Name: AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNAs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Leer AQRNA-seq voor absolute kwantificering van kleine RNA's in Mycobacterium bovis BCG. Deze methode overkomt beperkingen van traditionele RNA-Seq en helpt bij het bestuderen van tRNA-dynamiek tijdens dormancy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs van dit werk zijn de auteurs van het oorspronkelijke artikel waarin de AQRNA-seq-technologiewordt beschreven 7 dankbaar. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) en de National Research Foundation of Singapore via de Singapore-MIT Alliance for Research and Technology Antimicrobial Resistance IRG.

Analyse van tRNA-dynamiek met behulp van AQRNA-seq

<ol><li>Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+RNA+sequencing+into+clinical+diagnostics%3A+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gen%22%5BJournal%5D)">Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges.</a> Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).</li>
<li>Grillone, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-coding+RNAs+in+cancer%3A+platforms+and+strategies+for+investigating+the+genomic+%26%2334%3Bdark+matter.%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic &#34;dark matter.&#34.</a> J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117(2020).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).</li>
<li>Goh, J. J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+specific+multiplexed+RNA+imaging+in+tissues+with+split-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH.</a> Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).</li>
<li>Moses, L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Museum+of+spatial+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Museum of spatial transcriptomics.</a> Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).</li>
<li>Cummings, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+genetic+diagnosis+in+Mendelian+disease+with+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing.</a> Sci Transl Med. 9 (386), 5209(2017).</li>
<li>Hu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mapping+of+the+cellular+small+RNA+landscape+with+AQRNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq.</a> Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).</li>
<li>Alon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+bias+in+high-throughput+multiplex+sequencing+of+miRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA.</a> Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).</li>
<li>Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+in+ligation-based+small+RNA+sequencing+library+construction+is+determined+by+adaptor+and+RNA+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure.</a> PLoS One. 10 (5), e0126049(2015).</li>
<li>Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cell+stresses+induce+unique+patterns+of+tRNA+up-+and+down-regulation%3A+tRNA-seq+for+quantifying+changes+in+tRNA+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number.</a> Nuc Acids Res. 42 (22), e170(2014).</li>
<li>Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+frequencies+of+post-transcriptional+modifications+in+tRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs.</a> RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+impact+of+RNA+secondary+structure+across+the+Arabidopsis+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome.</a> Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).</li>
<li>García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+diversity+is+a+systematic+source+of+variation+in+RNA-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data.</a> PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939(2022).</li>
<li>FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2010).</li>
<li>Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fastp%3A+an+ultra-fast+all-in-one+FASTQ+preprocessor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor.</a> Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R%3A+a+language+and+environment+for+statistical+computing%5BTitle%5D)+AND+%22R+Foundation+for+Statistical+Computing%22%5BJournal%5D)">R: a language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. (2022).</li>
<li>Ougland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AlkB+restores+the+biological+function+of+mRNA+and+tRNA+inactivated+by+chemical+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation.</a> Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).</li>
<li>Bernhardt, H. S., Tate, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primordial+soup+or+vinaigrette%3A+did+the+RNA+world+evolve+at+acidic+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Direct%22%5BJournal%5D)">Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH.</a> Biol Direct. 7, 4(2012).</li>
<li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+local+alignment+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet.+J%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
</ol>

P.C.D. is een uitvinder van twee patenten (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) met betrekking tot het gepubliceerde werk.

De workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek is ontworpen om de opname van RNA's in een monster te maximaliseren en het afvallen van polymerase tijdens reverse transcriptiete minimaliseren 7. Door middel van een tweestaps linkerligatie worden nieuwe DNA-oligo's (Linker 1 en Linker 2) in overmaat geligeerd om het RNA in het monster volledig aan te vullen. Overtollige linkers kunnen efficiënt worden verwijderd met RecJf, een exonuclease van 5' tot 3' dat specifiek is voor enkelstre...

