Name: Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Leer intravitale twee-fotonmicroscopie van glioblastoom in een muizenmodel. Deze methode maakt real-time beeldvorming van nanopartikelaccumulatie mogelijk om geneesmiddelafgifte over de bloed-hersenbarrière te optimaliseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen de Stanford Wu Tsai Neuroscience Microscopy Service, het Stanford Center for Innovations in In Vivo Imaging (SCi3) - centrum voor beeldvorming van kleine dieren, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) en Stanford Preclinical Imaging Facility in Porter Drive bedanken voor het leveren van de apparatuur en infrastructuur voor dit project. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Institute for Child Health and Human Development, subsidienummer R01HD103638. We willen de Schnitzer Group, Stanford University, bedanken; het Zuo-lab, Universiteit van Santa Cruz; en het Neurovascular Imaging Laboratory, Boston Photonic Center, University of Boston, voor educatieve discussies over beeldvorming met twee fotonen en craniale raammodellen.

Real-time tracking van nanodeeltjes in hersentumoren met behulp van 2P-IVM bij muizen

<ol><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li>
<li>Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transpupillary+two-photon+in+vivo+imaging+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.</a> J Vis Exp. 168, 61970(2021).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+microscopy+reveals+the+contribution+of+Sox9%2B+to+kidney+regeneration+in+a+mouse+model+with+extracellular+vesicle+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon microscopy reveals the contribution of Sox9+ to kidney regeneration in a mouse model with extracellular vesicle treatment.</a> J Biol Chem. 295 (34), 12203(2020).</li>
<li>Jang, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+of+Paneth+cells+in+the+small+intestine+of+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy of Paneth cells in the small intestine of live mice.</a> Sci Rep. 8 (1), 14174(2018).</li>
<li>Ihler, F., Bertlich, M., Weiss, B., Dietzel, S., Canis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+allows+imaging+and+characterization+of+cochlear+microvasculature+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy allows imaging and characterization of cochlear microvasculature in vivo.</a> Biomed Res Int. 2015, 154272(2015).</li>
<li>Matsuura, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+with+two-photon+microscopy+reveals+cellular+dynamics+in+the+ischeamia-reperfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging with two-photon microscopy reveals cellular dynamics in the ischeamia-reperfused rat heart.</a> Sci Rep. 8 (1), 15991(2018).</li>
<li>Veres, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intubation-free+in+vivo+imaging+of+the+tracheal+mucosa+using+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Intubation-free in vivo imaging of the tracheal mucosa using two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 7 (1), 694(2017).</li>
<li>Zong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+two-photon+calcium+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice.</a> Cell. 185 (7), 1240-1256.e30 (2022).</li>
<li>Takasaki, K., Abbasi-Asl, R., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superficial+bound+of+the+depth+limit+of+two-photon+imaging+in+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Superficial bound of the depth limit of two-photon imaging in mouse brain.</a> eNeuro. 17 (1), (2019).</li>
<li>Birkner, A., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+imaging+in+vivo+with+a+red-shifted+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon imaging in vivo with a red-shifted calcium indicator.</a> Methods Mol Biol. 1929, 15-26 (1929).</li>
<li>Busche, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+hippocampal+neurons+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo two-photon calcium imaging of hippocampal neurons in Alzheimer mouse models.</a> Methods Mol Biol. 1750, 341-351 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+two-photon+probe+to+selectively+detect+monoamine+oxidase+B+activity+in+Parkinson%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A sensitive two-photon probe to selectively detect monoamine oxidase B activity in Parkinson's disease models.</a> Nat Commun. 5, 3276(2014).</li>
<li>Madden, K. S., Zettel, M. L., Majewska, A. K., Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+tumor+imaging%3A+live+imaging+of+glioma+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Brain tumor imaging: live imaging of glioma by two-photon microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (3), (2013).</li>
<li>Ricard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+dynamics+of+microglial+and+monocyte-derived+cells+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Phenotypic dynamics of microglial and monocyte-derived cells in glioblastoma-bearing mice.</a> Sci Rep. 6, 26381(2016).</li>
<li>Soubéran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+VEGF+blockade+on+the+dynamics+of+the+inflammatory+landscape+in+glioblastoma-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Effects of VEGF blockade on the dynamics of the inflammatory landscape in glioblastoma-bearing mice.</a> J Neuroinflammation. 16 (1), 191(2019).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+vivo+reveals+specific+nanoparticle+target+binding+in+a+syngeneic+glioma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Real-time vivo reveals specific nanoparticle target binding in a syngeneic glioma mouse model.</a> Nanoscale. 14 (15), 5678-5688 (2022).</li>
