrometrie, 0,1% SDS, gebruikt en werd het wassen niet langer dan 10 minuten uitgevoerd11. Onze ervaring is dat het gebruik van borstelreinigingsgereedschap kan leiden tot krassen op de buis als er geen voorzichtigheid wordt betracht. Om mogelijke krassen te verminderen, die een reservoir voor achtergebleven eiwit zouden kunnen vormen, werd een wattenstaafje gebruikt om de binnenkant van de polycarbonaatbuis af te vegen, met de nadruk op het gebied van de vorming van EV-pellets. Herhaald autoclaveren kan de levensduur van de polycarbonaat buis verkorten11; In plaats daarvan werden drie korte spoelingen met heet water uitgevoerd. Er moet ook worden opgemerkt dat, hoewel de fabrikanten niet-thermische sterilisatiemethoden voorstellen, een specifieke temperatuur die moet worden vermeden niet wordt beschreven. Buizen moeten altijd worden geïnspecteerd op tekenen van vervorming of barsten voordat ze opnieuw worden gebruikt, volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Ontvlambare stoffen worden niet aanbevolen om te worden gebruikt in de buurt van werkende centrifuges; Zo drogen we de buizen 's nachts na de laatste spoelstap van 70% ethanol.
Er werd geen significante polymeerverontreiniging waargenomen bij handmatige beoordeling van chromatogrammen. SDS zal naar verwachting polycarbonaat niet aantasten en korte blootstelling aan heet water (<60 °C) heeft geen effect, terwijl langere blootstelling dat wel doet12. Verder hebben eerdere studies aangetoond dat polycarbonaatsoorten elueren op een retentiemoment voorafgaand aan het verzamelen op basis van onze acetonitrilgradiënt13. Hoewel we er niet zeker van kunnen zijn dat er geen polymeren aanwezig zijn, zijn we er met onze acquisitiemethoden van overtuigd dat het proteoom niet substantieel wordt beïnvloed.
Bij het hergebruiken van laboratoriummateriaal voor labelvrije proteomics-experimenten moet specifiek rekening worden gehouden met resterende eiwitcontaminanten van het vorige gebruik. Verder worden EV-proteomics vaak uitgevoerd met monsters met een zeer lage opbrengst, wat soms eiwithoeveelheden oplevert in het bereik van <100 ng. Deze hoeveelheden starteiwit zijn geschikt voor massaspectrometrie, maar verhogen aanzienlijk de impact die zelfs kleine hoeveelheden resteiwit zullen hebben op het algehele proteoom. Gezien de gevoeligheid van voortschrijdende massaspectrometrie-sequencing, zullen contaminanten van menselijke behandeling en productie worden geïdentificeerd. In dit protocol laten we een substantiële vermindering van het aantal geïdentificeerde eiwitten zien met 98% na reiniging. De overige eiwitten werden bijna uitsluitend gedeeld tussen de lege, nooit gebruikte buisjes en de schone buisjes. Deze resultaten suggereren dat de geïdentificeerde eiwitten contaminanten waren van het proteomics-preparaat zelf of restelementen van de buisproductie, niet overgedragen van het vorige gebruik. Verreweg de drie meest voorkomende geïdentificeerde eiwitten in ordes van grootte in de lege en gereinigde buizen waren humaan keratine type I (KRT1, KRT10, KRT9), aangetroffen in haar en huid, algemeen erkend in dit soort preparaten als verontreinigingen van menselijke behandeling (https://www.thegpm.org/crap/). Negen van de gedeelde 18 eiwitten waren andere keratines. Ook opgenomen als een erkende menselijke verontreiniging is dermcidin (DCD), een eiwit dat wordt aangetroffen in menselijk zweet14. Andere geïdentificeerde eiwitten worden ook aangetroffen in de epidermis (CSTA15, HRNR16, FLG217) of eerder geïdentificeerd in huisstofmijt (S100A7, S100A8, S100A9)18,19. Opgemerkt moet worden dat een substantieel bestanddeel van "stof" de menselijke huid is20. De twee unieke eiwitten die in de gereinigde buisjes zijn geïdentificeerd, zijn beide betrokken bij EV's, maar zijn zeer klein in vergelijking met andere geïdentificeerde EV-eiwitten 1,21. De eiwitten die in de monsters zijn geïdentificeerd, komen overeen met het preparaat en duiden op een zeer duidelijke overlap tussen lege en gereinigde buisjes, wat hergebruik ondersteunt.
EV's spelen een belangrijke rol in biologische processen, inclusief maar niet beperkt tot cel-cel communicatie en de vorming van biologische mineralisatie. EV's zijn alomtegenwoordig in het menselijk lichaam en zijn een snelgroeiend gebied van de basiswetenschap vanwege hun potentieel als biomarkers, therapieën en bronnen van informatie over (patho)fysiologie. Voor het verrijken van deze deeltjes voor experimenten met behulp van differentiële UC zijn gespecialiseerde buizen van polycarbonaat nodig. Eenmalig gebruik en verwijdering van deze thermoplasten dragen bij aan hogere kosten voor experimentele verbruiksartikelen en de wereldwijde last van plasticvervuiling. Hierin presenteerden en valideerden we een protocol voor het reinigen en hergebruiken van polycarbonaat UC-buizen om EV-isolatie uit te voeren die geschikt is voor proteomics-experimenten. Uiteindelijk zal dit het afval dat door EV-laboratoria wordt geproduceerd verminderen en de kosten van dergelijke experimenten verlagen.

