Name: Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-19T14:05:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer calciumbeeldvorming in virusgeïnfecteerde menselijke darmorganoïden met genetisch gecodeerde calciumindicatoren. Deze methode onderzoekt hoe rotavirus signalering in het darmslijmvlies verstoort.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies R01DK115507 en R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) van de National Institutes of Health (NIH). Ondersteuning voor stagiairs werd geboden door NIH-beurzen F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F.J. Scribano) en F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). We willen het Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core bedanken voor het leveren van de organoïde onderhoudsmedia.

Calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke intestinale organoïde monolagen

<ol><li>Bootman, M. D., Bultynck, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+cellular+calcium+signaling%3A+A+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Danese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+as+a+result+of+calcium+signaling+modulation%3A+A+cancer-centric+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061(2021).</li>
<li>Harr, M. W., Distelhorst, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+and+autophagy%3A+Decoding+calcium+signals+that+mediate+life+or+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579(2010).</li>
<li>Barak, P., Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+Ca2%2B+microdomains+from+store-operated+CRAC+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097(2020).</li>
<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+signal-to-noise+Ca%282%2B%29+probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).</li>
<li>Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GCaMP%2C+a+family+of+single-fluorophore+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22J+Evol+Biochem+Phys%22%5BJournal%5D)">GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators.</a> J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).</li>
<li>Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+fluorescent+indicators+for+organellar+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging.</a> Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).</li>
<li>Nászai, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+stem+cells%3A+Got+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Intestinal stem cells: Got calcium.</a> Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).</li>
<li>Barrett, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+chloride+secretion+in+the+intestinal+epithelium%3A+Significance+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Membr%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation.</a> Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-sensing+receptor+regulates+intestinal+dipeptide+absorption+via+Ca2%2B+signaling+and+IKCa+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rep%22%5BJournal%5D)">Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation.</a> Physiol Rep. 8 (1), e14337(2020).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CRISPR%E2%80%93Cas9-mediated+genetic+knockout+human+intestinal+tissue%E2%80%93derived+enteroid+lines+by+lentivirus+transduction+and+single-cell+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning.</a> Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).</li>
<li>Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+to+dissect+gastrointestinal+virus-host+interactions%3A+What+have+we+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned.</a> Viruses. 13 (6), 999(2021).</li>
<li>Lambert, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FPbase%3A+a+community-editable+fluorescent+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">FPbase: a community-editable fluorescent protein database.</a> Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).</li>
<li>Lai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calcium-triggered+secretion+by+hydrocarbon-stapled+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides.</a> Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+induces+intercellular+calcium+waves+through+ADP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling.</a> Science. 370 (6519), eabc3621(2020).</li>
<li>Lee, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoctamin+1%2FTMEM16A+controls+intestinal+Cl%E2%88%92+secretion+induced+by+carbachol+and+cholera+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin.</a> Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).</li>
<li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+TMEM16A+control+luminal+chloride+secretion+in+a+NHERF1+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner.</a> Biochem Biophys Rep. 25, 100912(2021).</li>
<li>Mroz, M. S., Keely, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+chronically+upregulates+Ca2%2B-dependent+Cl%E2%88%92+conductance+and+TMEM16A+expression+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells.</a> J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).</li>
<li>Sui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+role+of+Ca2%2B-activated+Cl%E2%88%92+channel+transmembrane+member+16A+in+lipopolysaccharide-induced+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro.</a> Cell Death Dis. 11 (5), 404(2020).</li>
<li>Bellono, N. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterochromaffin+cells+are+gut+chemosensors+that+couple+to+sensory+neural+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways.</a> Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).</li>
<li>Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junctions+as+a+key+for+pathogens+invasion+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (5), 2506(2021).</li>
<li>Samak, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium%2FAsk1%2FMKK7%2FJNK2%2Fc-Src+signalling+cascade+mediates+disruption+of+intestinal+epithelial+tight+junctions+by+dextran+sulfate+sodium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium.</a> Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).</li>
<li>Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+integration+by+Ca2%2B+regulates+intestinal+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity.</a> Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).</li>
<li>Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+host+cell+calcium+signaling+during+viral+infections%3A+Emerging+paradigm+with+high+clinical+relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance.</a> Mol Aspects Med. 81, 101004(2021).</li>
<li>Chang-Graham, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+calcium+dysregulation+manifests+as+dynamic+calcium+signaling+in+the+cytoplasm+and+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum.</a> Sci Rep. 9 (1), 10822(2019).</li>
<li>Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+disrupts+calcium+homeostasis+by+NSP4+viroporin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity.</a> mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).</li>
<li>Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rotavirus+NSP4+viroporin+domain+is+a+calcium-conducting+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel.</a> Sci Rep. 7, 43487(2017).</li>
<li>Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+hijacked+through+viroporin-activated+calcium%2Fcalmodulin-dependent+kinase+kinase-%CE%B2+signaling+is+required+for+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).</li>
<li>Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPII+vesicle+transport+is+required+for+Rotavirus+NSP4+interaction+with+the+autophagy+protein+LC3+II+and+trafficking+to+viroplasms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms.</a> J Virol. 94 (1), e01341(2019).</li>
<li>Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+calcium+on+the+early+steps+of+Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection.</a> Virology. 295 (1), 190-200 (2002).</li>
<li>Hyser, J. M., Estes, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+calcium-conducting+viroporins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Virol%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins.</a> Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).</li>
<li>Strtak, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovirus+NS1-2+has+viroporin+activity+that+induces+aberrant+cellular+calcium+signaling+to+facilitate+virus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication.</a> mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).</li>
<li>In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colonoid+monolayers+to+study+interactions+between+pathogens%2C+commensals%2C+and+host+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium.</a> J Vis Exp. (146), 59357(2019).</li>
<li>Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomaterials+for+intestinal+organoid+technology+and+personalized+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling.</a> Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).</li>
<li>Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarized+rotavirus+entry+and+release+from+differentiated+small+intestinal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells.</a> Virology. 499, 65-71 (2016).</li>
<li>Mirabelli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Norovirus+efficiently+replicates+in+differentiated+3D-human+intestinal+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids.</a> J Virol. 96 (22), e0085522(2022).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> Bioessays. 39 (8), 28749075(2017).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+NEMO+as+calcium+indicators+with+large+dynamics+and+high+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity.</a> Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen om bekend te maken.

