Name: CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-08T14:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 33 s
Description: Leer een CRISPR-Cas-gemedieerde multianalyte synthetische urine biomarker test voor punt-van-zorg kankerdiagnostiek. Deze methode detecteert meerdere ziektesignalen tegelijk met DNA-barcodes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door een Koch Institute Support Grant nummer P30-CA14051 van het National Cancer Institute (Swanson Biotechnology Center), een Core Center Grant P30-ES002109 van het National Institute of Environmental Health Sciences, het Koch Institute's Marble Center for Cancer Nanomedicine, het Koch Institute Frontier Research Program via het Kathy and Curt Marble Cancer Research Fund, en het Virginia en D. K. Ludwig Fonds voor Kankeronderzoek. A.E.V.H. wordt ondersteund door een door de NIH gefinancierde predoctorale opleidingsbeurs (T32GM130546). S.N.B. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute. L.H. wordt ondersteund door een K99/R00 Pathway to Independence Award van het National Cancer Institute en de startfinanciering van Boston University.

Alle dierstudies zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de instelling van de auteurs. Standaard faciliteiten voor dierverzorging, waaronder huisvestingskamers, steriele kappen, anesthetica en ethische eindpunteuthanasie zijn vereist om deze experimenten correct uit te voeren. Alle experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele en nationale richtlijnen en staan onder toezicht van het veterinaire personeel van de instelling. Vrouwelijke BALB/c-muizen, die voor de experimenten worden gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron (zie Materiaaltabel) en varieerden in leeftijd van 6 tot 8 weken aan het begin van het onderzoek. Sequenties voor op maat gesynthetiseerd DNA, crRNA, FRET-gebaseerde peptidesubstraatsondes en sensorpeptiden worden gegeven in aanvullende tabel 1.
1. Protease-geactiveerde peptide substraat selectie
<ol><li>Verzamel en bereid weefselmonsters voor van gezonde longen of longweefsel met tumorknobbeltjes volgens een eerder gepubliceerd rapport13.<ol><li>Homogeniseer weefsels in voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, pH 7,4) (200 mg weefsel/ml PBS) met weefseldissociatiebuisjes voor de geautomatiseerde dissociatie van weefsels in eencellige suspensies.</li>
		<li>Centrifugeer weefselhomogenisaties bij 6.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Bewaar het supernatans in een nieuwe buis.</li>
		<li>Centrifugeer het supernatans bij 14.000 x g gedurende 25 minuten bij 4 °C.</li>
		<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van een eiwittestkit met bicinchoninezuur (BCA) (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Voeg PBS toe aan het monster om een oplossing van 0,33 mg/ml te bereiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Beoordeel de proteolytische activiteit aan de hand van de onderstaande stappen.<ol><li>Voeg in een plaat met 384 putjes 5 μL, 6 μM FRET-gebaseerde peptidesubstraatsondes toe aan elk putje. Voer voor elke sonde de reactie in drievoud uit. OPMERKING: Op FRET gebaseerde peptidesubstraatsonde bevat een korte peptidesequentie (6-8 aminozuren, ontworpen om specifiek te zijn voor een doelprotease of groep proteasen) die eindigt met een fluorofoor- en quencherpaar. Twee FRET-sondes worden als voorbeeld beschreven in aanvullende tabel 1 . De volledige bibliotheek met sondes is te vinden in Hao et al.13. okt.</li>
		<li>Centrifugeer de putplaat gedurende 10 s bij kamertemperatuur bij 180 x g om er zeker van te zijn dat de sondes zich aan de onderkant van de plaat bevinden.</li>
		<li>Voeg 25 μL 0,33 mg/ml weefselmonster of 40 μM recombinant protease13 toe aan elk putje. OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van het weefselmonster of recombinante protease moet mogelijk worden geoptimaliseerd op basis van hun intrinsieke proteolytische activiteit. Zo kunnen sterk proteolytische weefsels zoals darmen hogere verdunningsfactoren nodig hebben om de initiële enzymatische splitsing te kunnen controleren.</li>
		<li>Centrifugeer de putplaat kort bij 180 x g (bij kamertemperatuur) om de sondes en weefsellysaten te mengen.</li>