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn lipide-dubbellaag-gescheiden deeltjes die vrijkomen uit cellen die biologisch actieve lading vervoeren, zoals eiwitten, en deelnemen aan verschillende biologische processen, waaronder cel-celcommunicatie en de vorming van biologische mineralisatie1. Deze deeltjes worden aangetroffen in alle lichaamsvloeistoffen en weefsels, en hun biologische activiteiten en toepassingen zijn een snel evoluerend gebied van wetenschappelijk onderzoek. Isolatie en validatie van deze nanodeeltjes brengen verschillende uitdagingen met zich mee vanwege hun kleine formaat en bio-gelijkenis met andere deeltjes, zoals liposomen en eiwitaggregaten. De meest recente richtlijnen van de International Society of Extracellular Vesicles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), zijn de erkende standaard voor wetenschappelijk onderzoek naar EV2.
Er moeten verschillende methoden worden gebruikt, vaak in tandem, voor EV-isolatie, afhankelijk van de stroomopwaartse bron en de stroomafwaartse toepassingen. Vanaf 2015 was differentiële ultracentrifugatie (UC)2 de meest gebruikte primaire isolatiemethode voor EV's. In principe scheidt de eerste centrifugatie met een lagere snelheid grotere of dichtere ongewenste componenten, zoals cellen en celresten, waardoor EV's in de bovenliggende ruimte blijven. Vervolgens gebruikt UC een zeer hoge middelpuntvliedende kracht om EV's uit te pelleteren en zo te scheiden en te zuiveren van andere deeltjes die kleiner of minder dicht zijn, maar die ook dichte niet-EV-deeltjes kunnen bevatten. De meeste protocollen zullen vaak, bij een of andere stap, UC gebruiken om EV's te isoleren van een vloeistof3. Verder wordt UC gebruikt in andere methoden van EV-isolatie, zoals dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie (DGUC), waarbij media zoals OptiprepTM jodixanol en middelpuntvliedende kracht worden gebruikt om EV's te scheiden op basis van hun opwaartse dichtheid4. Er bestaan andere methoden voor EV-isolatie3.
Gezien het snel evoluerende begrip van de biologische processen die worden gedicteerd door EV's en hun potentieel als biomarkers en informatie over pathofysiologie, hebben op ontdekkingen gebaseerde analyses zoals proteomics aan populariteit gewonnen 5,6,7,8. EV's zijn klein en hebben, afhankelijk van de bron, een lage eiwitopbrengst (<1 μg) in vergelijking met heel weefsel of cellysaat. Isolatie van EV's voor proteomics-analyse vereist speciale overwegingen, zoals het verwijderen van niet-EV-eiwitverontreinigingen uit stroomopwaartse vloeistof of weefsel, het overwegen van EV-eiwitafbraak tijdens het isolatieproces en het gebruik van methoden die eiwitoplossingen creëren die chemisch compatibel zijn met peptidepreparaat en massaspectrometrieanalyses.
Verbruiksartikelen voor onderzoekslaboratoria zijn vaak plastic en wegwerpartikelen van aard. Deze materialen voor eenmalig gebruik dragen bij aan de wereldwijde plasticvervuilingscrisis en de kosten van verbruiksartikelen. Gespecialiseerde UC-buizen van polycarbonaat en polystyreen zijn ontworpen om de hoge centrifugale krachten te weerstaan die nodig zijn om EV's in laboratoriumtoepassingen te pelletiseren. Hoewel het mogelijk is om UC-buizen te steriliseren en te desinfecteren voor hergebruik, vereist proteomische analyse, vooral die met een lage eiwitopbrengst zoals EV's, speciale aandacht. Niet alleen is voldoende verwijdering van resteiwit van het vorige gebruik van het grootste belang, ook moet worden gekeken naar chemische compatibiliteit met massaspectroscopie en plastic-afgeleide polymeercontaminatie.
Hier presenteren we een reinigingsprotocol van polycarbonaatbuizen met behulp van reinigingsmiddelen die geschikt zijn voor massaspectrometrie en voeren we experimenten uit om de succesvolle verwijdering van resterend eiwit onder de detectielimieten en het ontbreken van detecteerbare polymeerverontreinigingen te valideren. Om het reinigingsprotocol voor EV proteomische toepassingen te valideren met behulp van zowel UC- als DGUC-doeleinden, hebben we buisjes verkregen uit isolaties van menselijk vaatweefsel-EV's met een gecombineerd UC- en DGUC-protocol. Buizen werden gereinigd met behulp van het beschreven protocol en het experimentele proces werd herhaald zonder monsters waarbij een lege, nooit gebruikte UC-buis werd vergeleken met een gereinigde UC-buis. Uiteindelijk zal de validatie van een UC-buisreinigingsprotocol dat geschikt is voor de verrijking van EV's het afval dat door EV-laboratoria wordt geproduceerd, verminderen en de kosten in verband met dergelijke experimenten verlagen.

