Name: Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-09T14:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 56 s
Description: Leer infectieanalyses met Shigella om hechting, invasie en intracellulaire replicatie in epitheelcellijnen te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers therapeutica te ontwikkelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteuning voor de auteurs omvat de afdeling Kindergeneeskunde van het Massachusetts General Hospital, de Executive Committee on Research Interim Support Funding (ISF)-prijs 2022A009041, de subsidie van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases R21AI146405 en de National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases-subsidie Nutrition Obesity Research Center in Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. De financiers hadden geen rol in de opzet van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Protocollen voor het analyseren van Shigella-infectie in epitheelcellen van de dikke darm

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dit protocol beschrijft een reeks van drie gestandaardiseerde assays om Shigella-adhesie, invasie en intracellulaire replicatie van darmepitheelcellen te bestuderen. Hoewel deze methoden slechts aangepaste versies zijn van klassieke gentamicine-assays die worden gebruikt om de invasie en intracellulaire replicatie van verschillende bacteriële pathogenen in gastheercellen te bestuderen 49,50,51, moeten speciale overwegingen worden toegepast bij het bestuderen van Shigella.
Shigella zijn facultatieve anaëroben, die optimaal groeien bij 37 °C in een rijk medium met beluchting43. Bij het uitvoeren van deze tests om de effecten van verschillende omgevingssignalen of metabolieten op Shigella-infecties te onderzoeken, wordt aanbevolen om Shigella 's nachts in rijke media te laten groeien en vervolgens te subcultureren in gedefinieerde of gesupplementeerde media tot halverwege de logfase voorafgaand aan infectie. Maximale virulentie-genexpressie vindt plaats tijdens de logaritmische groeifase 52,53. Het subcultiveren van Shigella-culturen van de ene op de andere dag en het toestaan van bacteriegroei tot een exponentiële fase (OD600 ~ 0,7) zijn dus noodzakelijke stappen om de virulentie van Shigella goed te beoordelen. Verder is virulentiegenexpressie temperatuurafhankelijk. Om alleen tijdens gastheerinfectie specifiek tot expressie te komen, worden virulentiegenen geïnduceerd bij fysiologische temperaturen van de gastheer (37 °C) en strikt onderdrukt bij lagere temperaturen (bijv. 30 °C)54. Om de expressie van virulentiegenen te garanderen, moeten bacteriële subcultuur en infecties worden uitgevoerd bij 37 °C, met de nodige zorg om ervoor te zorgen dat de temperatuur niet onder 37 °C daalt. Een groot virulentieplasmide van 220 kilobase, dat codeert voor de moleculaire machinerie die nodig is voor invasie en epitheelcelinfectie, is een essentiële virulentiedeterminant voor alle Shigella spp5. Herhaalde passaging en langdurige groei bij 37 °C bevorderen virulentie plasmide-instabiliteit, wat resulteert in plasmideverlies en Shigella-cellen avirulent maakt55. Om het onderhoud van virulentieplasmide en de expressie van cruciale virulentiegenen te garanderen, wordt aanbevolen om bacteriën om de twee weken rechtstreeks uit de diepvriesvoorraden opnieuw te plaatsen op verse TSB + Congo rode indicatorplaten. Congo rode agar kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen wild-type virulente (rood, CR+) kolonies en avirulente (witte, CR-) kolonies die het virulentieplasmide45 hebben verloren. Als virulentieplasmide-instabiliteit herhaaldelijk wordt waargenomen, kunnen 's nachts culturen van Shigella worden geïncubeerd bij 30 °C om virulentieplasmideverlies te voorkomen, gevolgd door subculturatie bij 37 °C om virulentiegenexpressie te bevorderen43. Ten slotte, als analyses met mutanten en/of gecomplementeerde stammen worden uitgevoerd, waarbij antibiotische markers aanwezig zijn in deze bacteriestammen, wordt aanbevolen om de juiste antibioticaselectie te gebruiken tijdens de bacteriële nacht- en subculturatiestappen.