Next-generation sequencing (NGS), ook bekend als massively parallel sequencing, is een DNA-sequencingtechnologie die DNA-fragmentatie, ligatie van adaptor-oligonucleotiden, op polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde amplificatie, sequentiebepaling van het DNA en herassemblage van de fragmentsequenties tot een genoom omvat. De aanpassing van NGS aan sequentie-RNA (RNA-seq) is een krachtige benadering om RNA-transcripten en hun varianten te identificeren en te kwantificeren1. Innovatieve ontwikkelingen in workflows voor de voorbereiding van RNA-bibliotheken en pijplijnen voor bio-informaticaanalyse, in combinatie met vooruitgang in laboratoriuminstrumentatie, hebben het repertoire van RNA-seq-toepassingen uitgebreid, en zijn verder gegaan dan exoomsequencing naar geavanceerde functionele omics zoals niet-coderende RNA-profilering2, analyse van één cel3, ruimtelijke transcriptomics 4,5, alternatieve splicinganalyse6onder andere. Deze geavanceerde RNA-seq-methoden onthullen complexe RNA-functies door middel van kwantitatieve analyse van het transcriptoom in normale en zieke cellen en weefsels.
Ondanks deze vooruitgang in RNA-seq, beperken verschillende belangrijke technische kenmerken de kwantitatieve kracht van de methode. Hoewel de meeste RNA-seq-methoden nauwkeurige en nauwkeurige kwantificering van veranderingen in de niveaus van RNA's tussen experimentele variabelen (d.w.z. biologische monsters en/of fysiologische toestanden) mogelijk maken, kunnen ze geen kwantitatieve vergelijkingen maken van de niveaus van RNA-moleculen in een monster. De meeste RNA-seq-methoden kunnen bijvoorbeeld het relatieve aantal kopieën van individuele tRNA-isoacceptormoleculen in een cellulaire pool van tot expressie gebrachte tRNA's niet nauwkeurig kwantificeren. Zoals benadrukt in de begeleidende publicatie7, komt deze beperking tot RNA-seq voort uit verschillende kenmerken van de RNA-structuur en de biochemie van bibliotheekvoorbereiding. De activiteit van de ligatie-enzymen die worden gebruikt om de 3'- en 5'-end sequencing linkers aan RNA-moleculen te hechten, wordt bijvoorbeeld sterk beïnvloed door de identiteit van de terminale nucleotiden van het RNA en de sequencing linkers. Dit leidt tot grote variaties in de efficiëntie van linkerligaties en diepgaande artefactische verhogingen in sequencing reads 8,9,10.
Een tweede reeks beperkingen vloeit voort uit de inherente structurele eigenschappen van RNA-moleculen. In het bijzonder kunnen de vorming van secundaire RNA-structuren en dynamische veranderingen in de tientallen post-transcriptionele RNA-modificaties van het epitranscriptoom polymerase-uitval of mutatie veroorzaken tijdens omgekeerde transcriptie. Deze fouten resulteren in onvolledige of afgekapte cDNA-synthese of veranderde RNA-sequentie. Hoewel beide fenomenen kunnen worden uitgebuit om secundaire structuren of sommige wijzigingen in kaart te brengen, verslechteren ze de kwantitatieve nauwkeurigheid van RNA-seq als de volgende stappen voor de voorbereiding van de bibliotheek er niet in slagen afgekapte cDNA's vast te leggen of als gegevensverwerking gemuteerde sequenties weggooit die niet overeenkomen met een referentiedataset11,12. Bovendien vermindert de immense chemische, lengte- en structurele diversiteit van RNA-transcripten, evenals het gebrek aan hulpmiddelen om lange RNA's uniform te fragmenteren, de toepasbaarheid van de meeste RNA-seq-methoden op alle RNA-soorten13.
De AQRNA-seq-methode (absolute kwantificering RNA-sequencing) is ontwikkeld om een aantal van deze technische en biologische beperkingen weg te nemen die de kwantitatieve nauwkeurigheid beperken7. Door sequentieafhankelijke vooroordelen bij het vastleggen, ligeren en amplificeren tijdens de voorbereiding van de RNA-sequencingbibliotheek te minimaliseren, bereikt AQRNA-seq superieure lineariteit in vergelijking met andere methoden, waarbij 75% van een referentiebibliotheek van 963 miRNA's nauwkeurig wordt gekwantificeerd met een 2-voudige nauwkeurigheid. Deze lineaire correlatie van sequencing, leestelling en RNA-overvloed wordt ook waargenomen in een analyse van een pool van RNA-oligonucleotidestandaarden met variabele lengte en in verwijzing naar orthogonale methoden zoals northern blotting. Door lineariteit vast te stellen tussen sequencing, het aantal leessnelheden en de overvloed aan RNA kan AQRNA-seq een nauwkeurige, absolute kwantificering van alle RNA-soorten in een monster bereiken.
Hier volgt een beschrijving van het protocol voor de workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek en de bijbehorende downstream data-analysepijplijn. De methode werd toegepast om de dynamiek van de tRNA-overvloed tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode en daaropvolgende reanimatie op te helderen in het Mycobacterium bovis bacillen de Calmette et Guérin (BCG) model van tuberculose. De resultaten werden gepresenteerd voor de verkennende visualisatie van de sequentiegegevens, samen met daaropvolgende clustering- en differentiële expressieanalyses die waarneembare patronen in de overvloed aan tRNA onthulden die verband houden met verschillende fenotypes.