		<li>Begin onmiddellijk met het detecteren van sondesplitsing door gedurende 1 uur elke 2 minuten de fluorescentie te meten met de plaatlezer bij 37 °C (λbijv.: 485 nm; λem: 535 nm) om de splitsing te controleren. OPMERKING: Gebruik de juiste excitatie- en emissiegolflengten voor specifieke fluorofoor- en quencherparen. In het geval van dit onderzoek worden parameters (λex: 485 nm en λem: 535 nm) vastgesteld voor de FAM-fluorofoor.</li>
		<li>Om de fluorescerende meetgegevens te analyseren, gebruikt u het Python-pakket (zie Tabel met materialen) voor enzymkinetische analyse dat beschikbaar is op https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dit script berekent de initiële reactiesnelheid (V0) met behulp van de helling van de lineaire fit van de eerste 8-10 initiële tijdstippen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Formulering en karakterisering van de sensor
<ol><li>Synthese het geconjugeerde DNA en protease-geactiveerd peptide (PAP).<ol><li>Incubeer 20-mer fosforothioated DNA-reporters met 3'-DBCO-groep (1,1 eq., zie materiaaltabel) met azide-geëindigde PAP's met C-terminuscysteïne en in 100 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) bij kamertemperatuur gedurende >4 uur. Als u het een nacht laat staan, incubeer dan bij 4 °C.</li>
		<li>Zuiver het product op een HPLC-systeem (High-Performance Liquid Chromatography) dat is uitgerust met een kolom die ideaal is voor biomoleculen (zie Materiaaltabel). Stel de HPLC-gradiënt in om te beginnen met 5% A-buffer (0.05% TFA in H2O), isocratisch gedurende 20 minuten en bereik 80% B-buffer (0.05% TFA, 99.95% acetonitril) na 65 minuten met een stroomsnelheid van 0.3 ml min-1, en verzamel het geconjugeerde product met retentietijd op ~31 min.</li>
		<li>Valideer de gezuiverde conjugaten door middel van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie-time of flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie met behulp van α-cyano-4-hydroxykaneelzuur als matrix14 (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese de DNA-gecodeerde op activiteit gebaseerde nanosensoren.<ol><li>Los 2 mg multivalente PEG (40 kDa, 8-armig, zie materiaaltabel) op met de maleimide-reactieve groep in 1 ml 100 mM fosfaatbuffer (pH 7,0) en filter (afkapwaarde: 0,2 μm).</li>
		<li>Voeg de cysteïne-geëindigde DNA-peptideconjugaten (2 eq., zie Materiaaltabel) toe aan de PEG en reageer bij kamertemperatuur gedurende >4 uur. Als u het een nacht laat staan, incubeer dan bij 4 °C.</li>
		<li>Verwijder de niet-geconjugeerde materialen met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie met een in de handel verkrijgbare dextran-agarose-composietmatrixkolom op een snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC) (zie Materiaaltabel). Voer monsters uit in PBS en controleer de absorptie bij 260 nm voor DNA en 280 nm voor peptide.</li>
		<li>Concentreer de gesynthetiseerde nanosensoren met centrifugaalfilterbuizen (MWCO = 10 kDa) volgens de door de fabrikant aanbevolen snelheid (zie Materiaaltabel).</li>
		<li>Kwantificeer de concentratie van DNA met behulp van een ssDNA-testkit (zie Tabel met materialen) en een plaatlezer bij λex: 485 nm en λem: 535 nm. Bewaar de nanosensoren bij 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Karakteriseer de DNA-gecodeerde op activiteit gebaseerde nanosensoren.<ol><li>Meet de hydrodynamische deeltjesgrootte van DNA-gecodeerde nanosensoren door middel van dynamische lichtverstrooiing (DLS). OPMERKING: Het verwachte groottebereik van nanosensoren is 15-50 nm, met een gemiddelde grootte van 20-30 nm. Als een beperkt groottebereik gewenst is, kan FPLC (in stap 2.3) worden gebruikt om smallere fracties met verschillende molecuulgewichten te isoleren.</li>
		<li>Concentreer de nanosensoren tot 0,5 mg/ml (op basis van DNA-concentratie) met centrifugaalfilterbuizen (MWCO = 10 kDa) en laad de monsters op een met koolstoffilm gecoat koperen rooster dat op een cryohouder is gemonteerd. Observeer de morfologie met behulp van cryogene transmissie-elektronenmicroscopie (200 kV, vergroting van 10.000-60.000)14.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Sensorinjectie en urineopvang