<li>Wartchow, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+cyclic+AMP+activators+reduces+glioblastoma+growth+and+invasion+as+assessed+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Treatment with cyclic AMP activators reduces glioblastoma growth and invasion as assessed by two-photon microscopy.</a> Cells. 10 (3), 556(2021).</li>
<li>Jiang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+fibrillar+collagen+deposition+associated+with+vascular+elements+in+glioblastoma+multiforme+by+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of fibrillar collagen deposition associated with vascular elements in glioblastoma multiforme by using multiphoton microscopy.</a> J Microsc. 265 (2), 207-213 (2017).</li>
<li>Chen, Z., Ross, J. L., Hambardzumyan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+2-photon+imaging+reveals+distinct+morphology+and+infiltrative+properties+of+glioblastoma-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Intravital 2-photon imaging reveals distinct morphology and infiltrative properties of glioblastoma-associated macrophages.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (28), 14254-14259 (2019).</li>
<li>Zhang, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+human+mesenchymal+stem+cells+with+gold+nanocages+for+in+vitro+and+in+vivo+tracking+by+two-photon+microscopy+and+photoacoustic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Labeling human mesenchymal stem cells with gold nanocages for in vitro and in vivo tracking by two-photon microscopy and photoacoustic microscopy.</a> Theranostics. 3 (8), 532-543 (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Hoeferlin, G. F., Menendez, D. M., Krebs, O. K., Capadona, J. R., Shoffstall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+thermal+damage+from+robot-drilled+craniotomy+for+cranial+window+surgery+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice.</a> J Vis Exp. 189, 64188(2022).</li>
<li>Holtmaat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Heo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+soft%2C+transparent%2C+freely+accessible+cranial+window+for+chronic+imaging+and+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology.</a> Sci Rep. 6, 27818(2016).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+optical+access+to+an+estimated+one+million+neurons+in+the+live+mouse+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Long-term optical access to an estimated one million neurons in the live mouse cortex.</a> Cell Rep. 17 (12), 3385-3394 (2016).</li>
<li>Kılıç, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Front Physiol. 11, 612678(2021).</li>
<li>Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+optical+properties+of+the+mouse+cranium-implications+for+in+vivo+multi+photon+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of optical properties of the mouse cranium-implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy.</a> J Neurosci Methods. 178 (2), 316-322 (2009).</li>
<li>Lu, W., Sun, Q., Wan, J., She, Z., Jiang, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+albumin-conjugated+pegylated+nanoparticles+allow+gene+delivery+into+brain+tumors+via+intravenous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cationic albumin-conjugated pegylated nanoparticles allow gene delivery into brain tumors via intravenous administration.</a> Cancer Res. 66 (24), 11878-11887 (2006).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LDLR-mediated+peptide-22-conjugated+nanoparticles+for+dual-targeting+therapy+of+brain+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">LDLR-mediated peptide-22-conjugated nanoparticles for dual-targeting therapy of brain glioma.</a> Biomaterials. 34 (36), 9171-9182 (2013).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-glioblastoma+efficacy+by+PTX-loaded+PEGylated+poly%28%C9%9B-caprolactone%29+nanoparticles%3A+In+vitro+and+in+vivo+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-glioblastoma efficacy by PTX-loaded PEGylated poly(ɛ-caprolactone) nanoparticles: In vitro and in vivo evaluation.</a> Int J Pharm. 402 (1-2), 238-247 (2010).</li>
<li>Valable, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+MRI+tracking+of+exogenous+monocytes%2Fmacrophages+targeting+brain+tumors+in+a+rat+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">In vivo MRI tracking of exogenous monocytes/macrophages targeting brain tumors in a rat model of glioma.</a> Neuroimage. 40 (2), 972(2008).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototheranostics%3A+Active+targeting+of+orthotopic+glioma+using+biomimetic+proteolipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Phototheranostics: Active targeting of orthotopic glioma using biomimetic proteolipid nanoparticles.</a> ACS Nano. 13 (1), 386-398 (2021).</li>
<li>Asan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+correlates+of+gray+matter+volume+changes+in+magnetic+resonance+morphometry+identified+by+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular correlates of gray matter volume changes in magnetic resonance morphometry identified by two-photon microscopy.</a> Sci Rep. 11, 4234(2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

