Name: Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:15:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Leer een naadloze kloneringsmethode voor de constructie van complexe PRRSV-genexpressievectoren met behulp van homologe recombinatie en PCR. Deze aanpak maakt efficiënte incorporatie van meerdere DNA-fragmenten mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de financiële steun van de fondsen voor het initiëren van doctoraatsonderzoek, verstrekt door de China West Normal University (nr. 20E059).

1. Voorbereiding van de sjabloon van het PRRSV-gen
<ol><li>Ontdooi de virusvoorraad in 1 ml RNA-extractiereagens (zie materiaaltabel).</li>
	<li>Voeg 0,2 ml chloroform toe en meng goed. Incubeer gedurende 3 min.</li>
	<li>Centrifugeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C. OPMERKING: Het mengsel is verdeeld in drie fasen, namelijk een kleurloze waterige fase, een interfase en een rode fenol-chloroformfase.</li>
	<li>Pipetteer de kleurloze waterige uitfasering en breng deze over naar een nieuwe buis.</li>
	<li>Meng de waterige fase grondig met 0,5 ml isopropanol en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C. OPMERKING: De bodem van de buis heeft een wit RNA-precipitaat.</li>
	<li>Gebruik een micropipet om het supernatans van de buis weg te gooien.</li>
	<li>Voeg 1 ml 75% ethanol toe om de pellet en de vortex kort te resuspenderen.</li>
	<li>Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 7.500 × g bij 4 °C. Gebruik een micropipet om het supernatans van de buis weg te gooien.</li>
	<li>Droog het RNA gedurende 5 minuten, voeg 20-50 μL RNasevrij water toe om het RNA te resuspenderen en meng grondig.</li>
	<li>Ga verder met het uitvoeren van omgekeerde transcriptie; Stel de reacties in om reverse transcriptie uit te voeren, zoals weergegeven in Tabel 1. OPMERKING: Gebruik RNA-sjablonen van hoge kwaliteit om een succesvolle omgekeerde transcriptie te garanderen.</li>
	<li>Gebruik het resulterende cDNA voor PCR of bewaar het bij -20 °C.</li>
</ol>2. PCR-primer ontwerp
<ol><li>Ontwerpen van de voorwaartse primer<ol><li>Open de software en kies Nieuw DNA-bestand.</li>
		<li>Plak de PRRSV-gensequentie (GenBank: FJ548852.1) van NCBI in de software. Klik op OK om de sequentiebestanden te genereren.</li>
		<li>Analyseer de sequentie en markeer de fragmentjuncties. Ontwerp de voorwaartse specifieke sequentieprimer van de fragmenten. In de meeste gevallen ligt de voorkeurssmelttemperatuur (Tm) tussen 55 °C en 62 °C en is het GC-gehalte 40-60%.</li>
		<li>Klik op Primers en kies Primer toevoegen.</li>
		<li>Plak de specifieke sequentie en voeg overlappende sequenties van de vector toe aan de eerste 5' nucleotide van de specifieke sequentieprimer. Kies in de buurt van elke kruising 20-40 bp om te dienen als overlappingsgebied tussen de twee aangrenzende fragmenten.</li>
		<li>Noem de voorwaartse primer met de uitsteeksels en de specifieke volgorde (zie aanvullende afbeelding S1).</li>
		<li>Klik op Primer toevoegen aan sjabloon.</li>
	</ol></li>
	<li>Ontwerpen van de omgekeerde primer<ol><li>Analyseer de sequentie en markeer de fragmentjuncties in de software. Ontwerp de omgekeerde specifieke sequentieprimer van de fragmenten.</li>
		<li>Klik op Primers en kies Primer toevoegen.</li>
		<li>Plak de specifieke sequentie en voeg de restrictieplaats toe aan de eerste 5' nucleotide van de specifieke sequentieprimer. OPMERKING: De toegevoegde beperkingssites moeten afwezig zijn in het invoegfragment en de vector, met uitzondering van de meerdere kloonsites.</li>
		<li>Voeg 20-40 bp overhangsequenties van vectoren toe aan de eerste 5' nucleotide van de restrictieplaats.</li>
		<li>Noem de omgekeerde primer met de uitsteeksels en de specifieke volgorde (zie aanvullende afbeelding S1).</li>
		<li>Klik op Primer toevoegen aan sjabloon.</li>
	</ol></li>
</ol>3. PCR om fragmenten te amplificeren
<ol><li>Stel zes individuele PCR-reacties in (tabel 2): gebruik voor fragment 1 primers P1 en P2 (zie aanvullende figuur S2); gebruik voor fragment 2 de primers P3 en P4 (zie aanvullende figuur S2); gebruik voor fragment 3 de primers P5 en P6 (zie aanvullende figuur S2); gebruik voor fragment 4 de primers P7 en P8 (zie aanvullende figuur S2); voor fragment 5 gebruik je de primers P9 en P10; en gebruik primers P11 en P12 om fragment 6 te versterken (zie aanvullende figuur S2). NOTITIE: Ontdooi, meng en centrifugeer elk onderdeel kort voor gebruik.</li>
	<li>Voer de PCR uit met behulp van het driestappenprotocol in tabel 2.</li>
	<li>Voeg 1 μL 6x DNA-laadbuffer toe aan 5 μL PCR-product, meng en centrifugeer de inhoud kort.</li>
	<li>Analyseer de monsters met behulp van 1% agarosegelelektroforese.</li>
</ol>4. Zuivering van de PCR-fragmenten
OPMERKING: Het zuiveren van de PCR-producten uit een gel met behulp van een gelextractiekit (zie Materiaaltabel) is belangrijk voor vectorconstructie.
<ol><li>Voeg 9 μL 6x DNA-laadbuffer toe aan 45 μL PCR-producten, meng en centrifugeer de inhoud kort.</li>
	<li>Voer 1% agarosegel/goldview-elektroforese uit om de DNA-fragmenten te scheiden. OPMERKING: Gebruik de TAE-loopbuffer niet opnieuw, aangezien de pH-waarde het herstel van DNA-fragmenten beïnvloedt.</li>
	<li>Gebruik na voldoende scheiding van de banden een scherp scalpel om de DNA-banden voorzichtig weg te snijden. OPMERKING: Minimaliseer de grootte van het plakje gel door overtollige agarose af te snijden.</li>
	<li>Weeg de gelplak af in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg een gelijk volume bindingsbuffer toe aan de gelplak (bijv. 0,3 ml op een plakje van 0,3 g) en incubeer bij 60 °C gedurende 7 minuten.</li>