<table><tbody><tr><td>10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355630</td><td>uncapped ultracentrifuge tube(s)&nbsp;</td></tr><tr><td>10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>355603</td><td>capped ultracentrifuge tube(s)&nbsp;</td></tr><tr><td>an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 &micro;m x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 &micro;m x 250 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>164946 and ES902</td><td>Dual column setup</td></tr><tr><td>Critical Swab Swab, Cotton Head</td><td>VWR</td><td>89031-270</td><td>cotton swab</td></tr><tr><td>Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. &nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BRE725533</td><td>Mass spectrometer</td></tr><tr><td>Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Human database</td></tr><tr><td>MilliQ water</td><td></td><td></td><td>water</td></tr><tr><td>PreOmics iST kit &nbsp;</td><td>PreOmics</td><td>P.O.00027</td><td>commercial protein sample preparation kit&nbsp;</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer &nbsp;package (PD, Version 2.5)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>Proteomic search software</td></tr><tr><td>SEQUEST-HT search algorithm&nbsp;</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Search algorithm</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (20%)</td><td>Boston BioProducts</td><td>BM-230</td><td>detergent</td></tr></tbody></table>

hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuis in proteomische analyses van extracellulaire blaasjes

Polycarbonate Ultracentrifuge Tube Re-Use in Proteomic Analyses of Extracellular Vesicles

Laboratoriumplastics voor eenmalig gebruik verergeren de vervuilingscrisis en dragen bij aan de kosten van verbruiksartikelen. Bij isolatie van extracellulaire blaasjes (EV) worden polycarbonaat ultracentrifuge (UC) buizen gebruikt om de bijbehorende hoge centrifugale krachten te doorstaan. EV proteomics is een voortschrijdend vakgebied en gevalideerde protocollen voor hergebruik van deze buizen ontbreken. Het hergebruik van verbruiksartikelen voor eiwitisolatieprotocollen met een laag rendement en downstream proteomics vereist compatibiliteit van reagentia met massaspectroscopie-acquisities, zoals de afwezigheid van van centrifugebuis-afgeleide synthetische polymeerverontreiniging en voldoende verwijdering van resterende eiwitten.
Dit protocol beschrijft en valideert een methode voor het reinigen van polycarbonaat UC-buizen voor hergebruik in EV-proteomics-experimenten. Het reinigingsproces omvat onmiddellijke onderdompeling van UC-buizen in H2O om uitdroging van eiwitten te voorkomen, wassen in 0,1% natriumdodecylsulfaat (SDS) wasmiddel, spoelen in heet kraanwater, gedemineraliseerd water en 70% ethanol. Om het protocol voor hergebruik van UC-buizen voor downstream EV-proteomics te valideren, werden gebruikte buizen verkregen na een experiment waarbij EV's werden geïsoleerd uit cardiovasculair weefsel met behulp van differentiële UC- en dichtheidsgradiëntscheiding. Buizen werden gereinigd en het experimentele proces werd herhaald zonder EV-monsters, waarbij lege, nooit gebruikte UC-buizen werden vergeleken met gereinigde UC-buizen. De pseudo-EV-pellets die uit de isolatieprocedures werden verkregen, werden gelyseerd en voorbereid voor vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie met behulp van een in de handel verkrijgbare voorbereidingskit voor eiwitmonsters met aanpassingen voor eiwitmonsters met een lage abundantie.
Na reiniging was het aantal geïdentificeerde eiwitten in de pseudo-pellet met 98% verminderd ten opzichte van het vorige EV-isolatiemonster uit dezelfde buis. Bij vergelijking van een gereinigde buis met een lege buis, bevatten beide monsters een zeer klein aantal eiwitten (≤20) met 86% gelijkenis. De afwezigheid van polymeerpieken in de chromatogrammen van de gereinigde buizen werd bevestigd. Uiteindelijk zal de validatie van een UC-protocol voor het reinigen van buizen dat geschikt is voor de verrijking van EV's het afval dat door EV-laboratoria wordt geproduceerd, verminderen en de experimentele kosten verlagen.

