Name: Streptavidin-Affinity Grid Fabricage voor Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 51 s
Description: Leer hoe je streptavidine-affiniteitsroosters maakt voor cryo-EM samplevoorbereiding. Deze methode stabiliseert gebiotinyliseerde eiwitten en vermindert denaturatie en oriëntatieproblemen tijdens het bevriezen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

TC werd ondersteund door de opleidingsbeurs voor moleculaire biofysica GM-08295 van het National Institute of General Medical Sciences en de National Science Foundation graduate research fellowship onder subsidienummer DGE 2146752. R.G. en B.H. werden gesteund door de National Institute of Health-subsidie R21-GM135666 toegekend aan R.G. en B.H. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door de subsidie R35-GM127018 van het National Institute of General Medical Sciences, toegekend aan E.N. E.N. is een onderzoeker van het Howard Hughes Medical Institute.

Fabricage van streptavidine affiniteitsroosters voor cryo-EM structurele studies

<ol><li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGlaeser%2C+RM+%22Single-particle+Cryo-EM+of+Biological+Macromolecules.+IOP+Publishing%22">Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing</a>. , IOP Publishing. Bristol, UK. (2021).</li>
<li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+outcomes+when+optimizing+%27standard%27+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li>
<li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D-Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li>
<li>Noble, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routine+single+particle+cryoEM+sample+and+grid+characterization+by+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Routine single particle cryoEM sample and grid characterization by tomography.</a> eLife. 7, e34257(2018).</li>
<li>Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+graphene+oxide+coating+improves+cryo-EM+sample+preparation+and+data+collection+from+tilted+grids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+robust+covalently+linked+graphene+oxide+affinity+grids+for+high-resolution+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24269-24273 (2020).</li>
<li>Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graphene+oxide%3A+A+substrate+for+optimizing+preparations+of+frozen-hydrated+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples.</a> Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).</li>
<li>Williams, R. C., Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+carbon+support+films+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ultrathin carbon support films for electron microscopy.</a> Science. 175 (4025), 1000-1001 (1972).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+shelf-life+streptavidin+support-films+suitable+for+electron+microscopy+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules.</a> Journal of Structural Biology. 195 (2), 238-244 (2016).</li>
<li>Han, B. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+biotinylated+protein+complexes+bound+to+streptavidin+monolayer+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of biotinylated protein complexes bound to streptavidin monolayer crystals.</a> Journal of Structural Biology. 180 (1), 249-253 (2012).</li>
<li>Domínguez-Martín, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li>
<li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393(2021).</li>
<li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li>
<li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+carbon+films+with+%7E+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li>
<li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Education%22%5BJournal%5D)">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638(1988).</li>
<li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MotionCor2%3A+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li>
</ol>