	<li>Plaats een minikolom in een opvangbuisje van 2 ml. Voeg 700 μL DNA/agarose-oplossing uit stap 4.4 toe aan de minikolom.</li>
	<li>Centrifugeer bij 10.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg en hergebruik de opvangbuis.</li>
	<li>Voeg 300 μL bindingsbuffer toe en centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg en hergebruik de opvangbuis.</li>
	<li>Voeg 700 μL wasbuffer toe en centrifugeer op 13.000 × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Gooi het filtraat weg en hergebruik de opvangbuis.</li>
	<li>Draai de lege minikolom 2 minuten op maximale snelheid om de kolommatrix te drogen. Plaats de minikolom in een schone microcentrifugebuis van 1,5 ml.</li>
	<li>Voeg 20 μL gedeïoniseerd water rechtstreeks toe aan het midden van het kolommembraan en laat 2 minuten op kamertemperatuur staan. Centrifugeer op een snelheid van 13.000 × g gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Bewaar het DNA bij -20 °C.</li>
</ol>5. Voorbereiding van een gelineariseerde vector
OPMERKING: Na het bereiden van het plasmide kunnen de geselecteerde enzymen worden gebruikt om het te knippen. Lange spijsvertering of dubbele enzymvertering is cruciaal voor het waarborgen van de vertering van al het DNA. Dit zal het aantal vals-positieve klonen in volgende experimenten verminderen.
<ol><li>pVAX1 linearisatie
	<ol><li>Bereid het reactiemengsel bij kamertemperatuur in de aangegeven volgorde (tabel 3). OPMERKING: Het volume water moet worden toegevoegd om het aangegeven totale reactievolume te behouden. Hier werd 1 μg van het plasmide verteerd met enzymen in het reactiemengsel. Afhankelijk van de plasmideconcentratie kan het volume van het plasmide in het reactiemengsel worden aangepast.</li>
		<li>Meng voorzichtig; Draai dan naar beneden. Incubeer bij 37 °C in een warmteblok of waterthermostaat gedurende 60 min.</li>
		<li>Voer een gelzuivering uit die vergelijkbaar is met de zuivering van de PCR-fragmenten in sectie 4 met behulp van de gelextractiekit (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
	<li>pVAX1-F1 linearisatie OPMERKING: pVAX1-F1 is de vector verkregen uit de eerste ronde van pVAX1 (NdeI en HindIII) en fragment 1 recombinatie. pVAX1-F2 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F1 (NdeI) en fragment 2 recombinatie. pVAX1-F3 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F2 (NdeI) en fragment 3 recombinatie. pVAX1-F4 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F3 (NdeI) en fragment 4 recombinatie. pVAX1-F5 is de vector die wordt verkregen uit de ronde van pVAX1-F4 (EcoRV en NtoI) en fragment 5 recombinatie.<ol><li>Bereid voor elke vector het reactiemengsel afzonderlijk bij kamertemperatuur in de aangegeven volgorde (tabel 3).</li>
		<li>Meng voorzichtig; Draai dan naar beneden. Incubeer bij 37 °C in een warmteblok of waterthermostaat gedurende 60 min.</li>
		<li>Voer een gelzuivering uit die vergelijkbaar is met de zuivering van de PCR-fragmenten in sectie 4 met behulp van de gelextractiekit (zie Materiaaltabel).</li>
	</ol></li>
</ol>6. Subklonen naar een nieuwe vector
OPMERKING: Een goede kloonefficiëntie kan worden bereikt bij gebruik van 50-200 ng vector en inzetstukken.
<ol><li>Stel de naadloze kloon- en montagereactie van ExonArt in (tabel 4). Stel het totale reactievolume in op 10 μL met behulp van gesteriliseerde gedeïoniseerde H2O en meng.</li>
	<li>Incubeer de reactie in een thermocycler gedurende 15-60 minuten bij 50 °C. Bewaar de monsters op ijs. NOTITIE: Het verlengen van de incubatie tot 60 minuten kan de montage-efficiëntie verbeteren.</li>
	<li>Ontdooi DH5α chemisch competente cellen op ijs.</li>
	<li>Voeg 10 μL van het assemblageproduct toe aan de bevoegde cellen; Meng vervolgens voorzichtig door op en neer te pipetteren.</li>
	<li>Leg het mengsel 30 minuten op ijs.</li>
	<li>Hitteschok bij 45 °C gedurende 45 s en breng de buizen gedurende 3 minuten over op het ijs.</li>
	<li>Voeg 900 μL SOC-medium toe aan de buis.</li>
	<li>Schud de buis gedurende 1 uur op 225 rpm in een schudincubator van 37 °C.</li>
	<li>Centrifugeer de transformatiereactie bij 6.000 × g gedurende 2 minuten. Gooi het supernatans weg en resuspendeer de cellen in 100 μl vers SOC-medium.</li>
	<li>Verdeel de getransformeerde celsuspensie op een aparte LB-plaat met 50 μg/ml kanamycine.</li>
	<li>Incubeer alle platen een nacht bij 37 °C. Kies individuele geïsoleerde kolonies van elke experimentele plaat.</li>
</ol>7. Analyse van de transformaties
<ol><li>Pluk acht kolonies in 20 μL LB-medium met 50 μg/ml kanamycine.</li>
	<li>Stel de kolonie-PCR-reactie in en voer de PCR uit (Tabel 5). OPMERKING: Gebruik voor de kolonie-PCR-reactie voor fragment 1 primers P1 en P2 (zie aanvullend dossier 1); voor fragment 2 gebruik de primers P3 en P4 (zie aanvullend dossier 1); voor fragment 3 gebruik de primers P5 en P6 (zie aanvullend dossier 1); gebruik voor fragment 4 de primers P7 en P8 (zie aanvullende figuur S2); voor fragment 5 gebruik je de primers P9 en P10; en gebruik primers P11 en P12 om fragment 6 te detecteren (zie aanvullende figuur S2).</li>
	<li>Voeg 1 μL 6x DNA-laadbuffer toe aan 5 μL van het PCR-product, meng en centrifugeer de inhoud kort.</li>
	<li>Analyseer de resultaten met behulp van 1% agarosegelelektroforese.</li>
	<li>Selecteer een positieve kolonie in 5 ml LB-medium met 50 μg/ml kanamycine en kweek 's nachts bij 37 °C.</li>
	<li>Verkrijg het plasmide met behulp van een plasmide-DNA-minikit (zie Materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Visualiseer de resultaten met behulp van 1% agarosegelelektroforese.</li>
</ol>