We presenteren een methode voor real-time in vivo NP-tracking met behulp van 2P-IVM door een craniaal venster om de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide NP's te evalueren. De chirurgische techniek voor deze procedure vereist een vaste hand en geavanceerde experimentele chirurgische vaardigheden. Het is raadzaam om te oefenen met het gebruik van karkassen of fantomen voordat u verder gaat met het ervaren van levende dieren. Als alternatief implementeerden Hoeferlin et al. een robotboor om thermische schade te verminderen, variabiliteit van chirurgische technieken te minimaliseren en chirurgie te standaardiseren22.
De grootte van het venster vertegenwoordigt een andere kritieke parameter. Een groter venster zou beeldvorming van een groter deel van de tumor mogelijk maken met 2P-IVM. In de literatuur zijn maten tussen de 3-7 mm beschreven23. Grotere vensters kunnen echter geen rekening houden met de kromming van de hersenen, wat kan leiden tot verhoogde regionale druk24. Om deze terughoudendheid te overwinnen, kan in plaats daarvan een zogenaamde "glazen schedel" worden gebruikt25. In vergelijking met traditionele glazen ramen maakt deze methode gebruik van gebogen glas, dat de kromming van de hersenen opvangt en zo grotere ramen mogelijk maakt terwijl de brandpuntsdruk op de cortex wordt verminderd. Dit type gebogen glas is niet in de handel verkrijgbaar en heeft slechts beperkte toepassingen in 2P-IVM, omdat het gebogen oppervlak reflectieartefacten veroorzaakt, waardoor het gebied van het raam dat kan worden afgebeeld, wordt beperkt. Een ander alternatief is een op silicium gebaseerd venster24. Aan de ene kant biedt deze methode meer flexibiliteit met betrekking tot de grootte en vorm van het te creëren raam. Bovendien zijn vergelijkbare resultaten op het gebied van raamfalen en ontstekingspercentages gerapporteerd als klassieke glazen ramen. Aan de andere kant is aangetoond dat de beeldvormingskwaliteit van 2 fotonen in op polymeer gebaseerde ramen sneller afneemt dan in glazen ramen, waardoor het niet haalbaar is voor langdurige toepassingen26. Een verdund schedelschedelvenster vertegenwoordigt een ander alternatief. Hoewel het minder invasief is dan het klassieke glazen venster, maakt het geen GBM-celimplantatie mogelijk met dezelfde techniek als hier beschreven. Bovendien is het moeilijk om een consistente schedeldikte te bereiken, en als gevolg daarvan kan dit aanzienlijke artefacten veroorzaken in 2P-IVM27.
De cellijn en het aantal GBM-cellen dat wordt geïmplanteerd, zijn andere belangrijke overwegingen bij het plannen van de tijdlijn van het onderzoek. De C6-glioomcellijn bij ratten is een van de meest gebruikte cellijnen in GBM-onderzoek. Bij ratten en muizen zijn celaantallen tussen 5 x 104 en 5 x 106 gerapporteerd voor intracraniële implantaties 27,28,29,30,31. Als algemene regel geldt dat bij het implanteren van een groter aantal cellen een snellere tumorgroei te verwachten is. In dit protocol werden 1 x 105 cellen geïmplanteerd en werd beeldvorming uitgevoerd op dag 11 en 12 na implantatie. Xin et al. implanteerden 1 x 105 C6-cellen in BALB/c naakte muizen en rapporteerden het detecteren van gevorderde GBM in MRI op dag 7 na implantatie en een verhoogde mortaliteit na 15 dagen30. Ter vergelijking: Jia et al. gebruikten een hoger aantal cellen (1 x 106) en dezelfde muizenstam en detecteerden een kleine tumormassa op dag 7 in MRI met een licht verstoorde bloed-hersenbarrière (BBB), zoals aangetoond door een bleke Evans-blauwe vlek in het GBM-weefsel32. Op dag 14 was de blauwe vlek van Evans sterker dan op dag 7, wat aangeeft dat de BBB sterk verstoord was. De tumorgroei heeft op zijn beurt ook invloed op hoe lang de dieren in het experiment kunnen worden gehouden. Dit is een belangrijke overweging van dierenwelzijn voor longitudinale beeldvormingsonderzoeken. Van chronische schedelvensters is gemeld dat ze tot 6 maanden na implantatie geschikt zijn voor beeldvorming26.
De nanodeeltjes die in dit protocol worden gebruikt, bestaan uit ijzeroxide- en fluorofoorcomponenten. Mogelijke toepassingen zijn onder meer het onderzoek naar de tumorafgifte van nieuwe therapeutische geneesmiddelen, cellulaire therapieën en interventies op de tumorvasculatuur en de micro-omgeving van de tumor. Verschillende kandidaat-geneesmiddelen en combinatietherapieën kunnen op cellulair en moleculair niveau worden geëvalueerd. De ijzeroxidecomponent van de NP's maakt naast 2P-IVM multimodale beeldvorming mogelijk met MRI of magnetische deeltjesbeeldvorming. Hoewel MRI een klinisch relevante beeldvormingsmodaliteit vertegenwoordigt, is de anatomische resolutie inferieur aan die van intravitale microscopie33.
Deze methode heeft ook bepaalde beperkingen. De hersencoördinaten volgens een muizenhersenatlas zijn gestandaardiseerd voor C57BL/6J-muizen en moeten worden aangepast afhankelijk van de muizenbelasting, het geslacht en de leeftijd. Bovendien kan met beeldvorming met twee fotonen slechts een beperkte diepte van ongeveer 450 μm worden bereikt9. Daarom is slechts gedeeltelijke karakterisering van de tumor mogelijk met 2P-IVM en kunnen regionale verschillen in de tumorkenmerken worden gemist. Bovendien werden slechts twee tijdstippen na NP-toediening opgenomen. Toekomstige studies, waaronder meer tijdstippen na intraveneuze toediening, zullen een meer gedetailleerde analyse van het spatiotemporele gedrag van de NP's in de micro-omgeving van de tumor mogelijk maken.
Tot slot evalueerden we de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes met behulp van 2P-IVM in een muismodel van GBM. Deze methode kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende onderzoeksgebieden en vormt een belangrijk hulpmiddel voor in vivo beeldvorming van de hersenen op het gebied van neurowetenschappen.