Het gebruik van HT-29 epitheliale monolagen heeft veel voordelen voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen van Shigella-pathogenese in vitro. Aangezien Shigella een aan de mens aangepaste ziekteverwekker is, geven modellen van kleine dieren de karakteristieke pathogenese van shigellose die bij mensen wordt waargenomen niet nauwkeurigweer36. Het gebruik van gestandaardiseerde protocollen voor infectie van van mensen afkomstige cellijnen maakt het dus mogelijk om de afzonderlijke stappen van bacteriële pathogenese kwantitatief te ondervragen om het moleculaire samenspel tussen deze ziekteverwekker en zijn oorspronkelijke gastheer te karakteriseren. Historisch gezien werden HeLa-cellen voornamelijk gebruikt om gastheer-pathogeen interacties in vitro te bestuderen 25,56,57. HeLa-cellen zijn echter een onsterfelijke baarmoederhalskankercellijn, die niet-inheemse gastheercellen zijn voor darmbacteriële pathogenen. Zo zijn in vitro studies van enterische pathogenese verschoven naar het gebruik van adenocarcinoomcellijnen in de dikke darm (bijv. HT-29, Caco-2 en T84), die de morfologie van het darmepitheel getrouwer recapituleren en op transwells kunnen worden gekweekt als epitheliale monolagen met gedifferentieerde apicale en basolaterale oppervlakken 58,59,60. Hoewel elke cellijn zijn individuele sterke en zwakke punten heeft, worden HT-29-cellen gebruikt in de hier beschreven tests vanwege fenotypische overeenkomsten met intestinale enterocyten en robuuste expressie van celoppervlakreceptoren en pro-inflammatoire cytokines 58,59,61. Elk van deze besproken modellen zijn echter van kanker afgeleide cellijnen met afwijkende metabole en groeifenotypes die de natuurlijke fysiologische toestand van het colonepitheel in vivo niet nauwkeurig weergeven 58. Recente ontwikkelingen in menselijke weefselkweektechnieken hebben het mogelijk gemaakt om menselijke darmstamcellen, verkregen uit weefselbiopten, te kweken tot organoïden of enkele tweedimensionale celmonolagen die de verschillende celtypen in het menselijke maagdarmkanaal (GI) samenvatten 62,63,64. Intestinale organoïden kunnen worden gedifferentieerd met enterocyten, slijmproducerende bekercellen, M-cellen en andere weefselspecifieke celtypen. Recente studies hebben het gebruik van deze organoïdemodellen gevalideerd voor het bestuderen van darmpathogenen, waaronder verschillende Shigella spp., Salmonella enterica en Escherichia coli pathovars 62,63,64. Hoewel organoïden nauwkeurigere modellen zijn van het menselijke GI-epitheel en zelfs kunnen worden gekweekt in verschillende voedingsomstandigheden om de wereldbevolking te vertegenwoordigen65, vereist hun relatieve complexiteit aanzienlijke training en technische expertise, wat resulteert in hogere kosten en langere kweektijden in vergelijking met traditionele kankercellijnen58.
Dit protocol beschrijft medium-throughput-methoden, waarbij twee platen met 6 putjes worden gebruikt voor een totaal van 12 monolagen die beschikbaar zijn om te testen. Experimenten kunnen echter gemakkelijk worden opgeschaald om het aantal gezaaide monolagen te vergroten om extra technische replicaten mogelijk te maken, of om extra Shigella-mutanten en omgevingssignalen te testen. Weefselkweekplaten met meer putjes (bijv. platen met 12 of 24 putjes) kunnen ook worden gebruikt met de juiste aanpassingen om rekening te houden met putjes met kleinere diameters. Onder de in stap 3.2 beschreven HT-29-groeiomstandigheden zijn HT-29-titers voldoende voor het zaaien van ongeveer zes platen met 6 putjes na de kweek uit één T75-kolf, met voldoende resterende cellen om de HT-29-celkweek in stand te houden. Verder zijn het zaaien van HT-29-monolagen en de voorbereiding van inoculerende bacteriestappen identiek tussen bacteriële adherentie-, invasie- en intracellulaire replicatietests. Zo kunnen tests die dezelfde Shigella-stammen of subculturing-omstandigheden testen, gemakkelijk parallel worden uitgevoerd om tegelijkertijd de rol van elke experimentele aandoening in verschillende stappen van Shigella-infectie te onderzoeken.