Veranderingen in cytosolischeCa 2+-spiegels kunnen zowel een oorzaak als een gevolg zijn van pathologieën in het epitheel 10,16,17. Verhogingen van cytosolisch calcium kunnen de secretie rechtstreeks stimuleren via activering van het calciumafhankelijke chloridekanaal TMEM16A18,19. Activering van TMEM16A als reactie op Ca2+ zorgt voor de apicale uitstroom van chloride, waardoor een osmotische gradiënt tot stand komt die de vochtsecretie bevordert20,21. Bovendien veroorzaakt een toename van Ca2+ in entero-endocriene cellen de afgifte van serotonine, wat afferente sensorische neuronen stimuleert die de activiteit in het enterische zenuwstelsel kunnen moduleren22. Ca2+-signalen kunnen ook tight junctions moduleren om de barrièrefunctie te beïnvloeden23,24 en de proliferatie in darmstamcellen te reguleren25. Ontregeling vanCa 2+ kan dus brede en verstrekkende gevolgen hebben.
Veel virussen manipuleren cytosolisch Ca2+ om een cellulaire omgeving te creëren die bevorderlijk is voor replicatie26. Rotavirus is hier een goed voorbeeld van binnen het darmepitheel27. Rotavirus niet-structureel proteïne 4 (NSP4) is een Ca2+-geleidend kanaal dat de uitstroom van Ca2+ van het endoplasmatisch reticulum naar het cytosol28,29 mogelijk maakt. Dit stimuleert autofagie en helpt bij de assemblage van de buitenste capside 30,31,32. Rotavirusinfectie induceert ook de afgifte van ADP, waardoor intercellulaire Ca2+-golven worden geactiveerd die bijdragen aan pathogenese17. Andere enterische virussen, waaronder zowel calicivirussen als enterovirussen, coderen voor Ca2+-geleidende viroporinen die een vergelijkbare ontregeling van Ca2+ in geïnfecteerde cellen veroorzaken33,34.
Beeldvorming van menselijke darmorganoïden met levende cellen Ca2+ biedt een veelzijdig platform om virusgeïnduceerde signalering in het epitheel te bestuderen. De kracht van de conclusies die uit de beeldvormingsgegevens worden getrokken, hangt echter onlosmakelijk af van de gezondheid en kwaliteit van de HIO's, geschikte beeldvormingsparameters en een degelijke analytische benadering.
Efficiënte lentivirale transductie is vaak de beperkende stap bij het opzetten van nieuwe HIO-lijnen, maar lentivirus met hoge titer en meervoudige transducties helpen om voldoende transgenexpressie te garanderen. Belangrijk is dat dit in evenwicht moet worden gebracht met het potentieel voor aanzienlijke cellulaire stress bij transductie. Dit is meestal tijdelijk en verdwijnt na selectie en meerdere passages. Desalniettemin is het van cruciaal belang dat HIO's die zijn ontworpen om GECI's tot expressie te brengen, normale groei en proliferatie vertonen voordat met experimenten wordt begonnen. Evenzo veroorzaakt het dispergeren van 3-dimensionale HIO's en het hervormen ervan als monolagen cellulaire stress. Het is een goede gewoonte om drie of meer dagen de tijd te geven om monolagen aan te passen na het plateren. Het coaten van de platen met collageen IV is van cruciaal belang voor de integriteit van de monolaag35,36. Aliquotering van collageen IV en opslag bij -80 °C tussen gebruik helpt om de hechting van de monolaag te garanderen. Het bepalen van de optimale zaaidichtheid voor elke HIO-lijn kan ook helpen om de consistentie te verbeteren. Ten slotte is het onontbeerlijk om de juiste controles op te nemen en deze tussen experimenten te vergelijken om ervoor te zorgen dat elke waarneming een reactie is op de variabele in kwestie, in plaats van een technische confounder.
Hoewel het scoren van een monolaag ongewenste celbeschadiging kan veroorzaken, verbetert het de RV-infectie van 2D HIO's aanzienlijk. Figuur 2 illustreert dit, aangezien bijna alle geïnfecteerde cellen direct aan de kras grenzen. Experimenteel bewijs suggereert dat RV het meest efficiënt infecteert aan het basolaterale oppervlak van darmepitheelcellen37. Er wordt dus voorspeld dat het inkerven van een monolaag de besmettelijkheid verbetert door het basolaterale oppervlak bloot te leggen. Efficiënte monolaaginfectie kan ook worden bereikt door HIO's te plateren op polycarbonaatmembranen die zijn gesuspendeerd in putjes die kweekmedium bevatten, waardoor toegang tot het basolaterale oppervlak mogelijk is. De relatief grote afstand tussen de plaat en het polycarbonaatmembraan, het polycarbonaatmembraan zelf en het plastic oppervlak aan de onderkant van de put maken ze echter ongeschikt voor epifluorescentiebeeldvorming. De scoringsmethode die in dit protocol wordt beschreven, blijft dus de voorkeursbenadering. Gezien het feit dat het scoren zelf kan leiden tot het signaleren van verstoringen, is het opnemen van de niet-geïnfecteerde, gescoorde controle van cruciaal belang voor interpretatie. Voor virussen, zoals het humaan norovirus, die efficiënt infecteren via het apicale membraan, is het scoren van de monolaag niet vereist38.
Zoals bij elk live beeldvormingssysteem, kan fototoxiciteit experimenten met HIO-monolagen gemakkelijk verwarren. Tijdens een beeldvormingsexperiment is het belangrijk om te controleren op onverwachte vacuolisatie, membraanblebbing of andere morfologische indicatoren van stress39. Als een van deze symptomen wordt gedetecteerd, moet de duur, frequentie of kracht van de opwinding worden verminderd. Het verhogen van de signaal-ruisverhouding gaat vaak ten koste van de gezondheid van cellen op de lange termijn, dus het empirisch optimaliseren van parameters is cruciaal. Fotobleken, zoals aangegeven door een afname van de basisfluorescentie-intensiteit in de loop van de tijd, is een voorbode van celstress en moet worden vermeden.
De visualiteit van beeldvormingsgegevens kan ertoe leiden dat onderzoekers de voorkeur geven aan kwalitatieve in plaats van kwantitatieve analyses. Zoals bij elke modaliteit vereisen reproduceerbare conclusies echter kwantificering. Kwantitatieve beeldanalyse bevat veel meer complexiteit dan in een enkel manuscript kan worden behandeld, maar het is de moeite waard om een paar belangrijke punten te benadrukken. Ten eerste vereist consistente kwantificering consistente acquisitie. Een analysepijplijn die is ontwikkeld voor een bepaalde set acquisitieparameters, is mogelijk niet effectief voor beelden die zijn verkregen met verschillende frequenties, belichtingstijden, laservermogens of golflengten. Ten tweede heeft de veelheid van infecties een buitensporige invloed op de frequentie van viraal geïnduceerde calciumsignalen. Daarom is het belangrijk om het aantal geïnfecteerde cellen per gezichtsveld te evalueren en te zorgen voor consistentie tussen de behandelingsomstandigheden. Als alternatief kan het normaliseren van de signaalfrequentie naar het aantal geïnfecteerde cellen per gezichtsveld helpen om fouten te verminderen. Ten slotte, hoewel de recent ontwikkelde mNG-gebaseerde calciumindicator (NEMO) een veelbelovende benadering biedt voor het bepalen van absolute Ca2+ -concentraties in cellen40, geven de meeste biosensoren alleen relatieve informatie over biologische systemen. Achtergrondaftrekking, normalisatie en vergelijking met een besturingselement zijn dus van cruciaal belang.
Hoewel dit protocol zich richt op calciumbeeldvorming tijdens virale infectie, is de algemene aanpak gemakkelijk aan te passen. Virale infectie kan gemakkelijk worden vervangen door een alternatieve behandelingsconditie, en er is een steeds groter wordende litanie van biosensoren om veel verschillende cellulaire routes en processen te bewaken. Bij elke aanpassing van het protocol moeten onderzoekers de analyse top-of-mind houden en experimenten ontwerpen met duidelijke, kwantificeerbare resultaten.
Over het algemeen biedt live imaging een ongeëvenaarde temporele resolutie, waardoor de karakterisering van zeer dynamische processen wordt verbeterd. Door organoïden op te nemen in live beeldvormingsexperimenten kunnen deze processen worden waargenomen in een natuurgetrouw, fysiologisch relevant model. We hopen dat het hier beschreven protocol experimenteel ontwerp en optimalisatie vergemakkelijkt, waardoor onderzoekers in staat worden gesteld om nieuwe aspecten van cel- en weefselsignalering te ontdekken.