Twee-foton intravitale microscopie (2P-IVM) is een fluorescentiebeeldvormingstechniek die de visualisatie van levend weefsel mogelijkmaakt1.
2P-IVM werd voor het eerst ontwikkeld in de jaren 1990 en is gebruikt voor in vivo analyse van het netvlies2, nier3, dunne darm4, slakkenhuis5, hart6, luchtpijp7 en de hersenen in verschillende preklinische modellen 8,9. Op het gebied van neurowetenschappen heeft 2P-IVM aan belang gewonnen als techniek voor real-time beeldvorming van de gezonde hersenen bij wakkere dieren10, evenals het bestuderen van ziekten van het zenuwstelsel zoals Alzheimer11, Parkinson12 en glioblastoom (GBM)13,14,15,16.
2P-IVM biedt een elegante oplossing voor het bestuderen van de micro-omgeving van de tumor tijdens de ontwikkeling van GBM. Terwijl sommige eerdere studies zich richtten op in vitro17 en ex vivo modellen18, implementeerden andere orthotope19 en xenotrope20 in vivo modellen voor het onderzoeken van GBM. Madden et al. voerden native beeldvorming uit van de CNS-1 glioomcellijn van ratten in een muismodel13. Met behulp van een orthotopisch GL261-DsRed-muizenmodel voerden Ricard et al. een intraveneuze toediening van een fluorofoor uit om de bloedvaten in het tumorgebied te versterken in 2P-IVM14.
Hier passen we 2P-IVM toe voor het volgen van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide nanodeeltjes (NP) in een orthotopisch muismodel van GBM. Met behulp van een craniaal venster stelt deze methode ons in staat om de real-time spatiotemporele verdeling van NP's in de hersenen in detail te bestuderen.