<ol><li>Verzamel urine voor nulmeting.<ol><li>Plaats de muis in een aangepaste behuizingskamer (zie aanvullende afbeelding 1) met een plaat met 96 putjes als basis.</li>
		<li>Houd de muis in bedwang en oefen lichte druk uit op de blaas om eventuele resterende urine op het bord te legen.</li>
		<li>Pipeteer de opgevangen urine (~100-200 μL) van de plaat met 96 putjes in een buisje van 1,5 ml nadat u de muis hebt teruggeplaatst in de normale behuizing.</li>
	</ol></li>
	<li>Stel een preklinisch muizentumormodel op.<ol><li>Inoculeer vrouwelijke muizen van 6 tot 8 weken oud met BALB/c door intraveneuze injectie met MC26-Fluc-cellijn die luciferase tot expressie brengt (100k cellen/muis) (zie Materiaaltabel). Bewaak wekelijks de tumorprogressie met behulp van een in vivo fluorescentiebeeldvormingssysteem. OPMERKING: Zichtbare tumorbelasting aangegeven door een luminescent signaal treedt ongeveer op in week 2 van injectie van deze specifieke cellijn. Controleer regelmatig tumordragende dieren tijdens de tumorprogressie.</li>
	</ol></li>
	<li>Injecteer nanosensoren op verschillende tijdstippen na implantatie van de tumor.<ol><li>Bereid een injectieoplossing (maximaal volume van 200 μl) met nanosensoren in een concentratie van 1 nmol met DNA-streepjescode in steriele PBS.</li>
		<li>Injecteer 200 μL sensoroplossing in PBS intraveneus in elke experimentele muis.</li>
	</ol></li>
	<li>Verzamel urinemonsters van gezonde controle- en tumordragende muizen 1 uur na sensorinjectie zoals beschreven in stap 1.1-1.3. OPMERKING: Verse urinemonsters kunnen direct worden verwerkt tot DNA-barcode-analyse of onmiddellijk op ijs worden ingevroren.</li>
</ol>4. CRISPR-detectie van DNA-barcodes: op basis van fluorescentie
<ol><li>Gebruik verse urinemonsters of ontdooi bevroren monsters op ijs. Centrifugeer urinemonsters op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Combineer de reagentia in aanvullende tabel 2, voeg als laatste het Cas12a-enzym (zie materiaaltabel) toe en meng de reactie voorzichtig door op en neer te pipetteren. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 30 min.</li>
	<li>Voer de reactie van de verslaggever, zoals weergegeven in aanvullende tabel 3, in drievoud uit met behulp van het product van stap 2. Voeg de reactie van stap 2 als laatste toe en breng snel naar de plaatlezer.</li>
	<li>Detecteer LbaCas12a-activering door gedurende 3 uur elke 2 minuten fluorescentie te meten met een plaatlezer bij 37 °C (λex: 485 nm en λem: 535 nm) om de splitsingkinetiek van de DNA-reporter te controleren.</li>
	<li>Om de fluorescerende meetgegevens te analyseren, gebruikt u het Python-pakket voor enzymkinetische analyse dat beschikbaar is op https://github.com/nharzallah/NNanotech-Kinetic. Dit script berekent de initiële reactiesnelheid (V0) met behulp van de helling van de lineaire fit van de eerste 8-10 initiële tijdstippen.</li>
</ol>5. CRISPR-detectie van DNA-barcodes: op papier
<ol><li>Centrifugeer urinemonsters op 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. NOTITIE: Voer de urinemonsters voor CRISPR-detectie op basis van fluorescentie en papier parallel uit.</li>
	<li>Combineer de reagentia in aanvullende tabel 2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. OPMERKING: Deze incubatiestap is identiek aan die voor de op fluorescentie gebaseerde CRISPR-detectie.</li>
	<li>Voer de reporterreactie uit met behulp van FAM-biotine gelabelde DNA-reporter voor laterale flow-assay op een papieren strook (zie Tabel met materialen). Combineer de reagentia in aanvullende tabel 4 in een plaat met 96 putjes met behulp van het product van stap 2. Dek af met aluminiumfolie en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. NOTITIE: Selecteer de optimale incubatietijd volgens de real-time kinetische monitoring in de hierboven beschreven op fluorescentie gebaseerde CRISPR-detectietest.</li>
	<li>Voeg aan een nieuw putje van een plaat met 96 putjes 80 μL PBS toe. Voeg 20 μL monster van stap 3 toe aan dit putje.</li>
	<li>Plaats een strookpapier met zijstroom in elk putje en wacht tot de vloeistof de bovenkant van de strook bereikt (<5 min). Zoek naar het uiterlijk van de controle- en/of monsterband(en) op de papieren strook.</li>
	<li>Maak een foto van de laterale stroomstrook en kwantificeer de bandintensiteit met behulp van ImageJ.</li>
</ol>