Calcium is een wijdverbreide tweede boodschapper die een cruciale rol speelt bij het reguleren van de cellulairefysiologie. Gezien zijn sterke lading, kleine formaat en hoge oplosbaarheid in fysiologische omstandigheden, is calcium een ideale manipulator van eiwitconformatie. Dit maakt calcium een krachtig middel om elektrochemische signalen om te zetten in enzymatische, transcriptionele of post-transcriptionele veranderingen. De strikte calciumconcentratiegradiënten over het endoplasmatisch reticulum (ER) en plasmamembranen creëren een hoge drijvende kracht die snelle veranderingen in de cytosolische calciumconcentratie mogelijk maakt. Meerdere mechanismen, waaronder zowel buffering als actief transport, houden deze gradiënt strak in stand. Hoewel dit onderhoud noodzakelijk is voor normale cellulaire functies, is het energetisch duur, waardoor het bijzonder vatbaar is in stresstoestanden.
Als zodanig is ontregeling van calcium in het cytosol een bijna universeel signaal van vele soorten cellulaire stress. Metabole stoornissen, toxines, ziekteverwekkers, mechanische schade en genetische verstoringen kunnen allemaal de calciumsignalering verstoren. Ongeacht de stimulus kan op het niveau van de hele cel aanhoudende, ongecontroleerde stijgingen van cytosolisch calcium apoptose en uiteindelijk necrose bevorderen 3,4. Veranderingen in cytosolische calciumspiegels met een lagere amplitude of een hogere frequentie hebben echter wisselendeeffecten2. Evenzo kunnen de uitkomsten van calciumfluctuaties verschillen op basis van het ruimtelijke microdomein waarin ze voorkomen5. Het monitoren van calciumspiegels kan dus inzicht bieden in dynamische signaleringsprocessen, maar dit vereist bemonstering met een relatief hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) zijn krachtige instrumenten voor continue bemonstering in levende celsystemen6. Enkele van de meest gebruikte GECI's zijn op GFP gebaseerde calciumresponsieve fluorescerende eiwitten die bekend staan als GCaMPs7. De canonieke GCaMP is een fusie van drie verschillende eiwitdomeinen: een circulair gepermuteerd GFP (cpGFP), calmoduline en M136. Het calmodulinedomein ondergaat een conformatieverandering bij het binden van calcium, waardoor de interactie met M13 mogelijk wordt. De interactie tussen calmoduline en M13 induceert een conformatieverandering in de cpGFP die de fluorescerende emissie bij excitatie verhoogt. Als zodanig correleert een toename van de calciumconcentratie met een toename van de GCaMP-fluorescentie-intensiteit. Deze sensoren kunnen cytosolisch zijn of gericht op specifieke organellen8.
Net als de meeste weefsels reguleert calcium een verscheidenheid aan functies in het gastro-intestinale epitheel. Het darmepitheel is een integraal onderdeel van de opname van voedingsstoffen en vocht, maar moet ook een strakke barrière en immuuninterface vormen om invasie van ziekteverwekkers of toxische beledigingen te voorkomen. Calciumafhankelijke routes beïnvloeden bijna al deze vitale functies 9,10,11. Calciumsignalering in het darmepitheel blijft echter een onderbelichte grens met veelbelovend potentieel als therapeutisch doelwit. Hoewel het monitoren van de calciumdynamiek in het darmepitheel in vivo uitdagingen blijft opleveren, bieden menselijke darmorganoïden (HIO's) een aanpasbaar ex vivo-systeem voor experimenten12. HIO's zijn 3-dimensionale (3D) sferoïden afgeleid van menselijke darmstamcellen en recapituleren bij differentiatie een groot deel van de cellulaire diversiteit van het oorspronkelijke darmepitheel12.
Dit protocol beschrijft uitgebreide methoden om HIO's te ontwikkelen die GECI's tot expressie brengen en vervolgens gemanipuleerde HIO's voor te bereiden als monolagen voor calciumbeeldvorming in levende cellen. Het biedt virale infectie als voorbeeld van een pathologische manipulatie die de calciumsignalering verstoort en biedt een analytische benadering om deze veranderingen te kwantificeren.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL microcentrifuge tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>5408137</td><td></td></tr><tr><td>15mL conical tubes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Corning&nbsp;</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>25 gauge needle</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>1482113D</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycocytic&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>FisherScientific&nbsp;</td><td>BP1600100</td><td></td></tr><tr><td>CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments</td><td>Greiner</td><td>543979</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluorobrite</td><td>Gibco</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050079</td><td></td></tr><tr><td>Human epidermal growth factor</td><td>ProteinTech</td><td>HZ-1326</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus</td><td>VectorBuilder</td><td>(variabel)</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosceicen</td><td>356231/CB40230C</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>MilliporeSigma</td><td>TR1003G</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S70767</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme, no phenol red</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Worthington Biochemical</td><td>NC9811754</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators

Calciumsignalering is een integrale regulator van bijna elk weefsel. Binnen het darmepitheel is calcium betrokken bij de regulatie van secretoire activiteit, actinedynamiek, ontstekingsreacties, stamcelproliferatie en vele andere niet-gekarakteriseerde cellulaire functies. Als zodanig kan het in kaart brengen van de dynamiek van calciumsignalering in het darmepitheel inzicht geven in homeostatische cellulaire processen en unieke reacties op verschillende stimuli onthullen. Menselijke darmorganoïden (HIO's) zijn een high-throughput, van mensen afgeleid model om het darmepitheel te bestuderen en vertegenwoordigen dus een nuttig systeem om de calciumdynamiek te onderzoeken. Dit artikel beschrijft een protocol om HIO's stabiel te transduceren met genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's), live fluorescentiemicroscopie uit te voeren en beeldvormingsgegevens te analyseren om calciumsignalen zinvol te karakteriseren. Als representatief voorbeeld werden 3-dimensionale HIO's getransduceerd met lentivirus om GCaMP6's stabiel tot expressie te brengen, een op groen fluorescerend eiwit gebaseerde cytosolische GECI. De gemanipuleerde HIO's werden vervolgens gedispergeerd in een eencellige suspensie en gezaaid als monolagen. Na differentiatie werden de HIO-monolagen geïnfecteerd met rotavirus en/of behandeld met geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze een calciumrespons stimuleren. Een epifluorescentiemicroscoop uitgerust met een temperatuurgecontroleerde, bevochtigde live-beeldvormingskamer maakte het mogelijk om op lange termijn beeldvorming te maken van geïnfecteerde of met medicijnen behandelde monolagen. Na beeldvorming werden de verkregen beelden geanalyseerd met behulp van de vrij verkrijgbare analysesoftware ImageJ. Over het algemeen brengt dit werk een aanpasbare pijplijn tot stand voor het karakteriseren van cellulaire signalering in HIO's.