Ons protocol beschrijft hoe streptavidine-affiniteitsrasters moeten worden gemaakt en gebruikt en hoe de gegevens die het streptavidine-diffractiesignaal bevatten, moeten worden verwerkt. Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol die speciale aandacht vereisen.
Mislukte rasterbatches zijn terug te voeren op verschillende veelvoorkomende fouten. De meest voorkomende bron van fouten komt voort uit het gebruik van verouderde reagentia of reagentia van slechte kwaliteit. Het is vooral belangrijk om de gebiotinyleerde lipide-oplossing precies zo te bereiden als beschreven in het protocol. Verder kunnen eventuele onzuiverheden, zoals wasmiddelresten op het laboratoriummateriaal of van nature aanwezige oliën op de huid, de kwaliteit van de streptavidinkristallen en dus de kwaliteit van de resulterende beelden beïnvloeden. Het wordt daarom aanbevolen om vóór de eerste koolstofverdamping drie wascycli voor de roosters uit te voeren om mogelijke verontreiniging van oppervlakteactieve stoffen door de fabrikant van het rooster te verwijderen (stap 2.1). Bovendien is waargenomen dat verontreiniging of onzuiverheid van de ricinusolie de kristalvorming op het rooster belemmert.
Het maken en oppakken van de lipide monolaag is een taak die een paar keer moet worden geoefend om een gevoel te krijgen voor de kleine lipidevolumes. Het is niet ongebruikelijk dat deze stap de eerste twee of drie keer mislukt voordat een adequate lipidemonolaag kan worden geproduceerd, zoals uiteindelijk wordt weerspiegeld in de kwaliteit van streptavidinekristallen die worden gezien in negatief gekleurde roosters (Figuur 4C).
Het is belangrijk om de achterkant (gouden kant, lipidezijde) van het rooster nooit nat te laten worden tijdens het fabricageproces van het rooster (stappen 3.12-3.20). In het geval dat de achterkant toch nat wordt, is het aan te raden om het rooster weg te gooien. Dit kan resulteren in het verschijnen van grote lipideblaasjes die de beeldkwaliteit verstoren (Figuur 5D) (Rij 3, Tabel 1). Lipideblaasjes kunnen ook worden waargenomen als gevolg van onvoldoende wassen nadat de lipide monolaag is aangebracht (stap 3.13). Drie opeenvolgende wasbeurten met kristallisatiebuffer worden aanbevolen na het aanraken van de lipide-monolaag voorafgaand aan het toevoegen van streptavidine.
Nadat een dunne laag koolstof is verdampt op in trehalose ingebedde roosters, kan de achterkant van het rooster nat worden zonder de kwaliteit van het rooster te beschadigen. Bevochtiging van de achterkant wordt bijvoorbeeld vaak waargenomen wanneer de monsterbuffer zelfs maar minimale hoeveelheden wasmiddel bevat. Bevochtiging van de achterkant door het monster kan resulteren in niet-specifieke binding van monsters aan de dunne koolstoffilm aan de achterkant, wat de effectiviteit vermindert van het voorkomen dat deeltjes diffunderen naar het lucht-watergrensvlak of het gebruik van affiniteitsbinding voor zuiveringsstrategieën op het net. Voeg indien mogelijk het monster toe aan het rooster als er geen wasmiddel is. Wasmiddel en andere additieven kunnen vervolgens worden toegevoegd tijdens de wasstappen van het rooster of in een laatste stap vóór de vitrificatie. Dit is een beperking van het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters; Als het doel echter is om de voorkeursoriëntatie te verbeteren, is de monstervoorbereiding met buffers, inclusief wasmiddel, met succes uitgevoerd11.
Een veel voorkomende bron van fouten is terug te voeren op de ouderdom van de roosters ten opzichte van beide koolstofverdampingsstappen (stap 2.3 en stap 3.21). In dit protocol is de aanbevolen wachttijd 5-7 dagen na de koolstofverdamping aan de achterkant voordat streptavidineroosters voor cryo-EM worden gebruikt. Wanneer roosters te snel na fabricage worden gebruikt, is waargenomen dat het rooster en de lipide-monolaag uit de roostergaten mobiliseren. Een soortgelijke waarneming kan worden gedaan wanneer de roosters te oud zijn en na zes maanden worden gebruikt (figuur 5A) (rij 1, tabel 1). We veronderstellen dat deze waarneming wordt verklaard door veranderingen in de hydrofobiciteit van de koolstofrug die wordt toegepast om de lipide monolaag en streptavidine kristallen te stabiliseren. Bovendien kunnen streptavidineroosters mozaïek lijken (figuur 5B) (rij 3, tabel 1) en gebroken zijn in zowel negatieve-kleuring als cryo-EM als de monolaag wordt aangebracht op roosters waar de eerste koolstofverdampingslaag (stap 2.3) niet voldoende is verouderd.
Een andere veel voorkomende bron van fouten kan worden herleid tot de kwetsbaarheid van de kristallijne monolaag van streptavidine (de lipidemonolaag is zelf vloeibaar en kan omkeerbaar uitzetten of samendrukken). De koolstofverdamping aan de achterkant (stap 3.21) zorgt voor kritische stabiliteit van zowel de monolaag als het streptavidinrooster tijdens het adsorptie-, was- en cryo-EM-blottingproces van het monster. Bij gebrek aan voldoende koolstofverdamping aan de achterkant van het rooster, zullen streptavidineroosters vaak gefragmenteerd lijken na deppen/bevriezen (Figuur 5C) (Rij 2, Tabel 1). In dit protocol raden we het gebruik van een eenzijdige geautomatiseerde dompelvriezer aan voor enkelzijdig blotting. Deze methode levert zeer reproduceerbare blotting-condities op die het streptavidinerooster behouden tijdens het invriesproces en een gestroomlijnde optimalisatie van de monstertoepassing en blotting-parameters mogelijk maken. Als alternatief zijn andere geautomatiseerde invriesapparaten gebruikt in combinatie met handmatig deppen. Om dit te doen, wordt de eigenlijke blotting-functie uitgeschakeld in de apparaatinstellingen en wordt het raster in plaats daarvan gedept door met een pincet vloeipapier door de zij-ingang te reiken. Met deze methode kunnen hoogwaardige resultaten worden behaald voor laboratoria zonder een enkelzijdig apparaat voor blotting en invriezen; De reproduceerbaarheid van raster tot net is echter een uitdaging.
Hoewel het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters veel voordelen heeft, moet rekening worden gehouden met enkele beperkingen van deze methode. Vanwege de aard van de procedure is het meestal niet mogelijk om de kwaliteit van het streptavidinrooster te beoordelen totdat het hele proces is voltooid. Er wordt voorgesteld om de kwaliteit van elke batch snel te screenen op negatieve kleuring voordat monsters worden ingevroren. Vanwege het signaal dat door het streptavidinrooster aan de onbewerkte beelden wordt bijgedragen, kan het in sommige gevallen een uitdaging zijn om op basis van de beelden alleen te beoordelen of er voldoende intacte, verspreide deeltjes zijn. Om dezelfde reden is on-the-fly verwerking van cryo-EM-gegevens tijdens data-acquisitie niet mogelijk, tenzij de procedure voor het aftrekken van het streptavidinesignaal is opgenomen in de datavoorverwerkingspijplijn. Omdat het streptavidine-signaal meestal wordt afgetrokken van de bewegingsgecorrigeerde beelden en niet van de frames zelf, kan Bayesiaans polijsten, zoals geïmplementeerd in populaire softwaresuites, mislukken bij het gebruik van de aftrekprocedures zoals beschreven. Het wordt daarom aanbevolen om bewegingscorrectie in meerdere patches uit te voeren om de beweging van deeltjes vanaf het begin van de gegevensverwerking te minimaliseren16.
Ondanks deze beperkingen bieden streptavidine-affiniteitsroosters veel voordelen. Twee grote voordelen die streptavidine-affiniteitsroosters bieden ten opzichte van standaard cryo-EM-roosters met open gaten, zijn een middel om monsters te beschermen tegen het lucht-watergrensvlak en om monsters met een lage abundantie (10-100 nM) op het rooster te concentreren. Andere steunlagen, zoals koolstof en grafeenoxide, kunnen ook worden gebruikt als strategieën om deze knelpunten bij de monstervoorbereiding te overwinnen. In één voorbeeld waren streptavidine-affiniteitsroosters de enige oplossing voor het verkrijgen van een intacte reconstructie van een eiwit-nucleïnezuurinteractie die onverenigbaar was met cross-linking-benaderingen. 12 okt.
Een ander groot voordeel dat streptavidine-affiniteitsroosters bieden, is een oplossing voor monsters die adsorberen aan andere steunlagen, zoals koolstof of grafeenoxide, met voorkeursoriëntaties die het vermogen belemmeren om een 3D-reconstructie van het monster van belang te verkrijgen. Willekeurige biotinylering van monsters met behulp van in de handel verkrijgbare kits maakt het mogelijk om het monster van belang willekeurig aan de streptavidine-monolaag te hechten om meer potentiële weergaven te verkrijgen om deze uitdaging te overwinnen.
Bovendien bieden streptavidine-affiniteitsroosters voordelen die uniek zijn voor op affiniteit gebaseerde rasters. De hoge affiniteit en specificiteit van de streptavidine-biotine-interactie maken de koppeling van streptavidine-affiniteitsroosters mogelijk met andere workflows waarbij biotine betrokken is om interessante complexen te zuiveren. In een gepubliceerd voorbeeld immobiliseerden de auteurs een complex op streptavidine-affiniteitsrasters en incubeerden ze een bindingspartner van onbekende stoichiometrie in grote overmaat. Na het afwassen van een ongebonden eiwit werd het correct geassembleerde supercomplex verkregen en kon het onmiddellijk worden geanalyseerd met cryo-EM11. Een mogelijke toekomstige toepassing kan zijn om streptavidine-bindende eiwitlabels, het Avi-tag-systeem of nabijheidslabelingbenaderingen te combineren met streptavidine-affiniteitsroosters om afzonderlijke eiwitten en/of eiwitcomplexen rechtstreeks uit recombinante of endogene bronnen te extraheren zonder standaard uitgebreide zuiveringsschema's.
Door dit protocol aan te bieden, zouden laboratoria in staat moeten zijn om de fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters gemakkelijk te reproduceren en ze vast te stellen als een meer algemeen gebruikt hulpmiddel voor structurele analyse van eiwitcomplexen door cryo-EM.