<table><tbody><tr><td>0.9% natriumchloride infuusioplossing</td><td>Baxter Corp</td><td>533-JB1301P</td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>1 mL spuiten</td><td>BD</td><td>Luer-Lok spuit, REF309628</td><td></td></tr><tr><td>10%&nbsp;FBS</td><td>Thermo fisher</td><td>Cytiva SH30910.03HI</td><td></td></tr><tr><td>10% DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-50ML</td><td></td></tr><tr><td>2-foton microscoop</td><td>Prairie Technologies, Bruker</td><td>Prairie Ultima IV</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol applicators, 70%</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS093810</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol, spuitfles</td><td>Decon Labs Inc</td><td>Decon SaniHol, 04-355-122</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumfolie</td><td>Reynold Brands</td><td>Reynold Wrap non-stick aluminiumfolie</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesiemachine</td><td>Patterson Scientific</td><td>SAS3</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesiemonitoring&nbsp;</td><td>Kent Scientific&nbsp;</td><td>MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter</td><td></td></tr><tr><td>Antibioticum-Antimycoticum (100x), vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Betadine applicators</td><td>Professional Disposables International, Inc</td><td>S41125</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie punch, 5 mm&nbsp;</td><td>Miltex</td><td>Size 5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfine met verlengde afgifte</td><td>Zoo Pharm</td><td>Bup SR Lab, 1.0 mg/mL</td><td>Een generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt.&nbsp;</td></tr><tr><td>C6 rat glioma cel lijn</td><td>ATCC (American Tissue Culture Collection)</td><td>CCL-107</td><td></td></tr><tr><td>Canules</td><td>BD</td><td>16 G, 1.1/2&rdquo;, 30 G, 1&rdquo;</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Pfizer&nbsp;</td><td>Rimadyl, 50 mg/ml</td><td>Een generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cefazoline</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25021-101-10, 1 g/vial</td><td>Een generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>87711</td><td></td></tr><tr><td>Katoenen punt applicators, 6&rdquo;&nbsp;</td><td>Dyad Medical Sourcing, LLC</td><td>HCS1005</td><td></td></tr><tr><td>Tandcement</td><td>Stoelting Co</td><td>51459</td><td>Tandcement kit, transparant, 2 componenten</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Bimeda</td><td>138RX, 2 mg/mL</td><td>Een generiek medicijn kan in plaats daarvan worden gebruikt.&nbsp;</td></tr><tr><td>DietGel</td><td>ClearH2O</td><td>Recovery, 72-06-502</td><td></td></tr><tr><td>Drape&nbsp;</td><td>Cardinal Health</td><td>Bio Shield Wrap</td><td></td></tr><tr><td>Boor</td><td>Saeyang Microtech</td><td>Escort Pro, B08350</td><td></td></tr><tr><td>Boortips&nbsp;</td><td>Hager &amp; Meissinger GmbH</td><td>REF310104001001005</td><td>Size 005, US 1/4</td></tr><tr><td>FIJI beeldanalyse software</td><td>National Institute of Health</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td></tr><tr><td>Pincetten</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td></td></tr><tr><td>Gaasjes</td><td>Fisher HealthCare</td><td>Steriele katoenen gaasjes, 4 x 4&rdquo;, 22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Gelfoam&nbsp;</td><td>Ethicon Inc.&nbsp;</td><td>Surgifoam absorbable gelatine spons, Ref. 1972</td><td></td></tr><tr><td>Germinator&nbsp;</td><td>Cellpoint Scientific&nbsp;</td><td>Germinator 500, No. 11688</td><td></td></tr><tr><td>Glas dekglasjes, 5 mm diameter</td><td>Fisher Scientific</td><td>Menzel Cover glass&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen, niet-sterieel</td><td>Fisher Scientific</td><td>Nitrile poedervrije medische onderzoekshandschoenen</td><td></td></tr><tr><td>Handschoenen, sterieel</td><td>Medline Industries, LP</td><td>MDS104070</td><td></td></tr><tr><td>Haarverwijderingscrème</td><td>Church &amp; Dwight</td><td>Nair Hair remover lotion&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton spuit</td><td>Hamilton Company Inc</td><td>Gastight #1701, 10 &micro;L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS zonder Ca, Mg</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88284</td><td></td></tr><tr><td>Hoofdbalk</td><td>Hongway</td><td>5 mm binnendiameter O-ringen</td><td></td></tr><tr><td>Verwarmingskussen</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Rodent warmer X2</td><td></td></tr><tr><td>Insulin spuiten</td><td>Exel International Medical Products&nbsp;</td><td>29G x 1/2&Prime;</td><td></td></tr><tr><td>Ijzeroxide nanodeeltjes</td><td>Covis Pharma GmbH</td><td>Feraheme ferumoxytol injectie, 510 mg/17 mL, 59338077501</td><td></td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Dechra</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Muizen</td><td>Jackson Laboratories</td><td>NSG, Strain 005557</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop (chirurgie)</td><td>Seiler Medical</td><td>Seiler IQ Q-100-220</td><td></td></tr><tr><td>Nanodeeltjes</td><td>Custom</td><td></td><td>Ijzeroxide nanodeeltjes (Ferumoxytol) gelabeld met fluoresceïne isothiocyanate</td></tr><tr><td>Ophtalmisch zalfje</td><td>Major pharmaceuticals</td><td>Lubrifresh P.M. nachtogent, 203964</td><td></td></tr><tr><td>Zuurstof</td><td>Linde Gas &amp; Equipment Inc.&nbsp;</td><td>High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof bekertjes</td><td>Georgia-Pacirif Consumer Products</td><td>Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleen buisjes</td><td>Braintree Scientific</td><td>50-195-5494</td><td></td></tr><tr><td>Weegschaal</td><td>Ohaus Corp</td><td>CR2200</td><td></td></tr><tr><td>Schaar</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-18</td><td></td></tr><tr><td>Zegelmiddel</td><td>Henkel Corp</td><td>Loctite 4014</td><td></td></tr><tr><td>Labjas, voor eenmalig gebruik</td><td>High Tech Conversions</td><td>17-444-081</td><td></td></tr><tr><td>Stereotactisch frame</td><td>Stoelting Co.&nbsp;</td><td>Stoelting New Standard TM</td><td></td></tr><tr><td>Steriele vacuümflesjes met bovenfiltersystemen</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam doos</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische handschoenen</td><td>Cardinal Health</td><td>19-163-108</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisch lijm, 3M Vetbond weefselkleefstof</td><td>3M Animal Care Prodcuts</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr>

intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Two-Photon Intravital Microscopy of Glioblastoma in a Murine Model

De toediening van intraveneus toegediende kankertherapieën aan hersentumoren wordt beperkt door de bloed-hersenbarrière. Een methode om de accumulatie en distributie van macromoleculen in hersentumoren in vivo direct in beeld te brengen, zou ons vermogen om de afgifte van geneesmiddelen in preklinische modellen te begrijpen en te optimaliseren aanzienlijk verbeteren. Dit protocol beschrijft een methode voor real-time in vivo tracking van intraveneus toegediende fluorescerend gelabelde nanodeeltjes met twee-foton intravitale microscopie (2P-IVM) in een muismodel van glioblastoom (GBM).
Het protocol bevat een beschrijving in meerdere stappen van de procedure, inclusief anesthesie en analgesie van proefdieren, het creëren van een schedelvenster, GBM-celimplantatie, het plaatsen van een hoofdbalk, het uitvoeren van 2P-IVM-onderzoeken en postoperatieve zorg voor vervolgonderzoeken op lange termijn. We tonen representatieve 2P-IVM-beeldvormingssessies en beeldanalyses, onderzoeken de voor- en nadelen van deze technologie en bespreken mogelijke toepassingen.
Deze methode kan eenvoudig worden aangepast en aangepast voor verschillende onderzoeksvragen op het gebied van in vivo preklinische beeldvorming van de hersenen.