CRISPR-Cas synthetische urine-biomarkertest voor kankerdiagnostiek

<ol><li>Soleimany, A. P., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+an+emerging+paradigm+for+disease+detection+and+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: an emerging paradigm for disease detection and monitoring.</a> Trends Mol Med. 26 (5), 450-468 (2020).</li>
<li>Muir, R. K., Guerra, M., Bogyo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+diagnostics%3A+recent+advances+in+the+development+of+probes+for+use+with+diverse+detection+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Activity-based diagnostics: recent advances in the development of probes for use with diverse detection modalities.</a> ACS Chem Biol. 17 (2), 281-291 (2022).</li>
<li>Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+and+future+perspectives+of+liquid+biopsies+in+genomics-driven+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology.</a> Nat Rev Genet. 20 (2), 71-88 (2019).</li>
<li>Dudani, J. S., Warren, A. D., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+protease+activity+to+improve+cancer+care%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Canc+Biol%22%5BJournal%5D)">Harnessing protease activity to improve cancer care.</a> Annu Rev Canc Biol. 2, 353-376 (2018).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+new+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: new dimensions.</a> Cancer Discov. 12 (1), 31-46 (2022).</li>
<li>Quail, D. F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+tumor+progression+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis.</a> Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomarkers%3A+a+twenty-first+century+path+to+early+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomarkers: a twenty-first century path to early cancer detection.</a> Nat Rev Cancer. 21 (10), 655-668 (2021).</li>
<li>Kirkpatrick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+detection+of+lung+cancer+in+mice+via+noninvasive+pulmonary+protease+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Urinary detection of lung cancer in mice via noninvasive pulmonary protease profiling.</a> Sci Transl Med. 12 (537), eaaw0262(2020).</li>
<li>Warren, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+detection+by+ultrasensitive+quantification+of+microdosed+synthetic+urinary+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Disease detection by ultrasensitive quantification of microdosed synthetic urinary biomarkers.</a> J Am Chem Soc. 136 (39), 13709-13714 (2014).</li>
<li>Kwong, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-encoded+synthetic+biomarkers+for+multiplexed+urinary+monitoring+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Mass-encoded synthetic biomarkers for multiplexed urinary monitoring of disease.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 63-70 (2013).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Choi, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+clearance+of+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Renal clearance of quantum dots.</a> Nat Biotechnol. 25 (10), 1165-1170 (2007).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas-amplified+urinary+biomarkers+for+multiplexed+and+portable+cancer+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas-amplified urinary biomarkers for multiplexed and portable cancer diagnostics.</a> Nat Nanotechnol. 18 (7), 798-807 (2023).</li>
<li>Hao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-triggered+multimodal+precision+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-triggered multimodal precision diagnostics.</a> Nat Mater. 20 (10), 1440-1448 (2021).</li>
<li>Ghanta, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Modifications+improve+potency+and+efficacy+of+DNA+donors+for+precision+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">5'-Modifications improve potency and efficacy of DNA donors for precision genome editing.</a> Elife. 10, e72216(2021).</li>
<li>Bekkevold, C. M., Robertson, K. L., Reinhard, M. K., Battles, A. H., Rowland, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dehydration+parameters+and+standards+for+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Dehydration parameters and standards for laboratory mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 52 (3), 233-239 (2013).</li>
</ol>

S.N.B., L.H. en R.T.Z. worden vermeld als uitvinders op een octrooiaanvraag met betrekking tot de inhoud van dit werk. S.N.B. heeft aandelen in Glympse Bio, Satellite Bio, Lisata Therapeutics, Port Therapeutics, Intergalactic Therapeutics, Matrisome Bio, en is bestuurder bij Vertex; consulteert voor Moderna en ontvangt gesponsorde onderzoeksfinanciering van Johnson & Johnson, Revitope en Owlstone.