Elektronencryomicroscopie (cryo-EM) heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van structurele biologie door macromoleculaire structuurbepaling mogelijk te maken van grote, flexibele en heterogene monsters die voorheen ontoegankelijk waren door röntgenkristallografie of nucleaire magnetische resonantie1. Deze methode werkt door macromoleculen in oplossing snel te bevriezen om een dunne laag glasachtig ijs te creëren die vervolgens kan worden afgebeeld met een elektronenmicroscoop. In de afgelopen jaren hebben aanzienlijke vorderingen in zowel microscoophardware als beeldverwerkingssoftware de soorten monsters die geschikt zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie door cryo-EM verder uitgebreid.
Niettemin blijft de bereiding van dunne, verglaasde monsters een van de meest kritische stappen in de bepaling van de macromoleculaire structuur door cryo-EM. Biologische monsters zijn vaak dynamisch, kwetsbaar, vatbaar voor denaturatie en soms alleen in kleine hoeveelheden beschikbaar voor cryo-EM-onderzoeken. Tijdens het blottingproces interageren deze deeltjes met de hydrofobe lucht-waterinterface, wat kan resulteren in deeltjesvoorkeursoriëntaties, demontage van fragiele complexen, gedeeltelijke of volledige denaturatie van monsters en aggregatie 2,3,4. Het gebruik van detergenten of andere oppervlakteactieve stoffen, chemische verknoping en adsorptie van monsters om lagen te ondersteunen, zijn veelgebruikte strategieën om biologische monsters tijdens het invriesproces te bewaren. Steunlagen zoals grafeenoxide 5,6,7 of amorfe koolstof8 functioneren ook om deeltjes op het rooster te concentreren door adsorptie wanneer het monster in beperkte hoeveelheden beschikbaar is. Deze methoden zijn echter niet algemeen of betrouwbaar, en optimalisatie van de netvoorbereiding kan extreem tijdrovend zijn of helemaal mislukken.
Streptavidine affiniteitsroosters 9,10 werden ontwikkeld om deze tekortkomingen te verhelpen en om een milde en algemeen toepasbare methode te bieden om het complex van belang te sekwestreren en te beschermen tegen het lucht-watergrensvlak. Deze roosters maken gebruik van een tweedimensionaal (2D) streptavidine-kristalrooster dat wordt gekweekt op een monolaag van gebiotinyleerde lipiden op het rooster. Nadat monsters zelf zijn gebiotinyleerd (vaak spaarzaam en willekeurig, wat betekent dat er gemiddeld één biotine per complex is), kunnen ze worden aangebracht op het met streptavidine beklede rooster. Omdat monsteradsorptie afhankelijk is van de extreem hoge affiniteit tussen streptavidine en biotine, kunnen monsterconcentraties van slechts 10 nM met deze roosters worden gebruikt. In de handel verkrijgbare biotinylatiekits voor eiwitten en gebiotinyleerde primers voor DNA-bevattende complexen maken het relatief eenvoudig om de nodige biotinegroepen aan de meeste interessante monsters te hechten. Naast het concentreren van het monster en het weghouden van het schadelijke lucht-watergrensvlak tijdens het deppen, kan de willekeurige biotinylering van een of slechts enkele lysineresiduen het bereik van oriëntaties van het betreffende molecuul op het cryo-EM-rooster aanzienlijk verbeteren, zoals aangetoond in een aantal onderzoeken11. Hoewel het signaal van het onderliggende streptavidinkristal aanwezig is in de onbewerkte beelden, kunnen gegevensverwerkingsschema's met Fourier-filtratie van de scherpe Bragg-reflecties van het kristal gemakkelijk worden verwijderd tijdens vroege gegevensverwerking, waardoor uiteindelijk reconstructies met hoge resolutie van het monster van belang mogelijk worden 11,12,13. Hier wordt een geoptimaliseerd, stapsgewijs protocol geleverd voor een robuuste productie van streptavidine-affiniteitsroosters en vervolgens gebruik in cryo-EM-experimenten. Het verstrekte protocol zal naar verwachting over een periode van 2 weken worden voltooid (figuur 1A). De eerste delen van het protocol beschrijven de bereiding van reagentia, de voorbehandeling van roosters en de eerste stappen van koolstofverdamping. Vervolgens worden instructies beschreven voor de bereiding van de lipide monolaag en de groei van streptavidinekristallen op EM-roosters. Daarnaast worden instructies gegeven voor het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters in EM- en cryo-EM-experimenten met negatieve kleuring. Ten slotte zijn er procedures voorzien voor het verwijderen van streptavidine-signalen uit microfoto's zodra cryo-EM-gegevens zijn verkregen.