<table><tbody><tr><td>2-ketoglutaraat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75890</td><td>Bereid een werkoplossing (1 M) en bewaar deze bij -20&ordm;C</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5'-Trifosfaat (ATP)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (component #: N0437AVIAL)</td><td>NEB M0437M bevat T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reactiebuffer (10X), PEG 8000 (1X) en ATP (100 mM); bereid een werkoplossing (10 mM) en bewaar deze bij -20&ordm;C</td></tr><tr><td>AGAROSE GPG/LE</td><td>AmericanBio</td><td>AB00972-00500</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Ammonium ijzer(II) sulfaat hexahydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2262</td><td>Bereid een werkoplossing (0,25 M) en bewaar deze bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Bioanalyzer Small RNA Analysis</td><td>Agilent</td><td>5067-1548&nbsp;</td><td>De Small RNA Analysis wordt gebruikt voor het controleren van de kwaliteit van invoer-RNA's en de efficiëntie van enzymatische reacties (bijv. Linker 1 ligatie)</td></tr><tr><td>Rundvlees Serum Albumine (BSA; 10 mg/mL)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B9000</td><td>Dit product werd op 12/15/2022 stopgezet en is vervangen door Recombinant Albumine, Molecular Biology Grade (NEB B9200).</td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>4441-10</td><td></td></tr><tr><td>Demethylase&nbsp;</td><td>ArrayStar</td><td>AS-FS-004</td><td>Demethylase wordt geleverd met de rtStar tRNA Pretreatment &amp; First-Strand cDNA Synthese Kit (AS-FS-004)</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Oplossingsmix</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L (component #: N0447LVIAL)</td><td>Deze dNTP Oplossingsmix bevat gelijkwaardige concentraties van dATP, dCTP, dGTP en dTTP (10 mM elk)</td></tr><tr><td>Digital Dual Heat Block</td><td>VWR Scientific Products</td><td>13259-052</td><td>Het verwarmingsblok wordt gebruikt met de QIAquick&nbsp;Gel Extractie Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>DyeEx&nbsp;2.0 Spin Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>63204&nbsp;</td><td>Effectief voor het verwijderen van korte restanten (bijv. oligo's minder dan 10 bp in lengte)</td></tr><tr><td>Elektroforese Voeding</td><td>Bio-Rad Labrotories</td><td>PowerPac 300</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf PCR Tubes (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>0030124537</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (0,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363611</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl alcohol (Ethanol), Puur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023&nbsp;</td><td>Het pure ethanol wordt gebruikt met de Oligo Clean en Concentrator Kit van Zymo Research</td></tr><tr><td>Gel Imaging Systeem</td><td>Alpha Innotech</td><td>FluorChem 8900</td><td></td></tr><tr><td>Gel Ladingskleurstof, Paars (6X), geen SDS</td><td>New England Biolabs</td><td>N0556S (component #: B7025SVIAL)</td><td>NEB N0556S bevat Quick-Load Paars 50 bp DNA Ladder en Gel Ladingskleurstof, Paars (6X), geen SDS</td></tr><tr><td>GENESYS 180 UV-Vis Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840-309000</td><td>De spectrofotometer wordt gebruikt voor het meten van de oligoconcentraties met behulp van de Wet van Beer's</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>Bereid een werkoplossing (1 M; pH = 8 met NaOH) en bewaar deze bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Zoutzuur (HCl)&nbsp;</td><td>VWR Scientific Products</td><td>BDH3028&nbsp;</td><td>Bereid een werkoplossing (5 M) en bewaar deze bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Puur</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3032-16</td><td>Isopropanol wordt gebruikt met de QIAquick&nbsp;Gel Extractie Kit&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Ascorbinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td>Bereid een werkoplossing (0,5 M) en bewaar deze bij -20&ordm;C</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 Spectrofotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 (10X)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0264L (component #: B7002SVIAL)</td><td>NEB M0264L bevat RecJf (30 U/μL) en NEBuffer 2 (10X); bewaar bij -20 &deg;C</td></tr><tr><td>Nuclease-Vrij Water (niet DEPC-Behandeld)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9938&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Oligo Clean &amp; Concentrator Kit&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061&nbsp;</td><td>Bewaar bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>PEG 8000 (50% oplossing)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M (component #: B1004SVIAL)</td><td>NEB M0437M bevat T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reactiebuffer (10X), PEG 8000 (1X) en ATP (100 mM); bereid een werkoplossing (10 mM) en bewaar deze bij -20&ordm;C</td></tr><tr><td>Peltier Thermische Cycler</td><td>MJ Research</td><td>PTC-200</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:isoamyl&nbsp;alcohol 25:24:1 pH = 5.2&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J62336&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Buffer (5X)</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PrimeScript Reverse Transcriptase</td><td>TaKaRa</td><td>2680A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick&nbsp;Gel Extractie Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Deze kit vereist een verwarmingsblok en isopropanol om mee te werken</td></tr><tr><td>Quick-Load Paars 100 bp DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N0551S (component #: N0551SVIAL)</td>