Het klonen van het PRRSV-gen van volledige lengte in de pVAX1-expressievector

<ol><li>Lessard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning.</a> Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J. Biol. Eng. 2, 5(2008).</li>
<li>Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+splicing+by+overlap+extension%3A+tailor-made+genes+using+the+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 54 (3), 129-133 (2013).</li>
<li>Horton, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-mediated+recombination+and+mutagenesis.+SOEing+together+tailor-made+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">PCR-mediated recombination and mutagenesis. SOEing together tailor-made genes.</a> Mol Biotechnol. 3 (2), 93-99 (1995).</li>
<li>Bang, D., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+synthesis+by+circular+assembly+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene synthesis by circular assembly amplification.</a> Nat. Methods. 5 (1), 37-39 (2008).</li>
<li>Geu-Flores, F., Nour-Eldin, H. H., Nielsen, M. T., Halkier, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USER+fusion%3A+a+rapid+and+efficient+method+for+simultaneous+fusion+and+cloning+of+multiple+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">USER fusion: a rapid and efficient method for simultaneous fusion and cloning of multiple PCR products.</a> Nucleic Acids Res. 35 (7), e55(2007).</li>
<li>Gibson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+overlapping+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments.</a> Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Cho, J. G., Dee, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Porcine reproductive and respiratory syndrome virus.</a> Theriogenology. 66 (3), 655-662 (2006).</li>
<li>Holtkamp, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+on+United+States+pork+producers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Swine+Health+Prod%22%5BJournal%5D)">Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome virus on United States pork producers.</a> J. Swine Health Prod. 21, 72-84 (2013).</li>
<li>Thomann, B., Rushton, J., Schuepbach-Regula, G., Nathues, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+economic+effects+of+vaccination+against+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome%3A+Impact+of+vaccination+effectiveness%2C+vaccine+price%2C+and+vaccination+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling economic effects of vaccination against porcine reproductive and respiratory syndrome: Impact of vaccination effectiveness, vaccine price, and vaccination coverage.</a> Front Vet Sci. 7, 500(2020).</li>
<li>Dwivedi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+immune+responses+to+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+pigs+during+early+stage+of+infection+under+farm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Evaluation of immune responses to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in pigs during early stage of infection under farm conditions.</a> Virol J. 9, 45(2012).</li>
<li>Mengeling, W. L., Lager, K. M., Vorwald, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+consequences+of+exposing+pregnant+gilts+to+strains+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+%28PRRS%29+virus+isolated+from+field+cases+of+%26%2334%3Batypical%26%2334+PRRS%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Vet.+Res%22%5BJournal%5D)">Clinical consequences of exposing pregnant gilts to strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolated from field cases of &#34;atypical&#34 PRRS.</a> Am. J. Vet. Res. 59 (12), 1540-1544 (1998).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+the+spread+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+in+endemically+infected+pig+herds+by+nursery+depopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Rec%22%5BJournal%5D)">Prevention of the spread of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in endemically infected pig herds by nursery depopulation.</a> Vet Rec. 135 (1), 6-9 (1994).</li>
<li>Dee, S. A., Joo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+to+control+PRRS%3A+a+summary+of+field+and+research+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Strategies to control PRRS: a summary of field and research experiences.</a> Vet Microbiol. 55 (1-4), 347-343 (1997).</li>
<li>Renukaradhya, G. J., Meng, X. J., Calvert, J. G., Roof, M., Lager, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+vaccines%3A+Current+status+and+future+direction%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccines: Current status and future direction.</a> Vaccine. 33 (33), 4069-4080 (2015).</li>
<li>Conzelmann, K. K., Visser, N., Woensel, P. V., Thiel, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%2C+a+member+of+the+arterivirus+group%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus, a member of the arterivirus group.</a> Virology. 193 (1), 329-339 (1993).</li>
<li>Han, M. Y., Yoo, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+PRRS+virus+genome%3A+Updates+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Engineering the PRRS virus genome: Updates and perspectives.</a> Vet Microbiol. 174 (3), 279-295 (2014).</li>
<li>Bryksin, A. V., Matsumura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlap+extension+PCR+cloning%3A+a+simple+and+reliable+way+to+create+recombinant+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Overlap extension PCR cloning: a simple and reliable way to create recombinant plasmids.</a> Biotechniques. 48 (6), 463-465 (2010).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction-based+multiple-fragment+assembly+strategy+to+avoid+random+mutation+during+long+cDNA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restriction-based multiple-fragment assembly strategy to avoid random mutation during long cDNA cloning.</a> J Cancer. 6 (7), 632-635 (2015).</li>