<table><tbody><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- fosfoethanolamine-N-(biotinyl) natriumzout&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285P</td><td>Komt als poeder. Oplossen op een concentratie van 1&ndash;10 mg/mL&nbsp; in chloroform/methanol/water oplosmiddel, 65:35:8 v/v en bewaar in gebruiksklare porties bij -80 &deg;C</td></tr><tr><td>200 proof pure ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>5 &mu;L Hamilton-spuit&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>87930</td><td>5 &micro;L Microliter-spuit Model 75 RN, kleine verwisselbare naald, 26 G, 2 in, puntstijl 2</td></tr><tr><td>Ricinolusolie</td><td>Sigma Adrich</td><td>259853</td><td></td></tr><tr><td>Onbehandelde celkweekschalen (35 mm)</td><td>Bio Basic</td><td>SP22146</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Trehalose dihydraat, uit zetmeel, &ge;99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T9449</td><td></td></tr><tr><td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (zelfsluitende) pincet Biology Grade</td><td>Ted Pella</td><td>510-5NM</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Grade Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputtering Coater</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R 2/1 Au300&nbsp;</td><td>Quantifoil</td><td>Q84994</td><td></td></tr><tr><td>Steptavidin</td><td>New England Bioscience</td><td>N7021S</td><td>Komt als 1 mg/mL oplossing. Verdun tot een eindconcentratie van 0,5 mg /mL in kristallisatiebuffer met een uiteindelijke trehalose-concentratie van 10%. Kan worden geflashfrozen in 25&ndash;50 &mu;L porties</td></tr><tr><td>Talkpoeder&nbsp;</td><td>Carolina</td><td>896060</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Grade 1 filterpapier</td><td>Cytiva</td><td>1001-085</td><td></td></tr></tbody></table>