Hier wordt een zeer aanpasbaar platform gepresenteerd voor gemultiplexte kankerdetectie met een draagbare urinetest die ziekte-geassocieerde proteolytische activiteit beoordeelt met behulp van een minimaal invasieve geïnjecteerde sensor. Wanneer geactiveerd door tumorproteasen, wordt de splitsing van het peptidesubstraat versterkt via het vrijkomen van DNA-streepjescodes in de urine. De synthetische DNA-reporters in een urinemonster kunnen worden uitgelezen door een secundaire CRISPR-Cas-gemedieerde enzymatische...

Ondanks de aanzienlijke inspanningen om tumorbiomarkers zoals afgestoten eiwitten en DNA te identificeren, is het diagnostische veld van kanker onder druk komen te staan door hun lage overvloed of snelle afbraak in de bloedsomloop1. Als aanvullende strategie vertegenwoordigen bio-engineered synthetische biomarkers die selectief reageren op ziektekenmerken om versterkte signalen te genereren, nieuwe wegen naar nauwkeurige en toegankelijke diagnostiek 2,3. Om de detectie te vergemakkelijken, maken deze synthetische biomarkers gebruik van tumorafhankelijke activeringsmechanismen zoals enzymatische amplificatie om analyten te produceren met een verbeterde signaal-ruisverhouding4. Hierin wordt een klasse van kanker-geassocieerde enzymen, proteasen, gebruikt om injecteerbare sensoren op nanoschaal te activeren om ziekteverslaggevers vrij te geven die detecteerbaar zijn uit de biovloeistoffen zoals bloed of urine 5,6. In het licht van de heterogeniteit van de tumor maakt de ontwikkeling van een panel van door protease geactiveerde sensoren multianalyttests mogelijk die verschillende protease-splitsingsgebeurtenissen combineren tot een 'ziektehandtekening' om de incidentie en progressie van kanker op een meer specifieke, gemultiplexte manier te beoordelen.
Er zijn protease-geactiveerde synthetische biomarkers ontwikkeld die bestaan uit peptidesubstraten die zijn geconjugeerd aan het oppervlak van een inerte drager7. Wanneer deze peptiden in vivo worden geïnjecteerd, worden ze naar de tumor vervoerd, waarna enzymatische splitsing door tumorproteasen verslaggevers in bloed of urine vrijgeven voor detectie. Meervoudige detectie met protease-geactiveerde synthetische biomarkers vereist dat elke synthetische biomarker in een cocktail wordt geëtiketteerd met een unieke moleculaire streepjescode. Daartoe zijn verschillende benaderingen ontwikkeld, waaronder massastreepjescodes en ligandgecodeerde reporters 8,9,10. In tegenstelling tot deze methoden van multiplexing, die beperkt kunnen zijn tot een paar verschillende signaalmogelijkheden, biedt DNA-barcodering veel meer combinaties in overeenstemming met de hoge complexiteit en heterogeniteit van menselijke ziektetoestanden. Om de multiplexiteit van synthetische biomarkers uit te breiden, worden de sensoren voorzien van een barcode door elke verslaggever te labelen met een unieke DNA-sequentie voor detectie via CRISPR-Cas-nuclease om het biofluïdische signaal ex vivo te versterken. Deze enkelstrengs DNA (ssDNA) barcodes zijn ontworpen om te binden aan complementaire CRISPR-gids-RNA's (crRNA's), waardoor de door het doelwit geactiveerde collaterale nuclease-activiteit van CRISPR-Cas12a11 wordt geactiveerd. Deze nuclease-activiteit kan worden gebruikt om een reporter-DNA-streng te splitsen die wordt gedetecteerd door middel van fluorescentiekinetiek of met behulp van papieren stroken.
Naast moleculaire amplificatie via proteasen (in vivo) en CRISPR-Cas (ex vivo), is een ander belangrijk ontwerpkenmerk van protease-geactiveerde synthetische biomarkers het benutten van de farmacokinetiek van nanomaterialen om de diagnostische signaalconcentratie in biovloeistoffen te verhogen. Een benadering is het gebruik van een drager van nanodeeltjes om de circulatietijd van oppervlaktegeconjugeerde peptidesubstraten te verlengen. Een polyethyleenglycol (PEG) dendrimeer wordt geselecteerd als een nanodrager met een relatief kleine hydrodynamische diameter en multivalentie om de afgifte aan tumoren te verhogen. Hoewel klein genoeg om de afgifte van de tumor te bevorderen, is de grootte van de PEG-drager groter dan de ~5 nm-afsnijding van de glomerulaire filtratiebarrière van de nier, zodat alleen gespleten peptidesubstraten in de urine kunnen worden opgeruimd, gebruikmakend van groottefiltratie door de nieren12. In dit protocol wordt de meerstapsworkflow geschetst voor de synthese en toepassing van DNA-barcoded activiteitsgebaseerde nanosensoren in een preklinisch muizenmodel, waarbij de nadruk wordt gelegd op de opzet van de CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine-biomarkertest, die door deze groep is gebruikt om de ziektestatus te classificeren in muizenmodellen van meerdere soorten kanker13. Dankzij het veelzijdige ontwerpprincipe kunnen alle drie de functionele componenten van de nanosensor - de nanocarrier (PEG-polymeer), de stimuli-responsieve module (protease-geactiveerd substraat) en de biofluïdische reporter (DNA-streepjescode) - nauwkeurig worden uitgewisseld volgens toepassingsspecifieke behoeften, waardoor modulariteit mogelijk is door de specifieke kenmerken van het doel en de afgifte aan te passen.