Figuur 1A toont een BMM-koepel met daarin 3-dimensionale menselijke darmorganoïden die zijn getransduceerd om GCaMP6's stabiel tot expressie te brengen. Figuur 1B toont dezelfde lijn organoïde die 24, 48 en 72 uur na het zaaien opnieuw is geplateerd als een monolaag. Om de functie van GCaMP6's te valideren, werd de monolaag gedurende 4 minuten om de 2 seconden afgebeeld met fluorescentiemicroscopie, en na ~20 s werd 100 nM ADP aan de media toegevoegd. ADP lokt calciumafgifte uit het endoplasmatisch reticulum op, waardoor het cytosolische calcium toeneemt. De fluorescentie-intensiteit die bij elke blootstelling op het kanaal van 488 nm wordt gedetecteerd, is uitgezet in figuur 1C. Het spoor toont een stabiele basisfluorescentie-intensiteit, gevolgd door een snelle toename na toevoeging van ADP en een geleidelijke terugkeer naar de uitgangswaarde. Er is een voertuigbesturing opgenomen om te verifiëren dat de respons een echte signaalgebeurtenis is, en niet alleen een verandering in fluorescentie-intensiteit die kan ontstaan door de toevoeging van media.
Het scoren van een HIO-monolaag verhoogt de efficiëntie van rotavirusinfectie. Hoewel de technieken voor het scoren variëren, is het het gemakkelijkst om een consistente infectie te krijgen met behulp van een enkele score over de lengte van de monolaag, zoals weergegeven in figuur 2A. Bij gebruik van recombinante rotavirusstammen die fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, kan de infectie worden geverifieerd tijdens live beeldvorming (Figuur 2B). Bij gebruik van een stam die geen marker tot expressie brengt, kan infectie worden gedetecteerd door immunofluorescentie na beeldvorming. Gezien de beweeglijkheid van cellen in HIO-monolagen, is het vaak moeilijk om een enkele geïnfecteerde cel in de loop van de tijd te volgen. Gebruik in plaats daarvan de eindpuntkleuring als een methode om de infectie te verifiëren en te bevestigen dat de multipliciteit van de infectie overeenkomt tussen de gezichtsvelden (Figuur 2C).
Intercellulaire calciumgolven in HIO's kunnen kwalitatief worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 3A. Het bepalen van de frequentie van calciumgolven in een bepaald gezichtsveld vereist echter een kwantitatieve analyse. De stappen van succesvolle segmentatie, zoals beschreven in stap 6 van het protocol hierboven, worden geïllustreerd in figuur 3A. De figuur toont het ruwe beeld (Figuur 3Ai), het beeld nadat de pixelintensiteiten van het vorige frame zijn afgetrokken (Figuur 3Aii) en vervolgens de gesegmenteerde calciumgolf (Figuur 3Aiii).
Zodra de calciumgolven in de loop van de beeldvormingsrun zijn gesegmenteerd en gekwantificeerd voor elk gezichtsveld, is het vaak informatief om de frequentie van golven in monolagen die aan verschillende omstandigheden worden blootgesteld, te vergelijken. Het stripdiagram in figuur 3B toont het totale aantal calciumgolven per gezichtsveld in nep- en rotavirus-geïnoculeerde monolagen. Dit voorbeeld omvat twee stammen van RV: een stam van het humaan rotavirus (Ito HRV) en een recombinante stam van het simian rotavirus SA11 die mRuby (SA11-mRuby) tot expressie brengt. De nep-geïnfecteerde controle wordt genomen als de basisfrequentie van calciumgolven, de onbehandelde rotavirus-geïnfecteerde monolagen dienen als positieve controles en de rotavirus-geïnfecteerde, behandelde monolagen zijn de experimentele omstandigheden. Mock-geïnfecteerde en RV-geïnfecteerde monolagen die worden behandeld met medicijnen, waaronder de ADP-receptorremmer, BPTU, kunnen vervolgens worden vergeleken met beide controlecondities door eenrichtings-ANOVA. De gegevens suggereren dat BPTU de frequentie van intercellulaire calciumgolven effectief verlaagt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig01.jpg"> Figuur 1: Validatie van GCaMP6s-expressie in jejunale menselijke darmorganoïden. (A) Na lentivirustransductie ondergingen de GCaMP-expressieve HIO's selectie en meerdere passages, hier weergegeven op 7 dagen na de meest recente passage. Na stimulatie met de 488 nm-laser is de expressie van GCaMP6 duidelijk zichtbaar in de getransduceerde HIO's die zijn geplateerd in een basaalmembraanmatrix van 15 μl als 3-dimensionale sferoïden (Ai). Belichtingen van 50 ms werden verkregen met een laservermogen van 50% met behulp van een 20x objectief, en vervolgens aan elkaar genaaid om de hele koepel van de keldermembraanmatrix te visualiseren. Een soortgelijk proces werd uitgevoerd met behulp van 4 ms helderveldbelichtingen (Aii). In het helderveldbeeld zijn de donkere HIO's in het midden van de koepel een indicatie dat de culturen klaar zijn voor doorgang. (B) HIO's werden enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en vervolgens opnieuw geplateerd met een dichtheid van 150.000 cellen per putje (5 mm in diameter) van een beeldvormende bodemplaat die vooraf was gecoat met collageen IV. 72 uur na het zaaien was de monolaag samenvloeiend en klaar voor stroomafwaartse toepassingen. Om de functie van GCaMP te valideren, werden beelden verkregen met behulp van de 488 nm-filterset met belichtingen van 50 ms bij 50% laservermogen om de 2 seconden gedurende 4 minuten. (C) De hier getoonde sporen vertegenwoordigen de fluorescentie-intensiteit van het hele veld die is genormaliseerd naar de eerste acquisitie in de loop van de beeldvorming. Rond 20 s (pijl), na de tiende blootstelling, werd 100 nM adenosinedifosfaat (ADP) toegevoegd om een piek in cytosolisch calcium (rood) op te wekken. De toevoeging van een gelijk volume van 1x PBS lokte geen zinvolle respons uit (blauw). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig02.jpg"> Figuur 2: Scoren van een HIO-monolaag om RV-infectie te vergemakkelijken. (A) De figuur illustreert een geschikte techniek voor het insnijden van een monolaag met behulp van een 25G-naald. (B) Een HIO-monolaag werd geïnfecteerd met een recombinante stam van RV die het mRuby-fluorescerende eiwit (magenta, pijl) tot expressie brengt, waardoor geïnfecteerde cellen kunnen worden geïdentificeerd. Als alternatief, bij gebruik van een natuurlijk voorkomende stam van RV, kunnen geïnfecteerde cellen worden geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie. (C) De getoonde afbeeldingen zijn afkomstig van 4 verschillende HIO-monolagen na fixatie, DAPI-kleuring (blauw) en antilichaamlabeling van rotavirusantigeen (magenta). Beide technieken illustreren de preferentiële RV-infectie in de buurt van het gescoorde deel van de monolaag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66132/66132fig03.jpg"> Figuur 3: Segmentatie en kwantificering van RV-geïnduceerde intercellulaire calciumgolven. De 488 nm-blootstellingen van RV-geïnfecteerde HIO's die GCaMP6's tot expressie brengen, werden gedurende 16 uur elke 1 minuut verkregen met behulp van het protocol. (A) De figuur illustreert het proces van intercellulaire calciumgolfsegmentatie. Eerst worden de pixelwaarden van de vorige acquisitie (t-1) afgetrokken van elk onbewerkt beeld (Ai) om de verandering in fluorescentie-intensiteit (Aii) te kwantificeren. Vervolgens wordt een drempelwaarde toegepast op basis van een experimenteel geoptimaliseerde minimale toename van de intensiteit ten opzichte van het vorige frame. De beelden worden vervolgens gefilterd op een minimaal aaneengesloten signaalgebied om te selecteren op intercellulaire calciumgolven (Aiii) en eencellige calciumsignalen uit te sluiten. Deze verwerking maakt het mogelijk om calciumgolven in elk gezichtsveld te kwantificeren. In dit experiment waren monolagen ofwel nep-geïnfecteerd, geïnfecteerd met de ITO-stam van humaan rotavirus (HRV), of geïnfecteerd met een recombinante stam van simian rotavirus die codeert voor mRuby op gensegment 7, stroomafwaarts van niet-structureel eiwit 3 (SA11-mRuby). Geïnfecteerde monolagen werden ofwel behandeld met de ADP-receptorremmer BPTU of onbehandeld gelaten. Monolagen werden vervolgens op 8 verschillende posities in beeld gebracht en calciumgolven in elk gezichtsveld werden gekwantificeerd met behulp van de pijplijn die in dit protocol wordt beschreven. De punten op het stripdiagram geven het aantal calciumgolven aan dat op elke positie wordt gedetecteerd, gesuperponeerd op een staafdiagram dat het gemiddelde en de SD markeert. One-way ANOVA, gevolgd door de tests van Dunnett, tonen aan dat hoewel beide stammen van RV de frequentie van intercellulaire calciumgolven boven die van de niet-geïnfecteerde groep verhogen, BPTU-behandeling de RV-gemedieerde toename van de calciumgolffrequentie voorkomt. **p<0.01, ***p<0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/66132fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagens</td>
			<td>Transductie</td>
			<td>Beheersen</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 (1 mM voorraad)</td>
			<td>4 μL</td>
			<td>4 μL</td>
		</tr><tr><td>Polybreen (1 mg/μL voorraad)</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Lentivirus</td>
			<td>veranderlijk*</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HighWnt-WRNE *zie opmerkingen</td>
			<td>tot 400 μL</td>
			<td>tot 400 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Lentivirus-transductiemedium. Bereid de transductiemedia en de controlemedia voor door de reagentia te combineren in de volumes die respectievelijk in de tweede en derde kolom zijn aangegeven. Streef naar een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 lentivirustransductie-eenheden per cel. Voor LV dat in eigen beheer wordt verpakt, is meestal ~25-50 μL geconcentreerde LV nodig. De titer van de meeste commercieel verpakte LV wordt voorzien van het analysecertificaat.
Aanvullend coderingsbestand 1: ImageJ-macroscript om kwantificering van calciumgolven mogelijk te maken door batchverwerking. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66132/Wave_counter.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Dit protocol beschrijft een aanpak voor het uitvoeren van calciumbeeldvorming in met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïden en biedt een benadering voor analyse.