streptavidin-affinity grid fabricage voor cryo-electron microscopy sample preparation

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Streptavidine-affiniteitsroosters bieden strategieën om veel voorkomende uitdagingen op het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) monstervoorbereiding te overwinnen, waaronder monsterdenaturatie en voorkeursoriëntaties die kunnen optreden als gevolg van de lucht-waterinterface. Streptavidine-affiniteitsroosters worden momenteel echter door weinig cryo-EM-laboratoria gebruikt omdat ze niet in de handel verkrijgbaar zijn en een zorgvuldig fabricageproces vereisen. Tweedimensionale streptavidinekristallen worden gekweekt op een gebiotinyleerde lipidemonolaag die rechtstreeks wordt aangebracht op standaard holey-carbon cryo-EM-roosters. De interactie met hoge affiniteit tussen streptavidine en biotine maakt het mogelijk om vervolgens gebiotinyleerde monsters te binden die tijdens de cryo-EM-monstervoorbereiding worden beschermd tegen de lucht-waterinterface. Bovendien bieden deze roosters een strategie voor het concentreren van monsters die in beperkte hoeveelheden beschikbaar zijn en het zuiveren van eiwitcomplexen die van belang zijn, direct op de roosters. Hier wordt een stapsgewijs, geoptimaliseerd protocol geboden voor de robuuste fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters voor gebruik in cryo-EM- en negatieve-kleuringsexperimenten. Daarnaast is er een gids voor het oplossen van problemen opgenomen voor veelvoorkomende uitdagingen om het gebruik van streptavidine-affiniteitsroosters toegankelijker te maken voor de grotere cryo-EM-gemeenschap.