Om het reinigingsprotocol te valideren (Figuur 1) werden twee experimenten uitgevoerd. Eerst werd het proteoom van het "nepmonster" van de gereinigde buis vergeleken met het proteoom van het weefsel-EV-monster van het eerste gebruik van de buis om de overdracht van geïdentificeerde eiwitten te bepalen. Representatieve chromatogrammen tonen een vermindering van de piekheterogeniteit na reiniging van de buizen (figuur 2). In de oorspronkelijke EV-isolatie werden 806 eiwitten geïdentificeerd met twee of meer unieke peptiden. Na reiniging werd het aantal geïdentificeerde eiwitten met 98% teruggebracht tot 19 eiwitten. In beide werden twaalf eiwitten gedeeld en zeven eiwitten waren uniek voor de gereinigde buis (Figuur 3A). Aan de hand van een literatuurstudie is een lijst van karakteristieke EV-eiwitten samengesteld, zoals eerder gepubliceerd9. Van de 24 vermelde karakteristieke EV-eiwitten die in het oorspronkelijke monster werden geïdentificeerd, werd er slechts één geïdentificeerd na reiniging (tabel 1). Van de gedeelde eiwitten, MFGE8, was een karakteristiek EV-eiwit het meest differentieel verrijkte eiwit in het EV-monster. Ter vergelijking: twee contaminerende eiwitten, KRT14 en KRT5, waren het meest differentieel verrijkt in het nagereinigde monster (Figuur 3B).
Om de verwijdering van eiwit uit de buizen na het wassen te bevestigen, werd een SDS-PAGE-gel uitgevoerd met een BSA-standaardcurve van 1 μg (typisch laag einde van EV-isolatierendement) tot 16,5 ng, en vervolgens lege en gereinigde buis "nep" EV-pellets in drievoud. Alle standaard curvebanden waren zichtbaar, maar de monsters waren dat niet, wat wijst op reinigingsverwijdering van ten minste 98% van het eiwit en geen waarneembaar verschil tussen de lege en de gereinigde buis (Figuur 4A). Om de specifieke eiwitten die in de gereinigde buisjes werden geïdentificeerd verder te beoordelen in vergelijking met een lege, nooit gebruikte buis, werd een directe vergelijking uitgevoerd (N = 4, groep). De chromatogrammen van de blanco en gereinigde buizen leken sterk op elkaar (figuur 4B). In de lege, nooit gebruikte buisjes werden 19 eiwitten geïdentificeerd. Evenzo werden in de gereinigde buis 20 eiwitten geïdentificeerd, waarvan er 18 binnen de twee groepen werden gedeeld (Figuur 4C). Als we alle eiwitten rangschikken op basis van hun overvloed, zijn de verontreinigende keratine-eiwitten KRT1, KRT9 en KRT10 het meest voorkomend in beide groepen (Figuur 4D). In de gereinigde buis werd één karakteristiek EV-eiwit geïdentificeerd: lactadherine (MFGE8). Er was een grote overeenkomst tussen de schone en lege buizen in het aantal getriggerde MS2-sequencinggebeurtenissen bij elke retentietijdbin van 5 minuten (Figuur 4E), het aantal peptiden waarvan de sequentie werd bepaald en de betrouwbaarheid waarmee ze werden gesequenced (Figuur 4F), evenals een grote overlap tussen de peptiden (Figuur 4G). Alles bij elkaar geven deze resultaten geen waarneembare impact aan van hergebruik van buizen met dit reinigingsprotocol op het proteoom.