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Calcium signaling is an integral regulator of nearly every tissue. Within the intestinal epithelium, calcium is involved in the regulation of secretory ...

Met ons werk willen we begrijpen hoe virussen de signalering in het darmepitheel verstoren. We zijn vooral geïnteresseerd in het begrijpen van de manieren waarop met virus geïnfecteerde cellen naburige niet-geïnfecteerde cellen ontregelen om bij te dragen aan de pathogenese. We hebben onlangs ontdekt dat met rotavirus geïnfecteerde cellen pulsen van ADP afgeven, wat naburige niet-geïnfecteerde cellen ontregelt en de verspreiding van virussen vergemakkelijkt en de ziekte verergert.Hoewel calciumbeeldvorming erg populair is op gebieden als neurowetenschappen, is het niet veel gebruikt om epitheliale biologie of virologie te bestuderen. Dit protocol biedt een aanpak om bestaande technologieën en modelsystemen aan te passen om calciumsignalering en levend virus-geïnfecteerd epitheelweefsel te bestuderen. Door organoïden te manipuleren om genetisch gecodeerde calciumindicatoren tot expressie te brengen, maakt onze aanpak een consistente, reproduceerbare beeldvorming op lange termijn mogelijk in een modelsysteem dat de cellulaire diversiteit van het menselijke darmepitheel recapituleert.We streven ernaar om de effecten van virus-geïnduceerde paracriene purinerge signalering voor zowel de gastheer als het virus te begrijpen. Ons toekomstige werk zal ook bepalen of dit type signalering in grote lijnen behouden blijft bij andere virussen en of de effecten vergelijkbaar zijn.