Na de koolstofverdamping in stap 3.21 (meestal na een week) kunnen streptavidinaffiniteitroosters worden gebruikt voor de voorbereiding van cryo-EM- of negatieve-kleurstofmonsters volgens de procedures beschreven in stap 4 en 5. Een representatieve microfoto gemaakt met behulp van een K3-detector op een titaan Krios met een vergroting van 81.000x met een pixelgrootte van 1,05 Å van een gebiotinyleerd monster ingevroren met streptavidine-affiniteitsroosters wordt weergegeven in figuur 4A. Succesvolle roostervorming wordt waargenomen door het continue rasterpatroon dat op de achtergrond van het beeld verschijnt. Dit kan gemakkelijker worden waargenomen door het diffractiepatroon dat verschijnt in de snelle Fouriertransformatie (FFT) die wordt weergegeven in figuur 4A (rechts). Na het verzamelen van gegevens, volgens de procedure beschreven in stap 6 van dit protocol, kan het signaal dat door het streptavidinrooster aan het beeld wordt bijgedragen, computationeel worden gemaskeerd om een afgetrokken microfoto te produceren (Figuur 4B) die kan worden gebruikt voor volgende gegevensverwerkingsstappen. De FFT in figuur 4B (rechts) laat zien dat het diffractiepatroon dat in figuur 4A (rechts) is waargenomen, met succes uit de oorspronkelijke afbeelding is verwijderd.
Figuur 4C toont een voorbeeld van een microfoto gemaakt met een Tecnai 12-microscoop bij een vergroting van 49.000x met een pixelgrootte van 1,6 Å van een gebiotinyleerd monster gebonden aan streptavidine-affiniteitsroosters en negatief gekleurd met behulp van uranylformiaat. De roosters werden opgesteld volgens de procedure die in stap 4 van dit protocol is beschreven, waardoor een dikkere vlekfilm achterbleef.
Er zijn verschillende veelvoorkomende observaties wanneer de fabricageprocedure van het streptavidinerooster niet succesvol is, die verder worden beschreven in het discussiegedeelte en tabel 1. Figuur 5 toont enkele voorbeelden van deze waarnemingen. Figuur 5A toont een microfoto van een negatief gekleurd streptavidine-affiniteitsraster dat is gebruikt uit een batch die meer dan zes maanden oud is gemaakt. De monolaag is gemobiliseerd uit de gaten in de koolstoffolie van de quantifoil-roosters en wordt waargenomen met vergelijkbare afmetingen als de gaten in het rooster. Figuur 5B toont een voorbeeld van streptavidinekristallen met een hoge mozaïciteit die gemakkelijk verstoord raken tijdens monstervoorbereidingsprocedures. Figuur 5C toont een representatieve microfoto van een streptavidine-affiniteitsraster waarin de koolstofverdamping in stap 3.21 te dun is of weggelaten. Het streptavidinrooster is gefragmenteerd geraakt tijdens het cryo-EM-monstervoorbereidingsproces. Figuur 5D toont een negatief gekleurd streptavidine-affiniteitsrooster dat verontreiniging heeft door lipideblaasjes, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende wasbeurten tijdens stap 3.13 of het nat worden van de gouden kant van het rooster tijdens stap 3.13-3.20. Raadpleeg het discussiegedeelte en tabel 1 voor strategieën om deze veelvoorkomende problemen op te lossen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de fabricageprocedure van het streptavidine-affiniteitsraster. (A) Overzichtstijdlijn van de fabricageprocedure van het streptavidine-affiniteitsraster. De hele procedure kan gedurende twee weken worden voltooid, waarbij twee koolstofverdampingsstappen nodig zijn en een week na elk om de koolstof voldoende te laten verouderen. (B) Ingezoomd op een rastervierkant van een streptavidine-affiniteitsraster met de lagen waaruit het raster bestaat na voltooiing van het fabricageproces, inclusief het standaard cryo-EM-raster met goudstaven en holey-koolstoffilm, de eerste verdampte koolstoflaag, lipidemonolaag, 2D-streptavidinekristal en de achterste verdampte koolstofondersteuningslaag. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> Figuur 2: Lipide monolaag en streptavidine kristallisatie (A) Afbeeldingen die laten zien hoe de lipide monolaag in de kleine petrischaal met succes kan worden gevormd met behulp van talkpoeder om een grens te creëren voor de ricinusolie die een constante oppervlaktedruk creëert tijdens het vormen van de lipide monolaag. (B) Afbeeldingen die laten zien hoe streptavidinekristallen op cryo-EM-roosters kunnen worden gekweekt. Eerst wordt de koolstofzijde van de roosters aangeraakt tot aan de lipide monolaag en gevolgd door drie opeenvolgende wasbeurten in de kristallisatiebuffer. Streptavidine wordt toegevoegd en roosters worden gedurende 2 uur in een vochtigheidskamer geïncubeerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> Figuur 3: Voorbeeldparameters voor het process_subtraction.cfg-bestand voor het aftrekken van streptavidineroosters van microfoto's (stap 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve resultaten van succesvolle fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters. (A) Cryo-EM-microfoto van gebiotinyleerde eiwit/nucleosoomcomplexen, bereid met zelfgemaakte streptavidine-affiniteitsroosters. De FFT is rechts afgebeeld en toont het streptavidinekristaldiffractiepatroon. (B) Dezelfde microfoto als in paneel A wordt getoond na de procedure voor het aftrekken van het rooster om het signaal van het 2D-streptavidinkristal uit het originele beeld te verwijderen. (C) Een voorbeeld van een microfoto verkregen door negatieve kleuring van een gebiotinyleerd monster gebonden aan streptavidin-affiniteitsroosters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve resultaten van mislukte fabricage van streptavidine-affiniteitsroosters. (A) Microfoto van de mobilisatie van de streptavidine-monolaag uit de roostergaten wanneer de roosters ouder zijn dan zes maanden. (B) Microfoto met streptavidinroosters met een hoge mozaïekiteit die gemakkelijk kunnen worden beschadigd tijdens zowel cryo-EM- als minatieve-kleurstofmonstervoorbereidingsprocedures. (C) Microfoto van de fragmentatie van het streptavidinrooster tijdens de voorbereiding van het cryo-EM-monster wanneer de koolstofverdampingslaag in stap 3.21 te dun is of is weggelaten. (D) Representatieve microfoto die besmet is met lipideblaasjes, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende wassen tijdens stap 3.13 of het nat worden van de gouden kant van het rooster tijdens stap 3.13-3.20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Tabel 1: Gids voor het oplossen van problemen om veelvoorkomende uitdagingen te overwinnen die zich voordoen bij de fabricage van niet-succesvolle streptavidine-affiniteitsrasters. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">Klik hier om deze tabel te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend coderingsbestand 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Een stapsgewijs protocol voor het vervaardigen van streptavidine-affiniteitsroosters wordt geleverd voor gebruik in structurele studies van uitdagende macromoleculaire monsters door cryo-elektronenmicroscopie.