<li>Zhang, Z. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+impact+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+outbreak+in+four+Chinese+farms%3A+Based+on+cost+and+revenue+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">The economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome outbreak in four Chinese farms: Based on cost and revenue analysis.</a> Front Vet Sci. 9, 1024720(2022).</li>
<li>Chen, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+genetic+diversity+of+Chinese+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+viruses+from+2016+to+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">High genetic diversity of Chinese porcine reproductive and respiratory syndrome viruses from 2016 to 2019.</a> Res Vet Sci. 131, 38-42 (2020).</li>
<li>Wang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Zhang, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+infectious+clone+of+HuN4-F112%2C+an+attenuated+live+vaccine+strain+of+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+high+copy+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Generation of an infectious clone of HuN4-F112, an attenuated live vaccine strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus high copy plasmid.</a> Virol J. 8, 410(2011).</li>
<li>Ni, Y. Y., Huang, Y. W., Cao, D. J., Opriessnig, T., Meng, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+DNA-launched+infectious+clone+for+a+highly+pneumovirulent+strain+of+type+2+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus%3A+identification+and+in+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+large+spontaneous+deletion+in+the+nsp2+region%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Establishment of a DNA-launched infectious clone for a highly pneumovirulent strain of type 2 porcine reproductive and respiratory syndrome virus: identification and in vitro and in vivo characterization of a large spontaneous deletion in the nsp2 region.</a> Virus Res. 160 (1-2), 264-273 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De Gibson-assemblagetechniek is een in vitro op recombinatie gebaseerde moleculaire kloonmethode voor de assemblage van DNA-fragmenten8. Deze methode maakt de assemblage van meerdere DNA-fragmenten tot een cirkelvormig plasmide mogelijk in een isothermische reactie met één buis. Een van de obstakels voor de Gibson Assembly-techniek is echter het verkrijgen van lange fragmenten uit cDNA. De lange fragmenten zijn om vele redenen moeilijk nauwkeurig te versterken. Primers zijn bijvoorbeeld gemakkelijker te mismatchen tijdens lange verlengingstijden, cDNA is mogelijk niet van goede kwaliteit of GC-rijke regio's stoppen met DNA-polymerisatie. Wanneer het volledige fragment niet gemakkelijk uit cDNA kan worden verkregen met behulp van PCR, moet het fragment van volledige lengte worden verdeeld in meerdere fragmenten voor amplificatie. Naarmate het aantal en de lengte van de ingebrachte DNA-fragmenten toenemen, zullen de efficiëntie en positieve klonen van de homologe recombinatietest echter ook aanzienlijk afnemen. Daarom hebben we een alternatieve oplossing geprobeerd door geschikte beperkingsplaatsen aan het 3'-uiteinde van de inzetstukken te introduceren. Vervolgens kunnen we de vector lineariseren en de DNA-fragmenten één voor één samenvoegen tot de vector door middel van homologe recombinatietechnologie en de ongewenste beperkingsplaatsen elimineren via de homologe recombinatiereactie.
Als een van de economisch belangrijkste ziekteverwekkers op de wereldmarkten heeft PRRSV de afgelopen 30 jaar altijd de aandacht van onderzoekers getrokken 10,21,22. Het is een positiefstrengs RNA-virus, ongeveer 15 kb lang, en het lange DNA-fragment kan niet gemakkelijk worden geamplificeerd uit cDNA. Om te onderzoeken of deze methode kan worden gebruikt voor het klonen van lange fragmenten, hebben we de PRRSV gebruikt als sjabloon voor het klonen van het volledige genoom. In deze studie verdeelden we de volledige sequentie in zes fragmenten en voegden we geschikte beperkingsplaatsen toe aan de omgekeerde primer, waarbij we zes fragmenten verkregen door PCR. Vervolgens hebben we met succes de pVAX1-PRRSV-expressievector van volledige lengte verkregen door verschillende rondes van recombinatiereacties. Bovendien kan de geconstrueerde PRRSV-expressievector dienen als een sjabloon voor in vitro transcriptie om afgetopte RNA's te verkrijgen voor transfectie- of mRNA-vaccinonderzoek. Ondertussen kan het geconstrueerde mRNA-virusplasmide worden gebruikt voor batchscreening van antivirale natuurlijke verbindingen in vitro door middel van moleculaire interactietechnieken, zoals oppervlakteplasmonresonantie23,24. Het pVAX1-plasmide voldoet aan de eisen omdat een in vitro transcriptietest een high-copy plasmide met een T7-promotor vereist. Bovendien kan het pVAX1-PRRSV-plasmide dat de CMV-promotor bevat, worden getransfecteerd in BHK-21cellen voor virale genoomexpressie25,26.
Samenvattend tonen we met dit protocol aan dat lange genen van volledige lengte kunnen worden verdeeld in verschillende fragmenten die worden verkregen door PCR-amplificatie. Het is belangrijk dat de omgekeerde primers op de juiste restrictieplaatsen worden ingebracht, zodat de genexpressievector van volledige lengte kan worden verkregen door verschillende rondes van recombinatiereacties. Deze methode kan worden gebruikt voor genen van volledige lengte die niet direct kunnen worden verkregen door een enkele PCR of voor genen van volledige lengte die niet kunnen worden verkregen door homologe recombinatie van meerdere inserts. Daarom is deze aanpak een belangrijke aanvulling op de Gibson Assembly-techniek, we verwachten dat deze op grote schaal kan worden gebruikt voor het klonen van lange DNA-fragmenten en de constructie van fusiegenen.