Hier voerden we craniale raamchirurgie uit en transplanteerden we C6-cellen in een NSG-muismodel van GBM (n = 5). Een goede afdichting tussen alle componenten die betrokken zijn bij het maken van het venster (Figuur 1A) zorgt voor de duurzaamheid van de ramen voor beeldvorming op lange termijn en vermindert bovendien de morbiditeit. Met behulp van de voor in vivo 2P-IVM aangepaste fase (Figuur 2) konden we dieren tot 2 uur lang onder narcose in beeld brengen zonder grote bewegingsartefacten. Ongeveer 10 minuten na intraveneuze toediening van de nanodeeltjes in GBM-dragende muizen, toont 2P-IVM het groene, fluorescerende signaal van bloedvaten in het gebied van de tumor, consistent met intravasculaire lokalisatie van de FITC-gelabelde nanodeeltjes. Er wordt slechts een kleine hoeveelheid groen-fluorescerend signaal waargenomen buiten de bloedvaten, wat wijst op het begin van extravasatie van NP's (Figuur 3A). Er wordt een toename van het FITC-signaal gezien dat afkomstig is van de extravasculaire ruimte, wat in lijn is met geavanceerde extravasatie (Figuur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig01.jpg"> Figuur 1. Plaatsing van schedelvensters, craniotomie, implantatie en beeldvorming. (A) Dwarsdoorsnede van de anatomische plaatsing van een schedelraam. Omdat de hoofdstang metaalvrij is, is het mogelijk om naast intravitale microscopie met twee fotonen ook magnetische resonantiebeeldvorming of magnetische deeltjesbeeldvorming uit te voeren. (B) Overzicht (bovenste rij) en een gedetailleerd overzicht (onderste rij) van de craniotomie (links), celimplantatie (midden) en 2-foton intravitale microscopie (rechts). Bij het openen van de schedel treedt een oppervlakkige bloeding op (links) en wordt deze snel weer geabsorbeerd (midden). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig02.jpg"> Figuur 2. Computerondersteund ontwerp (CAD) van het podium. CAD van de fase die wordt gebruikt voor in vivo 2-foton intravitale microscopie, inclusief een bijtbalk, kopbalkstabilisatie en schroeven voor hoogte- en hoekaanpassingen. Het 3D CAD-bestand is te vinden in Supplemental Coding File 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66304/66304fig03.jpg"> Figuur 3. In vivo 2-foton intravitale microscopiebeelden. Beelden verkregen (A) 10 minuten en (B) 24 uur na intraveneuze toediening van nanodeeltjes. Terwijl de GBM-cellen fluorescerende signalen uitzenden in het rode spectrum (links), worden de nanodeeltjes in het hersenweefsel in groen gevisualiseerd (rechts). # geeft extravasate NP's aan, * geeft een bloedvat aan. Slechts een beperkt aantal deeltjes heeft extravasatie ondergaan en is 10 minuten na NP-toediening zichtbaar in de buurt van de tumorcellen. Een overvloed aan deeltjes is zichtbaar in het gebied van GBM-cellen, wat wijst op extravasatie 24 uur na toediening van NP. De nanodeeltjes bestaan uit fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) en ijzeroxide-nanodeeltjes (Ferumoxytol). De schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm. Afkortingen: 2P-IVM: 2-foton intravitale microscopie, RFP: rood fluorescerend eiwit, GBM: glioblastoom, FITC: fluoresceïne-isothiocyanaat, NP: nanodeeltjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/66304fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Supplemental Coding File 1: 3D CAD-bestand van het podium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66304/custom%20stage%203D%20CAD.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

The delivery of intravenously administered cancer therapeutics to brain tumors is limited by the blood-brain barrier. A method to directly image the ...

Glioblastoom is een van de meest voorkomende primaire hersenkanker en wordt in verband gebracht met snelle groei en een slechte levensverwachting. Het ontwikkelen van effectieve therapieën voor glioblastoom blijft een grote uitdaging, aangezien de toediening van therapieën wordt beperkt door de bloed-hersenbarrière. Een methode om de accumulatie en distributie van macromoleculen in de hersenen direct in beeld te brengen, zou ons vermogen om de afgifte van geneesmiddelen te begrijpen en te optimaliseren aanzienlijk verbeteren.Twee-fotonmicroscopie biedt een elegante oplossing voor het bestuderen van de real-time verdeling van nanodeeltjes in het preklinische model van glioblastoom. Door het nanodeeltje dat in deze studie wordt gebruikt aan te passen, is het mogelijk om de afgifte van verschillende kandidaat-geneesmiddelen en combinatietherapieën op cellulair en moleculair niveau te onderzoeken. Naast intravitale microscopie met twee fotonen maakt de ijzeroxidecomponent van deze nanodeeltjes multimodale beeldvorming met MRI of MPI mogelijk.Voor de toekomst zouden beeldvormingsfaciliteiten kunnen dienen bij het realiseren van vroege opsporing van kanker, wat leidt tot effectievere therapieën tegen kwaadaardige neoplasie. Een manier om dit te bereiken is het samenvoegen van intravitale microscopie met twee fotonen met andere beeldvormingsmodaliteiten zoals positronemissietomografie en fotoakoestische echografie.

two-photon-intravital-microscopy-of-glioblastoma-in-a-murine-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Intracraniële implantatie van GL261 cellen in C57BL / 6 muizen produceert kwaadaardige gliomen dat veel van de kenmerken van de menselijke glioblastoma multiforme samenvatten. We gebruikten GL261 cellen die stabiel uitdrukken luciferase om ons in staat om te...