Streptavidin-Affinity Grid Fabricage voor Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

Er zijn veel recente technologische ontwikkelingen geweest op het gebied van cryo-EM, waaronder verbeteringen in de microscoophardware zelf die de algehele kwaliteit van de beelden verbeteren, en ook ontwikkelingen in software die worden gebruikt om de cryo-EM-beelden te verwerken die kunnen beginnen met het omgaan met de grote hoeveelheden heterogeniteit die in veel van de monsters aanwezig zijn. De monstervoorbereiding blijft een van de grootste knelpunten in cryo-EM. De monsterhoeveelheid kan beperkend zijn en eiwitten hebben de neiging om tijdens vitrificatie te absorberen aan het hydrofobe lucht-watergrensvlak.Dit kan leiden tot denaturatie van monsters, het afbreken van grotere eiwitcomplexen en voorkeursoriëntaties van deeltjes die aanwezig zijn in de cryo-EM-beelden. Deze roosters maken gebruik van de interactie met hoge affiniteit tussen streptavidine en biotine om gebiotinyleerde monsters aan elkaar te binden en ze te beschermen tegen de hydrofobe lucht-waterinterface. We kunnen werken met zeer lage monsterhoeveelheden, en willekeurige biotine-opgetogenheid van monsters biedt een strategie om problemen met voorkeursoriëntatie te overwinnen die kunnen worden waargenomen bij het gebruik van andere ondersteuningslagen.