Het monomeer van polycarbonaat is 254,3 MH1+, wat onder het MS1-acquisitiebereik ligt. Chromatogrammen werden beoordeeld op de aanwezigheid van enkelvoudig geladen dimeren en trimeren, die niet werden gedetecteerd (gegevens niet getoond, N = 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van het protocol voor het reinigen van ultracentrifugebuizen van polycarbonaat. Afkortingen: UC = ultracentrifuge; SDS = natriumdodecylsulfaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig02.jpg"> Figuur 2: Representatieve vergelijking van het vorige EV-monsterproteoom met het "nepmonster" uit de gereinigde buis (N = 2). Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; TIC-MS = totale ionenchromatografie-massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig03v2.jpg"> Figuur 3: Vergelijking van eiwitten die in het EV-monster zijn geïdentificeerd met het "nep"-monster verkregen uit de gereinigde buisjes. (A) Eiwitidentificaties van het venndiagram in het vorige proteoom van het EV-monster met het "nepmonster" van de gereinigde buis (N = 2). (B) Differentiële verrijking van gedeelde eiwitten gerangschikt door log 2-voudige verandering. Afkorting: EV = extracellulair blaasje, FC = vouwwissel <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig03largev2.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66126/66126fig04.jpg"> Figuur 4: Vergelijking van lege, nooit gebruikte buizen met gereinigde buizen. (A) Een SDS-PAGE-gel werd uitgevoerd met een BSA-standaardcurve van 1 μg tot 16,5 ng, en vervolgens lege en gereinigde buis "nep" EV-pellets in drievoud. (B) Representatieve chromatogrammen voor blanco en gereinigde buizen. (C) Venndiagram van de gedeelde of unieke eiwitten uit lege en gereinigde buisjes (N = 4). (D) Alle eiwitten die in elke groep zijn geïdentificeerd, gerangschikt op basis van overvloed voor (i) lege en (ii) gereinigde buizen. Mediaanwaarden worden uitgezet. (E) Histogram van alle getriggerde MS2-gebeurtenissen op basis van retentietijd opgeteld per groep (N = 4). (F) Aantal peptide-ID's in elke groep op basis van betrouwbaarheid, waarbij peptiden met hoge betrouwbaarheid verschillen van peptiden binnen de groep, waarbij de identificatiebetrouwbaarheid lager is maar wordt versterkt door afstemming op andere spectra, gemiddelde/SD. (G) Aantal unieke en gedeelde peptiden tussen groepen. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; TIC-MS = totale ionenchromatografie-massaspectrometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/66126fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Karakteristieke EV-eiwitten gevonden in pre versus post UC buisreinigingsanalyse. Afkortingen: UC = ultracentrifuge; EV = extracellulair blaasje. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66126/Table%201.zip" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>