live-calcium-imaging-virus-infected-human-intestinal-organoid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

Deze video introduceert de concepten achter calciumbeeldvorming en bevat een voorbeeldprotocol voor time-lapse beeldvorming van wormen in gegoten agaroseputten.

Calcium imaging: een methode om neurale activiteit in levende C. elegans te visualiseren

Source: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates calcium imaging to visualize and analyze the activity of enteric neurons and glia in mouse Colonic Myenteric plexus preparations.

Calcium Imaging of Enteric Neuron and Glia Activities in a Mouse Colonic Myenteric Plexus

Source: Doser, R., et al. Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo. J. Vis. Exp. (2023)This video demonstrates in vivo imaging of subcellular calcium flux in the ventral nerve cord neurons of transgenic Caenorhabditis elegans strains. Two distinct calcium indicators are employed: a cytoplasmic indicator in one strain and a mitochondrial indicator in another. Neurons are observed under a fluorescence microscope to monitor real-time changes in fluorescence intensity within the...

Imaging Subcellular Calcium Dynamics in Neurons of Caenorhabditis elegans

Dit protocol legt de primaire Lgr5-positve organoïde cultuur en de daaropvolgende prestaties van retrovirale transductie. Dit maakt Cre-induceerbare overexpressie of knock-down van de geleverde transgen en maakt de functionele studies die in de roman worden uitgevoerd in vitro organotypisch   modelsysteem.

Een video Protocol van retrovirale infectie in het jeugdwerk Intestinale organoïde Cultuur

Het enterische zenuwstelsel (EZS) is een netwerk van neuronen en gliacellen in de darmwand dat intestinale reflexen controleert. Dit protocol beschrijft methoden voor het opnemen van de activiteit van enterische neuronen en gliacellen in levende bereidingen van EZS met behulp van Ca2+ beeldvorming.

In Situ Ca 2+ Beeldvorming van het enterische zenuwstelsel

Deze methode biedt een manier om te koppel optogenetics en genetisch gecodeerde calcium sensoren om beeld Baseline cytosolische calcium niveaus en veranderingen in opgeroepen calcium transiënten in het lichaam muur spieren van het modelorganisme C. elegans.

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

Hier presenteren we een protocol waarin afzonderlijke cellen worden gecontroleerd op acute gebeurtenissen en productieve HIV-1-infectie op een nanofluïdisch apparaat. Beeldvormingsgegevens definiëren virus-host receptorinteracties en signaalroutedynamiek. Dit is de eerste methode voor nanofluïdische longitudinale eencellige cultuur en beeldvorming met hoge doorvoer om signaalkinetiek en moleculaire interacties te bestuderen.

Eencellige karakterisering van calciuminstroom en HIV-1-infectie met behulp van een Multiparameter Optofluidic Platform

De huidige methoden beschrijven een niet-ratiometrische benadering voor hoge resolutie, sub-compartimentale calciumbeeldvorming in vivo in Caenorhabditis elegans met behulp van direct beschikbare genetisch gecodeerde calciumindicatoren.

Subcellulaire beeldvorming van neuronale calciumbehandeling in vivo

Levendcelbeeldvorming van calciumsignalering wordt uitgebreid gebruikt om calciummobilisatie te bestuderen in stabiele cellijnen die in monolagen zijn gekweekt. Dit protocol beschrijft fluorescentiebeeldvorming van calciumsignalering in levende cellen met behulp van levende-celkleurstoffen op complex, primair weefsel, en maakt ook gebruik van machine learning-software om de fluorescentieintensiteit van duizenden individuele cellen gelijktijdig te kwantificeren, waardoor analyses worden...

Fluorescentie-gebaseerde calciumbeeldvorming in primaire epitelkweken van de menselijke luchtweg met behulp van geautomatiseerde celsegmentatie

Leer calciumbeeldvorming in virusgeïnfecteerde menselijke darmorganoïden met genetisch gecodeerde calciumindicatoren. Deze methode onderzoekt hoe rotavirus signalering in het darmslijmvlies verstoort.

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (Video) | JoVE Journal

Levende calciumbeeldvorming van met virus geïnfecteerde menselijke darmorganoïde monolagen met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

Meer video's verkennen