aqrna-seq voor het kwantificeren van kleine rna's

AQRNA-seq for Quantifying Small RNAs

AQRNA-seq biedt een directe lineaire relatie tussen sequencing-leestellingen en het aantal kleine RNA-kopieën in een biologisch monster, waardoor een nauwkeurige kwantificering van de pool van kleine RNA's mogelijk is. De hier beschreven voorbereidingsprocedure voor de AQRNA-seq-bibliotheek omvat het gebruik van op maat ontworpen sequencing-linkers en een stap voor het verminderen van methylatie-RNA-modificaties die de omgekeerde transcriptieprocesiviteit blokkeren, wat resulteert in een verhoogde opbrengst van cDNA's van volledige lengte. Daarnaast wordt een gedetailleerde implementatie van de bijbehorende bioinformatica-pijplijn gepresenteerd. Deze demonstratie van AQRNA-seq werd uitgevoerd door middel van een kwantitatieve analyse van de 45 tRNA's in Mycobacterium bovis BCG, geoogst op 5 geselecteerde dagen gedurende een tijdsverloop van 20 dagen van voedingsdeprivatie en 6 dagen van reanimatie. Lopende inspanningen om de efficiëntie en nauwkeurigheid van AQRNA-seq te verbeteren, zullen hier ook worden besproken. Dit omvat het onderzoeken van methoden om gelzuivering te voorkomen voor het verminderen van problemen met primerdimeer na PCR-amplificatie en om het aandeel van volledige aflezingen te vergroten om een nauwkeurigere leesmapping mogelijk te maken. Toekomstige verbeteringen aan AQRNA-seq zullen gericht zijn op het vergemakkelijken van automatisering en high-throughput implementatie van deze technologie voor het kwantificeren van alle kleine RNA-soorten in cel- en weefselmonsters van diverse organismen.

Mycobacterium bovis BCG (bacillen de Calmette et Guérin) stam 1173P2 die een exponentiële groei doormaakten, werden onderworpen aan een tijdreeks (0, 4, 10 en 20 dagen) van uithongering van voedingsstoffen, gevolgd door een 6-daagse reanimatie in een voedingsrijk medium zoals eerder gepresenteerd in Hu et al.7. Kleine RNA's werden geïsoleerd uit een bacteriecultuur, met drie biologische replicaten, op elk van de vijf aangewezen tijdstippen. Illumina-bibliotheken werden gebouwd met behulp ...

Absolute kwantificering RNA-sequencing (AQRNA-seq) is een technologie die is ontwikkeld om het landschap van alle kleine RNA's in biologische mengsels te kwantificeren. Hier worden zowel de bibliotheekvoorbereidings- als de gegevensverwerkingsstappen van AQRNA-seq gedemonstreerd, waarbij veranderingen in de transfer-RNA (tRNA)-pool in Mycobacterium bovis BCG worden gekwantificeerd tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

AQRNA-seq provides a direct linear relationship between sequencing read counts and small RNA copy numbers in a biological sample, thus enabling accurate ...

AQRNA-sequencing brengt kleine RNA's zoals microRNA's, tRNA's en tRNA-fragmenten in vrijwel elk cel- of weefselmonster kwantitatief in kaart. Het kan worden gebruikt om enkele van de 170 bekende tRNA-modificaties in kaart te brengen, maar er zijn andere methoden die specifieker zijn voor het in kaart brengen. Je kunt AQRNA-seq gebruiken om ziektebiomarkers in de RNome te ontdekken en eiwittranslatiemechanismen op systeemniveau te verkennen.De meeste RNA-seq-methoden kunnen de overvloed aan individuele RNA-moleculen in een monster niet nauwkeurig kwantificeren. Dit wordt veroorzaakt door zowel structurele eigenschappen van het RNA, zoals secundaire structuren, posttranscriptionele modificaties, als door de biochemie van bibliotheekvoorbereiding, zoals ligatiebiases van duizendvoudig geïnduceerd door de terminale nucleotiden op de RNA's. AQRNA-seq is ontwikkeld om verschillende technische en biologische uitdagingen te overwinnen, waardoor de nauwkeurige kwantificering van de RNA-overvloed in het monster wordt beperkt.In vergelijking met andere zaken bereikt het lineariteit tussen hertellingen en kopieernummers van RNA-moleculen, nauwkeurig kwantificeert het 75% van een referentiebibl

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

MicroRNA's (miRNA's) zijn een wijdverspreid geconserveerde klasse van regulerende moleculen. Hier beschrijven we een miRNA-kloonmethode die afhankelijk is van twee krachtige ligatiefasen gevolgd door high-throughput sequencing. Onze methode maakt nauwkeurige genoom-wide kwantificering van miRNA's mogelijk.

Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing

Circulerende microRNAs zijn onlangs naar voren gekomen als veelbelovend en nieuwe biomarkers voor verschillende vormen van kanker en andere ziekten. Het doel van dit artikel is om drie verschillende probes gebaseerde real-time PCR-platforms en methoden die beschikbaar zijn om te kwantificeren en te bepalen de overvloed aan circulerende microRNAs zijn te bespreken.

Probe-gebaseerde real-time PCR Benaderingen voor kwantitatieve meting van microRNAs

Er wordt een protocol gegeven om bacteriële 16S rRNA-genen en transcripten uit kustsedimenten te kwantificeren via real-time PCR. De methodologie omvat de gezamenlijke extractie van DNA en RNA; bereiding van DNA-vrij RNA; en kwantificering van 16S rRNA-genen en transcripten via RT-q-PCR, inclusief de constructie van een standaardcurve.

Gelijktijdig DNA-RNA-extractie uit kustsedimenten en kwantificering van 16S rRNA genen en transcripties van Real-time PCR

We beschrijven een op getarget RNA-sequencing gebaseerde methode die de voorbereiding van geïndiceerde cDNA-bibliotheken, hybridisatie en captuur met aangepaste sondes en data-analyse om geselecteerde transcripten te onderzoeken op genexpressie, mutaties en genfusies omvat. Getarget RNAseq maakt een kosteneffectieve, snelle evaluatie van geselecteerde transcripten mogelijk op een desktop sequencer.

Gerichte RNA Sequencing Assay Gene Expression en Genomic Wijzigingen karakteriseren

Dit protocol beschrijft een methode voor de toewijzing pre-mRNA 3' eind verwerking van sites.

3' eind Sequencing bibliotheek voorbereiding met A-seq2

Hier beschrijven we een stapsgewijze strategie voor het isoleren van kleine Rna's, verrijkend voor Microrna's en het voorbereiden van samples voor sequentiëren met hoge doorvoer. Vervolgens beschrijven we hoe u de volgorde leest en lijnt u deze uit op microRNAs met behulp van open source tools.

Een complete pijplijn voor het isoleren en Sequentiëren van Microrna's en het analyseren ervan met open source tools

Circulaire Rna's (Circrna's) zijn niet-Codeer Rna's die mogelijk rollen hebben in transcriptionele regulatie en die interacties tussen eiwitten bemiddel- Na beoordeling van verschillende parameters voor de bouw van circRNA sequencing Bibliotheken, een protocol werd gecompileerd met behulp van gestrande Total RNA Library voorbereiding met RNase R pre-behandeling en wordt hier gepresenteerd.

Identificatie van circulaire Rna's met RNA-sequencing

We presenteren een gedetailleerd klein RNA Library Reparatie protocol met minder bias dan standaardmethodes en een verhoogde gevoeligheid voor 2 '-O-methyl rna's. Dit protocol kan worden gevolgd met behulp van zelfgemaakte reagentia om kosten te besparen of kits te gebruiken voor het gemak.

Verbetering van kleine RNA-SEQ: minder bias en betere detectie van 2 '-O-methyl Rna's

Hier gepresenteerd is een protocol voor laser-capture microdissection (LCM) van plantaardige weefsels. LCM is een microscopische techniek voor het isoleren van gebieden van weefsel op een contaminatievrije manier. De procedure omvat weefselfixatie, paraffine inbedding, sectioning, LCM en RNA extractie. RNA wordt gebruikt in de downstream weefselspecifieke, tijdelijk opgeloste analyse van transcripto's.

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing voor ruimtelijke en temporale weefsel-specifieke genexpressie analyse in planten

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Leer AQRNA-seq voor absolute kwantificering van kleine RNA's in Mycobacterium bovis BCG. Deze methode overkomt beperkingen van traditionele RNA-Seq en helpt bij het bestuderen van tRNA-dynamiek tijdens dormancy.

AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Meer video's verkennen