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Het protocol beschrijft een high-throughput benadering voor het bepalen van de structuren van membraaneiwitten met behulp van cryo-electron tomografie-en 3D-beeldverwerking. Het omvat de details van prepareren, data verzamelen, data verwerken en interpreteren, en afgesloten met het vervaardigen van een vertegenwoordiger doelstelling voor de aanpak, de HIV-1 Envelop glycoproteïne. Deze computationele procedures zijn ontworpen op een manier die onderzoekers en studenten in staat stelt om op...

Bepaling van de moleculaire structuren van HIV envelop glycoproteïnen met behulp van Cryo-electron tomography en geautomatiseerde Sub-tomogram Middeling

Een instrument en methoden voor de bereiding van de monster nanoliter middelgrote volumes voor transmissie-elektronenmicroscopie wordt gepresenteerd. Er zijn geen papier-bevlekken stappen vereist, dus het vermijden van de schadelijke gevolgen dat voor eiwitten hebben kan, aanzienlijk verminderen monster verlies en de analyse van eencellige lysate voor visuele proteomics inschakelen.

Verkleinde monstervoorbereiding voor transmissie-elektronenmicroscopie

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het voorbereiden van monsterrasters bij temperaturen tot 70 °C, voorafgaand aan het invriezen van de duik voor cryo-EM-experimenten.

Voorbereiding van hoge temperatuur monsterroosters voor Cryo-EM

Hier presenteren we een pijplijn voor 3D-correlatieve gerichte ionenbundelfrezen op het begeleiden van de voorbereiding van cellulaire monsters voor cryo-elektronentomografie. De 3D-positie van fluorescerend gelabelde eiwitten van belang wordt eerst bepaald door cryo-fluorescentiemicroscopie en vervolgens gericht op frezen. Het protocol is geschikt voor zoogdieren, gisten en bacteriële cellen.

Monstervoorbereiding door 3D-correlatieve gefocuste ionenbundelfrezen voor cryo-elektronentomografie met hoge resolutie

De peel-blot-techniek is een cryo-EM-rastervoorbereidingsmethode die het mogelijk maakt om meerlagige en geconcentreerde biologische monsters in enkele lagen te scheiden om de dikte te verminderen, de monsterconcentratie te verhogen en de beeldverwerking te vergemakkelijken.

De Peel-Blot-techniek: een cryo-EM-monstervoorbereidingsmethode om enkele lagen te scheiden van meerlagige of geconcentreerde biologische monsters

Deze methode biedt een toegankelijk en flexibel protocol voor de voorbereiding van elektronenmicroscopieroosters (EM) voor in situ cellulaire cryotomografie en correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM).

Monstervoorbereiding voor in situ cryotomografie van zoogdiercellen

Hier beschrijven we een protocol voor het aanbrengen van een enkele monolaag grafeen op elektronenmicroscopieroosters en hoe deze voor te bereiden op gebruik bij cryoEM-structuurbepaling.

Fabricage van monolayer grafeen-gecoate roosters voor cryo-elektronenmicroscopie

Dit protocol presenteert een praktische methode met Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) als voorbeeld om ongelijke deeltjesverdeling aan te pakken door optimalisatie van de monstervoorbereiding, en biedt een referentie voor onderzoekers om macromoleculaire structuren efficiënt op te helderen met behulp van cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM).

Optimalisatie van monstervoorbereiding voor cryogene elektronenmicroscopie

Leer hoe je streptavidine-affiniteitsroosters maakt voor cryo-EM samplevoorbereiding. Deze methode stabiliseert gebiotinyliseerde eiwitten en vermindert denaturatie en oriëntatieproblemen tijdens het bevriezen.

Streptavidin-Affinity Grid Fabricage voor Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

Meer video's verkennen