Als een essentiële techniek om op DNA gebaseerde experimentele instrumenten te construeren voor expressie in prokaryote en eukaryote cellen, is moleculair klonen een zeer belangrijk onderdeel van de experimentele biologie. Moleculair klonen omvat vier processen: het verkrijgen van insert-DNA, ligatie van de insert in de juiste vector, transformatie van de recombinante vector in Escherichia coli (E. coli) en identificatie van de positieve klonen1. Tot nu toe zijn er meerdere methoden toegepast om DNA-moleculen samen te voegen met behulp van restrictie-enzymen 2,3 en PCR-gemedieerde recombinatie 4,5,6. Homologe recombinatie, bekend als naadloze kloontechnologie, is de groep kloonmethoden die sequentie-onafhankelijke en littekenloze invoeging van een of meer DNA-fragmenten in een vector mogelijk maakt. Deze technologie omvat sequentie- en ligatie-onafhankelijk klonen (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion en Gibson Assembly. Het maakt gebruik van een exonuclease om een streng van het inzetstuk af te breken en een vector om samenhangende uiteinden te genereren, en ofwel in vivo reparatie of in vitro recombinatie om het inzetstuk covalent aan de vector te verbinden door fosfodiësterbindingen te vormen. De mogelijkheid om een enkele wisselplaat in elke volgorde aan een vector te koppelen zonder littekens is zeer aantrekkelijk. Bovendien heeft de technologie de mogelijkheid om 5-10 fragmenten in een vooraf bepaalde volgorde samen te voegen zonder sequentiebeperkingen.
Als een van de vele recombinant-DNA-technieken is de Gibson Assembly-techniek, momenteel de meest effectieve kloonmethode 7,8, een robuuste en elegante op exonuclease gebaseerde methode om een of meerdere gelineariseerde DNA-fragmenten naadloos samen te stellen. De Gibson Assembly-reactie wordt uitgevoerd onder isotherme omstandigheden met behulp van een mengsel van drie enzymen, namelijk 5'-exonuclease, high-fidelity polymerase en een thermostabiel DNA-ligase. Enkelstrengs 3'-uitsteeksels gecreëerd door het 5'-3'-exonuclease dragen bij aan het gloeien van fragmenten die aan één uiteinde complementariteit delen. Het high-fidelity polymerase vult effectief de hiaten in de gegloeide enkelstrengs gebieden door dNTP's toe te voegen, en het thermostabiele DNA-ligase sluit de inkepingen af om gezamenlijke DNA-moleculen te vormen8. Daarom is deze technische methode veel gebruikt voor de constructie van genexpressievectoren.
Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is een virale ziekte die leidt tot reproductieve stoornissen en respiratoire insufficiëntie bij varkens veroorzaakt door PRRSV op elke leeftijdvan 9 jaar. Het syndroom manifesteert zich als koorts, anorexia, longontsteking, lethargie, depressie en ademnood. Bovendien zijn bij sommige epidemieën klinische verschijnselen waargenomen, waaronder rood/blauwe verkleuring van de oren. Als lid van het arterivirus van de familie wordt PRRSV op grote schaal overgedragen naar varkensvleesproducerende landen door direct contact en uitwisseling van vloeistoffen, waaronder urine, colostrum en speeksel. Als gevolg van de verspreiding van PRRSV in de Verenigde Staten worden de totale economische verliezen van de varkensvleesindustrie geschat op ongeveer $ 664 miljoen per jaar, op basis van de fokschaal van 5.8 miljoen zeugen en 110 miljoen varkens10,11. Uit het rapport van de Inspectiedienst voor de Dier- en Plantgezondheid blijkt dat 49,8% van de niet-gevaccineerde varkens de aanwezigheid van PRRSV in serum12 vertoont en dat lage niveaus van PRRSV bij geïnfecteerde varkens worden uitgescheiden via speeksel, neusafscheidingen, urine en ontlasting13. Er zijn meerdere strategieën geïmplementeerd om de voortplanting van PRRSV te beheersen 14,15,16. Naast eliminatieprocedures om volledig virusnegatieve populaties te creëren of het verbeteren van de bioveiligheid en het beheer, is het toedienen van vaccins een effectief middel om PRRS te beheersen.
PRRSV is een omhuld, enkelstrengs, positief-sense RNA-virus met een lengte van ongeveer 15 kilobasen (kb). Het PRRSV-genoom bestaat uit ten minste 10 open leesframes (ORF's), een kort 5' niet-vertaald gebied (5' UTR) en een poly(A)-staart aan het eindpunt van 3' (Figuur 1A)17. Het genoom van een negatiefstrengs RNA-virus is niet-infectieus, terwijl het genoom van positiefstrengs RNA-virussen besmettelijk is. Er zijn twee hoofdstrategieën voor RNA- en DNA-transfectie voor het genereren van virusnageslacht18. Het klonen van het volledige fragment dat overeenkomt met het RNA-genoom is echter cruciaal voor de constructie van infectieuze klonen. Vanwege de lange en complexe aard van het PRRSV-genoom kan het volledige genoom niet gemakkelijk in één keer via PCR worden verkregen. Bovendien, hoewel de kunstmatige synthese van PRRSV-genen een effectieve oplossing is, is de synthese van lange fragmenten vaak duur. Om de PRRSV-expressievector van volledige lengte te verkrijgen, hebben we daarom geprobeerd deze te creëren met behulp van de homologe recombinatiemethode met meerdere inserts19,20. Helaas waren we niet in staat om de volledige genexpressievector te verkrijgen. Daarom hebben we in deze studie de juiste restrictieplaatsen toegevoegd aan de omgekeerde primer en met succes de pVAX1-PRRSV-expressievector verkregen door verschillende rondes van homologe recombinatiereacties. Bovendien kan deze methode ook deletie of mutatie van doelgenen bereiken en een groot aantal DNA-fragmenten efficiënt aan de expressievector koppelen.