Er wordt een gedetailleerd protocol opgesteld voor het reinigen en hergebruiken van ultracentrifugebuisjes van polycarbonaat om extracellulaire blaasjesisolatie uit te voeren die geschikt is voor proteomics-experimenten.

Hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuis in proteomische analyses van extracellulaire blaasjes

Single-use laboratory plastics exacerbate the pollution crisis and contribute to consumable costs. In extracellular vesicle (EV) isolation, polycarbonate ...

We bestuderen hart- en vaatziekten, met name de rol van extracellulaire blaasjes bij de pathologische verkalking van cardiovasculaire weefsels, zoals kleppen en bloedvaten. Onderzoekers in onze groep hebben onlangs methoden gedefinieerd om weefsel en gevangen extracellulaire blaasjes uit fibro-verkalkt cardiovasculair weefsel te extraheren om hun proteomische profiel te bepalen. Onze groep heeft aangetoond dat deze extracellulaire blaasjes een belangrijke eiwitlading bevatten voor het initiëren van verkalking in ziekteweefsels.De gespecialiseerde buizen die worden gebruikt in de ultracentrifugatiestap van extracellulaire blaasjesisolatie kunnen worden gereinigd en gesteriliseerd voor hergebruik. Proteomische analyse vereist echter speciale aandacht, aangezien elke verontreiniging de stroomafwaartse resultaten sterk kan beïnvloeden. Hier valideren we een protocol voor het hergebruik van verbruiksartikelen, met name polycarbonaat ultracentrifugebuisjes voor extracellulaire blaasjesisolatie die geschikt zijn voor stroomafwaartse low-input proteomics-toepassingen.Ons protocol is eenvoudig en effectief, en het stelt onderzoekers in staat om zowel de verbruikskosten als het afval dat doorgaans met deze isolatieprotocollen wordt geassocieerd, te verminderen.

polycarbonate-ultracentrifuge-tube-re-use-proteomic-analyses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een protocol voor de extractie van het vertalen van ribosomen van eukaryotische cellen. Eenmaal uitgepakt, worden ribosomen gescheiden in monosomes en polyribosomes door sucrose gradiënt fractionering om verschillende ribosomale populaties te analyseren. Als zodanig is deze methode is de gouden standaard voor de behandeling van de regulering van de vertaling.

Eukaryotische Polyribosome Profiel Analyse

This video describes the technique of extracting extracellular vesicles from fresh or frozen tissues. The isolated extracellular vesicles can be used for further analysis to uncover their significant roles in disease pathogenesis.

Extracellular Vesicle Extraction: A Technique to Isolate Extracellular Vesicles from Whole Tissue Specimens Using Differential Centrifugation

This video demonstrates the density gradient ultracentrifugation-based purification method to isolate subpopulations of extracellular vesicles suitable for characterization studies.