<table><tbody><tr><td>10x NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B6002SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>20-mer fosforotioaat DNA-reporters met 3&rsquo;-DBCO-groep</td><td>IDT</td><td></td><td>Aangepast DNA</td></tr><tr><td>Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography systeem met Vydac 214TP510 C4 kolom</td><td>&nbsp;Agilent</td><td></td><td>HPLC</td></tr><tr><td>&Auml;KTA fast protein liquid chromatography (FPLC)</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Amicon ultracentrifugebuizen (MWCO = 10 kDa)</td><td>EMD millipore</td><td></td><td>Diverse volumes beschikbaar</td></tr><tr><td>Azide-getermineerde PAP's met C-terminus cysteïne</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>Aangepast peptide</td></tr><tr><td>crRNA's&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>Zie Aanvullende Tabel 1</td></tr><tr><td>Cryogene transmissie-elektronenmicroscopie</td><td>JEM-2100F</td><td>JEOL</td><td>cryoTEM</td></tr><tr><td>Cysteïne-getermineerde DNA-peptide-conjugaten</td><td>CPC Scientific</td><td></td><td>Aangepast peptide</td></tr><tr><td>Dynamische lichtverstrooiing (DLS)</td><td></td><td></td><td>DLS</td></tr><tr><td>EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 &micro;M</td><td>New England Biolabs</td><td>M0653T</td><td></td></tr><tr><td>Experimentele dieren</td><td>Taconic Biosciences</td><td>BALB/cAnNTac</td><td>6&ndash;8&thinsp;weken oud</td></tr><tr><td>gentleMACS C buizen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>weefsel homogenisatie</td></tr><tr><td>HybriDetect Universele Lateral Flow Assay Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>MGHD 1</td><td></td></tr><tr><td>Matrix-ondersteunde laser desorption/ionisatie&ndash;time of flight (MALDI&ndash;TOF) massaspectrometrie&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Microflex MALDI&ndash;TOF</td></tr><tr><td>MC26-Fluc-cellijn</td><td></td><td></td><td>Kenneth K. Tanabe Laboratorium, Massachusetts General Hospital</td></tr><tr><td>multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) met maleïmide-reactieve groep</td><td>JenKem</td><td>A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g</td><td></td></tr><tr><td>Python, Versie 3.9</td><td></td><td></td><td>https://www.python.org/</td></tr><tr><td>Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit en Quant-iT OliGreen ssDNA Reagens</td><td>Invitrogen</td><td>O11492</td><td>ssDNA assay kit</td></tr><tr><td>ssDNA FAM-T10-Quencher en&nbsp; FAM-T10-Biotine reporter substraten</td><td>IDT</td><td></td><td>Aangepast DNA</td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL kolom</td><td>GE Healthcare</td><td>GE28-9909-44</td><td>Voor FPLC</td></tr><tr><td>Tecan Infinite Pro M200 plate reader</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr-cas-gemedieerde multianalyte synthetische urine biomarker test voor draagbare diagnostiek

CRISPR-Cas-mediated Multianalyte Synthetic Urine Biomarker Test for Portable Diagnostics