<table><tbody><tr><td>1 kb plus DNA Ladder</td><td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td><td>MD113-02</td><td></td></tr><tr><td>2x Universal Green PCR Master Mix</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A303-1</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FRESCO17</td><td></td></tr><tr><td>Clean Bench</td><td>Sujing Antai Air Technology&nbsp; Co., Ltd</td><td>VD-650-U</td><td></td></tr><tr><td>DNA Electrophoresis Equipment</td><td>Cleaver Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>170905117</td><td></td></tr><tr><td>DNA Loading Buffer (6x)</td><td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td><td>BL532A</td><td></td></tr><tr><td>E. Z. N. A. Gel Extraction kit</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D2500-01</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td><td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td><td>D6943-01</td><td></td></tr><tr><td>Electro-heating Standing-temperature Cultivator</td><td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td><td>DHP-9082</td><td></td></tr><tr><td>ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A101-02</td><td></td></tr><tr><td>ExonScript RT SuperMix with dsDNase</td><td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td><td>A502-1</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0303</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest HindIII</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0504</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NheI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0974</td><td></td></tr><tr><td>FastDigest NotI</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>FD0596</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc XR</td><td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td><td>721BR07925</td><td></td></tr><tr><td>Goldview Nucleic Acid Gel Stain</td><td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td><td>YB10201ES03</td><td></td></tr><tr><td>Ice Maker Machine</td><td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>FMB100</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plate (Kanamycin)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B530113-0010</td><td></td></tr><tr><td>LB sterile liquid medium (Kanamycin)</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B540113-0001</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettors</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>Microwave Oven</td><td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td><td>NN-GM333W</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shakers</td><td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td><td>ZHWY-2102C</td><td></td></tr><tr><td>PRRSV virus</td><td>Sichuan Agricultural University</td><td>&mdash;</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>GSL Biotech, LLC</td><td>v5.1</td><td>Om primers te ontwerpen</td></tr><tr><td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories&nbsp; Co., Ltd</td><td>T100 Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>TAE buffer</td><td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td><td>B040123-0010</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp; Co., Ltd</td><td>15596026</td><td>RNA-extractiereagens</td></tr></tbody></table>

een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

De constructie van genexpressievectoren is een belangrijk onderdeel van laboratoriumwerk in de experimentele biologie. Met technische ontwikkelingen zoals Gibson Assembly wordt vectorconstructie relatief eenvoudig en efficiënt. Wanneer het volledige genoom van het Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) echter niet gemakkelijk kan worden geamplificeerd door een enkele polymerasekettingreactie (PCR) van cDNA, of het moeilijk is om een genexpressievector van volledige lengte te verkrijgen door homologe recombinatie van meerdere inserts in vitro, slaagt de huidige Gibson Assembly-techniek er niet in dit doel te bereiken.
Daarom wilden we het PRRSV-genoom in verschillende fragmenten verdelen en geschikte restrictieplaatsen introduceren in de omgekeerde primer voor het verkrijgen van PCR-geamplificeerde fragmenten. Na het samenvoegen van het vorige DNA-fragment in de vector door middel van homologe recombinatietechnologie, verwierf de nieuwe vector de splitsingsplaats van het restrictie-enzym. We kunnen de vector dus lineariseren door gebruik te maken van de nieuw toegevoegde enzymsplitsingsplaats en het volgende DNA-fragment stroomafwaarts van het stroomopwaartse DNA-fragment te introduceren.
De geïntroduceerde splitsingsplaats van het restrictie-enzym aan het 3'-uiteinde van het stroomopwaartse DNA-fragment zal worden geëlimineerd en een nieuwe splitsingsplaats zal worden geïntroduceerd in het 3'-uiteinde van het stroomafwaartse DNA-fragment. Op deze manier kunnen we DNA-fragmenten één voor één aan de vector koppelen. Deze methode is van toepassing om de PRRSV-expressievector met succes te construeren en is een effectieve methode voor het samenvoegen van een groot aantal fragmenten tot de expressievector.