Intracraniële Implantatie met Latere 3D In Vivo Bioluminescent Imaging van Murine Gliomen

We beschrijven een geïntegreerde methode voor de exacte, stereotactische implantatie van menselijke glioblastoma multiforme cellen in de hersenen van muizen en vervolgens naakt...

Stereotactische Intracraniale Implantatie en<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging van tumorxenograften in een Muis Model Systeem van glioblastoma multiforme

In this video, we perform intravital imaging of pre-injected cancer cells in a mouse model via an implanted cranial window. This high-resolution time-lapse imaging technique enables the study of dynamic behavior of cancer cells in the live mouse.

Cranial Window-based Intravital Imaging in a Mouse Model: An Imaging Technique to Study the Behavior of Pre-injected Cancer Cells in the Brain of a Murine Model

In this video, we describe fluorescence molecular tomography or FMT for in vivo imaging of fluorescent protein-tagged glioblastoma xenografts in mouse models. The technique is useful for elucidating the effects of anti-tumor therapeutics at the molecular level.

Fluorescence Molecular Tomography: An Imaging Technique for In Vivo Imaging of Fluorescent Protein-tagged Glioblastoma Xenografts in Mouse Model

Source: Clark, A.J., et al. Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates bioluminescence imaging to track glioblastoma progression in an immunocompetent mouse model, using luciferase-expressing tumor cells and luciferin to quantify tumor growth non-invasively.

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Mouse Model for Glioblastoma

We hebben een corticaal orthotope glioblastoom model vastgesteld muizen intravitale twee-foton microscopie dat de biofysische beperkingen recapituleert beginsel zullen spelen tijdens de groei van de tumor. Een chronische glazen venster vervangen van de schedel boven de tumor kan de follow-up van de progressie van de tumor na verloop van tijd door twee-foton microscopie.

Een orthotope Glioblastoma Muis Model Handhaving Brain Parenchymale fysieke beperkingen en geschikt voor intravitale twee-foton microscopie

GL261-glioomcellen bieden een bruikbaar immunocompetent diermodel van glioblastoom. De doelen van dit protocol zijn om de juiste technieken te demonstreren voor het monitoren van intracraniële tumorgroei met behulp van in vivo bioluminescentie-beeldvorming, en om de bruikbaarheid van luciferase-gemodificeerde GL261-cellen te verifiëren voor het bestuderen van tumorimmunologie en immunotherapeutische benaderingen voor de behandeling van glioblastoom.

Bioluminescentie beeldvorming van een Immunocompetente diermodel voor Glioblastoma

Orthotopic intracraniële injectie van tumorcellen wordt in kankeronderzoek te bestuderen hersenen tumor biologie, progressie en evolutie therapeutische respons uitgegaan. Hier presenteren we fluorescentie moleculaire tomografie van tumor xenografts, die biedt real-time intravital imaging en kwantificering van een tumor massa in preklinische glioblastoma modellen.

Fluorescentie moleculaire tomografie voor In Vivo Imaging van Glioblastoma Xenografts

Het begrijpen van het kwaadaardige gedrag van kanker vereist het creëren van nauwkeurige modellen van hoe tumorcellen interageren met componenten van de tumormicro-omgeving, zoals macrofagen. Hier beschrijven we twee methoden om de interactie van glioblastoomcellen met tumorgeassocieerde macrofagen en microglia te bestuderen, waarbij het effect op glioblastoominvasie wordt beoordeeld.

Coculture Testen om te studeren macrofagen en microglia Stimulatie van glioblastoma Invasion

Dit protocol beschrijft het gebruik van multifotonmicroscopie om longtermijn, hoog-resolutie, enkelcellimago van de intacte long in real time uit te voeren met behulp van een vacuüm gestabiliseerd beeldvormingsvenster.

Langdurig High-Resolution intravitale microscopie in de long met een vacuüm gestabiliseerd Imaging Window

Leer intravitale twee-fotonmicroscopie van glioblastoom in een muizenmodel. Deze methode maakt real-time beeldvorming van nanopartikelaccumulatie mogelijk om geneesmiddelafgifte over de bloed-hersenbarrière te optimaliseren.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

Meer video's verkennen