Het creëren van synthetische biomarkers voor de ontwikkeling van precisiediagnostiek heeft het mogelijk gemaakt om ziekten te detecteren via routes die verder gaan dan die welke worden gebruikt voor traditionele biovloeistofmetingen. Synthetische biomarkers maken over het algemeen gebruik van reporters die leesbare signalen in de biovloeistof leveren om de biochemische veranderingen in de lokale micro-omgeving van de ziekte tijdens de incidentie en progressie van de ziekte weer te geven. De farmacokinetische concentratie van de melders en de biochemische versterking van het ziektesignaal zijn van het grootste belang voor het bereiken van een hoge sensitiviteit en specificiteit in een diagnostische test. Hier wordt een kankerdiagnostisch platform gebouwd met behulp van één formaat synthetische biomarkers: op activiteit gebaseerde nanosensoren met chemisch gestabiliseerde DNA-reporters die kunnen worden bevrijd door afwijkende proteolytische handtekeningen in de micro-omgeving van de tumor. Synthetisch DNA als ziektemelder biedt multiplexing-mogelijkheden door het gebruik ervan als streepjescode, waardoor meerdere proteolytische handtekeningen tegelijk kunnen worden uitgelezen. DNA-reporters die in de urine vrijkomen, worden gedetecteerd met behulp van CRISPR-nucleasen via hybridisatie met CRISPR-RNA's, die op hun beurt een fluorescerend of colorimetrisch signaal produceren bij enzymactivering. In dit protocol worden DNA-barcoded, op activiteit gebaseerde nanosensoren geconstrueerd en hun toepassing wordt geïllustreerd in een preklinisch muismodel van uitgezaaide colorectale kanker. Dit systeem is in hoge mate aanpasbaar volgens de ziektebiologie en genereert meerdere ziektesignalen tegelijkertijd, waardoor een uitgebreid begrip van de ziektekenmerken wordt verkregen door middel van een minimaal invasief proces dat alleen nanosensortoediening, urineverzameling en een papieren test vereist die point-of-care-diagnostiek mogelijk maakt.

Nomineren van protease-geactiveerde peptidesubstraten Om sensoren te ontwerpen die veranderingen in de proteolytische activiteit van het weefsel weerspiegelen, wordt de protease-activiteit in het weefsel eerst gekarakteriseerd met behulp van een bibliotheek van peptidesondes13 (Figuur 1). Verse en ingevroren weefselmonsters kunnen substantiële informatie verschaffen over de proteolytische activiteit van de micro-omgeving van de tumor door weefselmo...

Dit protocol beschrijft een CRISPR-Cas-gemedieerde, multianalyte synthetische urine biomarker test die point-of-care kankerdiagnostiek mogelijk maakt door middel van de ex vivo analyse van tumor-geassocieerde protease-activiteiten.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Creating synthetic biomarkers for the development of precision diagnostics has enabled detection of disease through pathways beyond those used for ...

Het Heart Lab ontwikkelt moleculaire en cellulaire hulpmiddelen om de biologie van ziekten nauwkeurig te volgen en te beheersen. We gebruiken speciale informatie over zieke weefsels om het ontwerp van responsieve detectie-, beeldvormings- en behandelingsinstrumenten voor heterogene aandoeningen te informeren. Biovloeistoffen bieden een handige mogelijkheid voor het opsporen en beoordelen van ziekten, maar deze worden vaak beperkt door kleine hoeveelheden relevante analyten.Als gevolg hiervan streeft een groot deel van het veld naar strategieën om ziektegerelateerde signalen te versterken om de gevoeligheid van diagnostische tests, zoals BCR en oppervlakteplasma op resonantie, te verbeteren. In plaats van te vertrouwen op endogene ziektebiomarkers die in omloop zijn, maakt onze aanpak gebruik van synthetische biomarkers om ziekteactiviteit te rapporteren wanneer deze vrijkomt uit geïnjecteerde nanosensoren. Onze synthetische biomarkers zijn chemisch gestabiliseerde DNA-barcodes, waarmee meerdere micro-omgevingssignalen van de ziekte tegelijk kunnen worden gedetecteerd en geïdentificeerd met behulp van de bijbehorende barcode.

crispr-cas-mediated-multianalyte-synthetic-urine-biomarker-test-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

"E-DNA" sensoren, reagentless hebben elektrochemische biosensoren die goed presteren, zelfs wanneer direct uitgedaagd in het bloed en andere complexe matrices, aangepast aan de detectie van een breed scala van nucleïnezuur, eiwitten en kleine moleculen analyten. Hier presenteren we een algemene procedure voor de fabricage en het gebruik van dergelijke sensoren.