In dit artikel presenteren we een in vitro recombinatiesysteem om overlappende DNA-moleculen te assembleren en te repareren met behulp van de omgekeerde primer via continu geïntroduceerde restrictieplaatsen (Figuur 1B). Dit systeem is een eenvoudige en efficiënte procedure die bestaat uit de voorbereiding van de lineaire vector en de insert-fragmenten met overhangen die door PCR zijn geïntroduceerd met primers met de juiste 5'-extensiesequenties en restrictieplaatsen; een enkelvoudige in-vitro-isotherme reactie en de standaard chemische omzetting van recombinatieproducten in geschikte gastheerbacteriën; en de selectie van een positieve kolonie en het verkrijgen van de recombinante vector voor de volgende kloneringsronde. Om de pVAX1-PRRSV-vector stap voor stap te verkrijgen, moeten beperkingsplaatsen afwezig zijn in de inserts en meerdere kloonplaatsen van de recombinante vector.
Omdat het moeilijk is om volledige en complexe gensequenties te verkrijgen met een enkele PCR, konden insertfragmenten van PRRSV alleen worden geamplificeerd met zes PCR-reacties (Figuur 1C). Tijdens de eerste ronde van recombinatie werd fragment 1 van PRRSV met succes ingebracht in de pVAX1-vector en het nieuwe recombinante plasmide met de geïntroduceerde restrictieplaatsen (NheI, een enkele enzymsplitsingsplaats) werd pVAX1-F1 genoemd (Figuur 1D). Bij de tweede ronde van recombinatie werd de pVAX1-F1-vector gelineariseerd met het restrictie-enzym NheI. Fragment 2 werd met succes ingebracht in de pVAX1-F1-vector, wat het recombinante plasmide pVAX1-F2 opleverde met restrictieplaatsen (NheI, een enkele enzymsplitsingsplaats) (Figuur 1D). Voor de derde ronde van recombinatie, zoals weergegeven in figuur 1D, werd fragment 3 met succes in de pVAX1-F2-vector ingebracht om pVAX1-F3 te verkrijgen met restrictieplaatsen (NheI, een enkele enzymsplitsingsplaats). In de vierde ronde van recombinatie verkregen we de pVAX1-F4-vector door fragment 4 te introduceren met restrictieplaatsen EcoRV (een enkele enzymsplitsingsplaats). Vervolgens werd de pVAX1-F4-vector gelineariseerd door het restrictie-enzym EcoRV en NotI. Fragment 5 werd gekloond in de pVAX1-F4-vector om pVAX1-F5 te verkrijgen met restrictieplaatsen (nietI, een enkele enzymsplitsingsplaats). Na de laatste ronde van recombinatie werd de PRRSV-overexpressievector van volledige lengte (pVAX1-PRRSV) met succes verkregen (aanvullend bestand 1). Zoals geïllustreerd in figuur 1D, wordt het nieuwe recombinante plasmide groter en groter met de continue introductie van fragmenten. Deze resultaten gaven dus aan dat de combinatie van het toevoegen van geschikte beperkingsplaatsen en het gebruik van de Gibson Assembly-techniek de efficiënte introductie van DNA-fragmenten in de vector kan bereiken.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66320/66320fig01.jpg"> Figuur 1: Organisatie en constructie van pVAX1-F6 (pVAX1-PRRSV) vectoren door homologe recombinatie. (A) Organisatie van het PRRSV-genoom. ORF1b codeert voor RNA-afhankelijke RNA-polymerase, RNA-helicase en multinucleaire zinkbindende domeinen. Andere ORF's coderen voor membraan-geassocieerde glycoproteïnen (GP2, GP3, GP4 en GP5), E-eiwit, membraanenvelop-eiwit en het nucleocapside-eiwit. (B) Schematisch diagram van het proces van het genereren van de pVAX1-PRRSV-vector. (C) DNA-agarosegel vertoont PCR-amplificatie van doelfragmenten. (D) Met het invoegen van fragmenten neemt de grootte van de recombinante vector geleidelijk toe. Afkortingen: PRRSV = Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus; ORF = open leeskader; GP = glycoproteïne; E = E-eiwit; M = membraan envelop eiwit; N = nucleocapside-eiwit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>PRRSV RNA</td>
			<td>2 μL (25 ng)</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>RNase-vrij water</td>
			<td>11 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x Reactie Mix</td>
			<td>4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Opperste enzymmix</td>
			<td>3 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Temperatuur</td>
			<td>Duur</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr><tr><td>25 °C</td>
			<td>10 minuten</td>
			<td>Verwijder genomisch DNA, willekeurige primers paren met RNA-sjablonen</td>
		</tr><tr><td>55 °C</td>
			<td>15 minuten</td>
			<td>Snelle inactivatie van dsDNase en reverse transcriptie</td>
		</tr><tr><td>85 °C</td>
			<td>5 minuten</td>
			<td>Reverse transcriptase-inactivatie</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Reverse transcriptie instellen en voorwaarden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5x SuperFi II-buffer</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM voorwaartse primer</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM Omgekeerde Primer</td>
			<td>2,5 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 mM dNTP's</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>cDNA (PRRSV)</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Platina SuperFi II DNA-polymerase</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>32 μL</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>De stap van de cyclus</td>
			<td>Temperatuur</td>
			<td>Duur</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr><tr><td>Initiële denaturatie</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>jaren '30</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Denaturatie</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 seconden</td>
			<td>35</td>
		</tr><tr><td>Annealing</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>10 seconden</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Extensie</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>3 min</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Laatste verlenging</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>5 minuten</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Houden</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Opstelling en omstandigheden van de PCR-reactie.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>pVAX1 linearisatie</td>
			<td>pVAX1-F1 linearisatie</td>
			<td>pVAX1-F2 linearisatie</td>
			<td>pVAX1-F3 linearisatie</td>
			<td>pVAX1-F4 linearisatie</td>
			<td>pVAX1-F5 linearisatie</td>
		</tr><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vector</td>
			<td>10 μL (1 μg) pVAX1</td>
			<td>6 μl (1 μg) pVAX1-F1</td>
			<td>3,5 μL (1 μg) pVAX1-F2</td>
			<td>7,5 μL (1 μg) van pVAX1-F3</td>
			<td>10 μL (1 μg) pVAX1-F4</td>
			<td>15 μl (1 μg) pVAX1-F5</td>
		</tr><tr><td>Restrictie-enzym 1</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL NdeI</td>
			<td>1 μL EcoRV</td>
			<td>1 μL NotI</td>
		</tr><tr><td>Restrictie-enzym 2</td>
			<td>1 μL HindIII</td>
			<td>1 μL HindIII</td>
			<td>0,5 μL CIAP</td>
			<td>0,5 μL CIAP</td>
			<td>1 μL NotI</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>10x FastDigest buffer</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>10 μL</td>
			<td>13 μL</td>
			<td>9 μL</td>
			<td>6 μL</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>Totaal</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
			<td>20 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 3: Linearisatiemengsel van pVAX1, pVAX1-F1, pVAX1-F2, pVAX1-F3, pVAX1-F4 en pVAX1-F5.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume</td>
		</tr><tr><td>ExonArt naadloze kloon- en montageset</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr><tr><td>Lineaire Vector</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>Stuk</td>
			<td>200 ng</td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>tot 10 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 4: Installatie van ExonArt voor naadloze klonen en montagereacties.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bestanddeel</td>
			<td>Volume</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>2x Universele Groene PCR Master Mix</td>
			<td>10 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM voorwaartse primer</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>10 μM Omgekeerde Primer</td>
			<td>0,4 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sjabloon</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>ddH2O</td>
			<td>8,2 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Totaal</td>
			<td>20 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Temperatuur</td>
			<td>Duur</td>
			<td>Cycli</td>
		</tr><tr><td>95 °C</td>
			<td>jaren '30</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>98 °C</td>
			<td>10 seconden</td>
			<td>28</td>
		</tr><tr><td>56 °C</td>
			<td>10 seconden</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>3 min</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>72 °C</td>
			<td>5 minuten</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4 °C</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 5: Kolonie PCR opstelling en voorwaarden.
Aanvullende figuur S1: Schema van het proces van primerontwerp. Andere primerontwerpen zoals P5 en P6 worden ook getoond. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS1.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende figuur S2: Primer sequenties. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/66320_Supplemental_FigS2.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 1: DNA-sequentiegegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66320/Supplemental_File_2.rar" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Hier presenteren we een protocol om de pVAX1-PRRSV-expressievector te verkrijgen door geschikte beperkingsplaatsen te introduceren aan het 3'-uiteinde van de inserts. We kunnen de vector lineariseren en DNA-fragmenten één voor één aan de vector verbinden door middel van homologe recombinatietechnologie.

Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

Dit protocol demonstreert de constructie van een langdurige en ingewikkelde genexpressievector. Wanneer een DNA-fragment van volledige lengte niet kan worden verkregen door een enkele PCR van cDNA, of wanneer de genexpressievector van volledige lengte niet kan worden verkregen door meervoudige homologe recombinatie in vitro, is deze methode van toepassing. Momenteel wordt het klonen van ligatie met meerdere inserts gebruikt om een DNA-fragment van volledige lengte te verkrijgen voor klonen in een geschikte vector.Deze methode kan deletie of mutatie van doelgenen bereiken en een groot aantal DNA-fragmenten efficiënt verbinden met de expressievector.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Lentivirale expressievectoren zijn het meest effectief voertuigen stabiel tot expressie verschillende effector-moleculen of reporter-constructen in delende en niet-delende zoogdiercellen en hele organismen. Hier bieden we een protocol over hoe lentivector expressie constructen te verpakken in pseudoviral deeltjes en target cellen met behulp van de pseudoviral deeltjes transduceren.

Verpakking HIV-of FIV-based Lentivector expressie constructen en transductie van VSV-G pseudogetypeerde virale deeltjes

De reverse genetics systeem voor de Rift Valley koorts virus MP-12 vaccinstam is een handig hulpmiddel voor het creëren van extra MP-12 mutanten met verhoogde verzwakking en immunogeniciteit. We beschrijven het protocol te genereren en karakteriseren NSS mutante stammen.

Met behulp van reverse genetics aan de NSS-gen van de Rift Valley Fever virus MP-12 Strain om Vaccine veiligheid en effectiviteit te verbeteren manipuleren

Hier beschrijven protocol alleen gebaseerd op cel infectie, hetgeen het rendement van recombinant parvovirus productie van meer dan 100 maal in vergelijking met andere protocollen gebruikt verbetert. Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van een nieuw adenovirus 5 gebaseerde helper met de parvovirus VP transcriptie-eenheid (Ad-VP).

Efficiënte Recombinant Parvovirus productie met de hulp van Adenovirus-afgeleide systemen

Gene targeting-methodologieën kunnen worden gebruikt om transgene muizen te genereren met knockout-, knock-in- en getaggede allelen. Hier beschrijven we een verbeterde methode van recombineren in E. coli, die we 'subklonen plus invoegen' noemen, en die kan worden gebruikt om snel aangepaste gene targeting-vectoren te genereren.

Subkloning Plus Insertion (SPI) - A Novel recombineering Methode voor de snelle bouw van gene targeting vectoren

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

Vacciniavirus (VV) is op grote schaal gebruikt in biomedisch onderzoek en de verbetering van de volksgezondheid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige, zeer efficiënte methode om de VV genoom bewerken met een CRISPR-Cas9 systeem.

Een eenvoudige en efficiënte aanpak Mutant Vaccinia Virus vectoren Construct

Herpesvirus van kalkoenen (HVT) wordt veel gebruikt als een vector-platform voor de generatie van recombinante vaccins tegen een aantal aviaire ziekten. Dit artikel beschrijft een eenvoudige en snelle aanpak voor de generatie van recombinante HVT-vectored vaccins met behulp van een geïntegreerde NHEJ-CRISPR/Cas9 en de Cre-Lox systeem.

Genereren van recombinante aviaire Herpesvirus vectoren met CRISPR/Cas9 Gene bewerken

Beschrijven we een methode voor het genereren van en sturen genetisch gemodificeerde respiratoir syncytieel virussen (RSVs) en een geoptimaliseerde plaque assay voor RSVs. We illustreren dit protocol door het creëren van twee recombinante virussen die respectievelijk toestaan kwantificering van RSV replicatie en live analyse van RSV opneming organen en integratie-organen-geassocieerde korrels dynamiek.

Generatie, versterking en titratie van recombinante respiratoir syncytieel virussen

Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.

Vereenvoudigde Reverse Genetics Methode om Recombinant Rotavirussen Expressing Reporter Eiwitten terug te vorderen

Dit is een methode om "scarless" recombinant vaccinia virussen te genereren met behulp van host-range selectie en visuele identificatie van recombinante virussen.

Snelle, naadloze generatie recombinante poxvirussen met behulp van Host Range en Visuele Selectie

Voor een diepgaande mechanistische analyse van de RNA-synthese van het respiratoire syncytiële virus (RSV) rapporteren we een protocol voor het gebruik van de chaperonnefofoproteïne (P) voor coexpressie van het RNA-vrije nucleoproteïne (N0) voor de daaropvolgende in vitro assemblage van de virusspecifieke nucleocapsiden (NCs).

Generatie en assemblage van virusspecifieke nucleocapsiden van het respiratoire syncytiële virus

Leer een naadloze kloneringsmethode voor de constructie van complexe PRRSV-genexpressievectoren met behulp van homologe recombinatie en PCR. Deze aanpak maakt efficiënte incorporatie van meerdere DNA-fragmenten mogelijk.

Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus (Video) | JoVE Journal

Een naadloze kloneringsbenadering voor de vectorconstructie van de reproductieve en respiratoire syndroomexpressie van het varkensvirus

Meer video's verkennen