Purification of Subpopulations of Extracellular Vesicles: A Technique to Purify Subpopulations of Extracellular Vesicles Using Density Gradient Ultracentrifugation

This video demonstrates the size exclusion chromatography (SEC) technique for purifying bacterial extracellular vesicles (EVs) from the culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). The technique utilizes a porous resin-packed column to obtain purified fractions of EVs. The porous particles selectively allow smaller proteins to enter the pores, resulting in slower elution. At the same time, EVs are excluded from entering the pores due to their larger size and are eluted first.

A Size Exclusion Chromatography Technique to Purify Mycobacterial Extracellular Vesicles

Hier presenteren we een protocol om te zuiveren van exosomes van plasma en serum met verminderde CO zuivering van niet-exosomal bloedeiwitten. Het geoptimaliseerde protocol bevat ultrafiltratie, protease behandeling en grootte uitsluiting chromatografie. Verbeterde zuivering van exosomes voordelen downstream analyses, met inbegrip van nauwkeuriger kwantificering van blaasjes en proteomic karakterisering.

Vertering van eiwitten, ultrafiltratie en Size Exclusion Chromatography voor het optimaliseren van het isolement van Exosomes uit menselijk bloed Plasma en Serum

Het protocol wordt een reproduceerbare methode ontworpen voor gebruik met cel cultuur supernatant voor het opsporen van oppervlakte epitopes op kleine extracellulaire blaasjes (EV) beschreven. Het maakt gebruik van specifieke EV immunoprecipitation met parels in combinatie met de antilichamen die surface antigeen CD9 herkent, CD63, en CD81. De methode is geoptimaliseerd voor downstream stroom cytometry analyse.

Cytometrische analyse van extracellulaire blaasjes van cel-geconditioneerd Media stromen

Hier bieden we een gedetailleerd protocol om te isoleren van kleine extracellulaire blaasjes (EVs) hele weefsel, met inbegrip van hersenen en tumor exemplaren. Deze methode biedt een reproduceerbare techniek om EVs extract van solide weefsel voor verder stroomafwaarts analyses.

Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Hier presenteren we een gemakkelijk toepasbare protocol om de opslag stabiliteit van de extracellulaire blaasjes te beoordelen, een groep van nature voorkomende nanodeeltjes geproduceerd door cellen. De blaasjes worden geladen met glucuronidase als model enzym en in verschillende omstandigheden opgeslagen. Na opslag worden de fysisch-chemische parameters en de activiteit van het ingekapseld enzym geëvalueerd.

Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Dit protocol isoleert extracellulaire blaasjes (Ev's) uit de buurt van virionen met hoge efficiëntie en opbrengst door het opnemen van EV-neerslag, dichtheidsgradiënt ultracentrifugatie en deeltjes opname om een gestroomlijnde workflow en een reductie van start volume vereisten, resulterend in reproduceerbare preparaten voor gebruik in alle EV-onderzoek.

Zuivering van extracellulaire vesikel preparaten met hoge opbrengst uit de buurt van het virus

Het huidige protocol biedt gedetailleerde beschrijvingen voor isolatie, concentratie en karakterisering van extracellulaire blaasjes uit cyanobacteriële culturen. Benaderingen voor het zuiveren van blaasjes uit culturen op verschillende schalen, afwegingen tussen methodologieën en overwegingen voor het werken met veldmonsters worden ook besproken.

Isolatie en karakterisering van cyanobacteriële extracellulaire blaasjes

Leer een protocol voor het hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuizen bij de isolatie van extracellulaire blaasjes voor proteomische analyses. Deze methode vermindert afval en kosten in cardiovasculair onderzoek.

Hergebruik van polycarbonaat ultracentrifugebuis in proteomische analyses van extracellulaire blaasjes

Meer video's verkennen