Fabricatie van elektrochemische-DNA Biosensoren voor de Reagentless detectie van nucleïnezuren, eiwitten en kleine moleculen

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

Proteasen zijn strak gereguleerde enzymen die betrokken zijn bij de fundamentele biologische processen en dysregulated protease-activiteit stations progressie van complexe ziekten zoals kanker. Doel van deze methode is het creëren van nanosensors die door het produceren van een decollete-signaal dat is aantoonbaar uit host urine en discrimineert ziekte protease activiteit in vivo meten.

Nanosensors om te detecteren Protease activiteit In Vivo Noninvasive Diagnostics

Hier beschrijven we een hoge gegevensdoorvoer methode voor uitgebreide drug surveillance waarmee voor de betere resolutie en detectie van grote panelen van drugs van misbruik en hun metabolieten, met kwaliteitscontrole op basis van multisegment injectie-capillair elektroforese-massaspectrometrie.

High-throughput en uitgebreide Drug Surveillance met behulp van spectrometrie van de massa van het Multisegment injectie-capillaire elektroforese

Peilstok urineonderzoek is een snelle en betaalbare methode om iemands persoonlijke gezondheidstoestand te beoordelen. We presenteren een methode om nauwkeurige, goedkope peilstok urineonderzoek uit te voeren die de primaire bronnen van fouten verwijdert die verband houden met traditionele dip-and-wipe-protocollen en eenvoudig genoeg is om thuis door lekengebruikers te worden uitgevoerd.

Goedkope, volumegestuurde peilstok urineonderzoek voor thuistests

Toegang tot gedecentraliseerde, goedkope en hoogwaardige diagnostiek die in de gemeenschap kan worden ingezet voor gedecentraliseerde tests is van cruciaal belang voor het bestrijden van wereldwijde gezondheidscrises. Dit manuscript beschrijft hoe op papier gebaseerde diagnostiek kan worden gebouwd voor virale RNA-sequenties die kunnen worden gedetecteerd met een draagbare optische lezer.

Ontwerp-tot-implementatiestudie voor ontwikkeling en patiëntvalidatie van op papier gebaseerde sleufschakelaardiagnostiek

In dit werk werd een snelle, gevoelige en draagbare detectiemethode voor Candidatus Liberibacter asiaticus ontwikkeld op basis van recombinasepolymeraseversterking in combinatie met CRISPR-Cas12a.

In het veld inzetbare Candidatus Liberibacter asiaticus detectie met behulp van recombinase polymerase amplificatie in combinatie met CRISPR-Cas12a

We presenteren een protocol dat recombinasepolymeraseamplificatie combineert met een CRISPR/Cas12a-systeem voor sporendetectie van DNA-virussen en draagbare smartphonemicroscopie bouwt met een door kunstmatige intelligentie ondersteunde classificatie voor point-of-care DNA-virusdetectie.

DNA-virusdetectiesysteem op basis van RPA-CRISPR/Cas12a-SPM en deep learning

Hier presenteren we de stapsgewijze voorbereiding van voorgemengde, gevriesdroogde recombinase-gebaseerde isotherme amplificatie en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR)-gebaseerde reacties, die kunnen worden gebruikt voor de detectie van nucleïnezuurbiomarkers van infectieziekteverwekkers of andere genetische markers van belang.

Point-of-care diagnostiek op basis van CRISPR met voorgemengde en gevriesdroogde reagentia

Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle procedure voor het detecteren van DNA van bijenpathogenen, zoals Lotmaria passim en Nosema ceranae, met behulp van een amplificatie-ready cellysis, recombinasepolymeraseamplificatie en CRISPR/Cas12a-assays.

On-site DNA-detectie van trypanosomatide parasieten en Nosema ceranae door middel van alkalische lysis gekoppeld aan RPA/CRISPR/Cas12a-systeem

Leer een CRISPR-Cas-gemedieerde multianalyte synthetische urine biomarker test voor punt-van-zorg kankerdiagnostiek. Deze methode detecteert meerdere ziektesignalen tegelijk met DNA-barcodes.

CRISPR-Cas-gemedieerde Multianalyte Synthetische Urine Biomarker Test voor Draagbare Diagnostiek

Meer video's verkennen