Kwantitatieve analyse van mitochondriën-geassocieerde endoplasmatisch reticulummembraan (MAM) stabilisatie in een neuraal model van de ziekte van Alzheimer (AD)

We proberen de stabiliteit van mitochondriën-geassocieerde ER-membranen van verschillende diktes of spleetbreedtes kwantitatief te meten, wat belangrijk is bij het reguleren van de pathofysiologie van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder AD. Recente studies naar mitochondriën-geassocieerde ER-membranen, vaak MAM's genoemd, hebben ze beschreven als een van de belangrijkste factoren bij het initiëren van amyloïde pathologie in het vroege stadium van AD. De bevindingen leidden tot de ontwikkeling van een nieuwe hypothese, de MAM-hypothese, die suggereert dat AD uitsluitend een MAM-gerelateerde ziekte is.

Ons protocol is het eerste dat een kwantitatief hulpmiddel biedt om MAM-stabilisatie in levende cellen te meten, wat tot nu toe een uitdaging is gebleven. Het grootste voordeel van ons protocol is dat het de intrinsieke dynamische eigenschap van mitochondriën gebruikt om de veranderingen in MAM-stabilisatie kwantitatief te meten bij het aan- of losmaken van MAM-spleetbreedtes in levende cellen.

Onze focus in de nabije toekomst is het verbeteren en toepassen van onze state-of-the-art live cell imaging en kymografische techniek om een reeks door de FDA goedgekeurde synthetische of natuurlijke kleine molecuulmodulatoren van MAM's of MAM-gebonden sigma één receptor te screenen, met behulp van een recent ontwikkeld AD-screeningplatform voor geneesmiddelen en hun werkingsmechanisme te begrijpen.

[Verteller] Om de cellen te transfecteren met MAM-stabilisatoren, vervangt u het mononucleaire beenmergmengsel door twee milliliter DMEM-F12-medium op kamertemperatuur in elk putje. Combineer nucleofectorreagens met supplement één in een verhouding van 4,5 op één. Voeg 100 microliter van het nucleofectorreagens toe aan het mengsel. Draai vervolgens de DNA-oplossing. Voeg één tot vijf microgram DNA per behandeling toe aan afzonderlijke microcentrifugebuizen van één milliliter voor elke transfectie. Na het opzuigen van de bestaande media uit de cellen, wast u de cellen eenmaal met 10 milliliter PBS. Zuig de PBS op en voeg een milliliter accutase rechtstreeks toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende vijf tot 10 minuten bij 37 graden Celsius. Tik vervolgens zachtjes op de zijkant van de schaal om de cellen los te maken. Controleer onder een microscoop of de cellen loskomen en vrij stromen. Neutraliseer de acutanten met 10 milliliter DMEM-F12 medium en breng de celsuspensie over in een schone buis van 15 milliliter. Neem vervolgens 10 microliter van de zwevende cellen en voeg ze toe aan kant A van een celtelkamer. Steek vervolgens zijde A van de gevulde kamer in de hoofdgleuf aan de voorkant van de cellenteller. Druk op meten en noteer het aantal cellen per milliliter. Centrifugeer het vereiste aantal cellen bij 300 G gedurende vijf minuten. Zuig vervolgens het bovenstaande voorzichtig op en resureer de pellet in 100 microliter nucleofectormengsel voor elke elektroporatie. Voeg vervolgens 100 microliter van de geresuspendeerde celsuspensie toe aan een van de buisjes met DNA. Meng door de oplossing meerdere keren te pipetteren. Breng vervolgens het DNA-celmengsel over in een elektroporatiecuvet en sluit het af met het meegeleverde deksel. Selecteer het juiste nucleofectorprogramma op het apparaat. Voeg onmiddellijk ongeveer 500 microliter DMEM van een voorgevulde plaat met zes putjes toe aan de cuvet met behulp van steriele pipetten. Meng één keer voorzichtig en breng de geëlektropoleerde cellen en het medium over naar het bijbehorende putje. Plaats om te beginnen de plaat met zes putjes met cellen in de microscoopkamer en pas de focus van de microscoop aan totdat de cellen zichtbaar worden. Om het rode fluorescerende eiwitsignaal op te vangen, exciteert u de fluorofoor met behulp van een laser van 594 nanometer en stelt u de emissie in op 570 tot 640 nanometer. Gebruik voor groen fluorescerend eiwit een laser van 488 nanometer voor excitatie met een emissie van 510 tot 540 nanometer. Snijd het scangebied bij zodat het rond het axon past. Een kleiner scangebied verkort de verwerkingstijd en vereenvoudigt het genereren van kymografie. Stel het interval in op één frame per seconde en de totale duur op 181 seconden. Klik op uitvoeren om het proces te starten. De axonale snelheid van MAM 1X gelabelde ER-gebonden mitochondriën werd met 50% verminderd in vergelijking met vrije en MAM 9X-gebonden mitochondriën. 26,6% van de MAM 1X mitochondriën waren mobiel versus 53,82% van de vrije mitochondriën en 44,79% van de MAM 9X mitochondriën. Retrograde beweging was lager voor MAM 1X mitochondriën dan Mito-RFP mitochondriën en MAM 9X mitochondriën. Anterograde beweging van MAM 1X mitochondriën was ook verminderd ten opzichte van Mito-RFP. Het stationaire percentage MAM 1X mitochondriën was significant hoger dan MAM 9X mitochondriën, wat een vermindering van de beweeglijkheid weerspiegelt, terwijl de totale snelheid van MAM 1X mitochondriën significant lager was dan MAM 9X mitochondriën.