Hersteltiters voor adherente (stap 4), binnengedrongen (stap 5) en intracellulaire bacteriën (stap 6) worden bepaald door seriële verdunningen van geïnfecteerde HT-29-cellen na lysis uit te plateren, wat een kwantitatieve beoordeling van de efficiëntie van elk stadium van Shigella-infectie mogelijk maakt. De centrifugatiestappen in de invasie- en intracellulaire replicatietests, gebaseerd op klassieke tests 49,50,51, bevorderen bacterieel contact met de gastheercellen voor onmiddellijke invasie en verhogen de invasiesnelheden. Centrifugeren "slaat" dus de therapietrouwstap over, waarvan later werd ontdekt dat het een belangrijk aspect was van Shigella-infectie 17,18,19,66. Het is essentieel op te merken dat de centrifugestap niet kan worden uitgevoerd met gepolariseerde epitheelcellen die op transwells zijn gezaaid. Voor de adherence-test wordt de adhesie echter niet afgedwongen door centrifugatie en wordt er geen gentamicine toegevoegd aan de geïnfecteerde HT-29-cellen voorafgaand aan lysis, waardoor de telling van aanhangende bacteriële cellen mogelijk is. Het volume weefselkweekmedia wordt teruggebracht tot 1 ml (in tegenstelling tot 2 ml voor de invasie- en intracellulaire replicatietests) om een efficiënter contact van de bacteriën met de HT-29-cellen mogelijk te maken. Bovendien kan, afhankelijk van de mate van therapietrouw, enige invasie en intracellulaire replicatie optreden tijdens de incubatie van 3 uur, maar de hoeveelheid is doorgaans te verwaarlozen (bijv. slechts 0,05% van de herstelde bacteriepopulatie na lyse van de gastheercel). Desalniettemin, om goed rekening te houden met adhesieve versus intracellulaire bacteriën tijdens de incubatie van 3 uur, wordt aanbevolen om parallelle tests uit te voeren, waarbij, naast het vermelde protocol, een tweede plaat wordt geïncubeerd met 50 μg/ml gentamicine in 2 ml DMEM per putje gedurende 45 minuten in totaal (15 min incubatie, wassen, verse DMEM + gentamycine gedurende 30 minuten) om extracellulaire bacteriën grondig te lyseren. Na HT-29-cellyse zoals vermeld in het protocol, kunnen de intracellulaire bacteriën worden opgesomd zoals hierboven vermeld, en vertegenwoordigen ze het aantal bacteriën dat is binnengedrongen. Deze waarde kan vervolgens worden afgetrokken van de bacteriën die van de plaat zijn opgesomd zonder behandeling met gentamicine om de aanhangende en binnengedrongen bacteriën op de juiste manier te bepalen. Parallelle analyses kunnen ook worden uitgevoerd om meer inzicht te krijgen in de intracellulaire replicatie van Shigella in HT-29-cellen na invasie, bijvoorbeeld door meerdere tijdstippen te gebruiken om intracellulaire groeicurven uit te voeren. Ten slotte kunnen, samen met het opsommen van intracellulaire bacteriën na een 18 uur gentamicine-incubatie, de kweeksupernatanten worden verzameld en geanalyseerd op cytokinesecretie van geïnfecteerde HT-29-cellen. IL-8 is bijvoorbeeld een chemokine die wordt uitgescheiden door epitheelcellen en die grotendeels functioneert om PMN's te rekruteren naar de plaats van infectie. De hoeveelheid IL-8 die wordt uitgescheiden in de kweekmedia van geïnfecteerde HT-29-cellen kan worden geanalyseerd met een IL-8 ELISA-test67.
Galzouten hebben bewezen een belangrijk virulentiesignaal te zijn voor Shigella tijdens de doorvoer door het menselijke maagdarmstelsel, en kunnen worden gebruikt om bacteriële groeimedia in deze protocollen aan te vullen om typische gastro-intestinale omstandigheden na te bootsen. Van nature worden galzouten in de twaalfvingerige darm of het bovenste deel van de dunne darm geïntroduceerd om de spijsvertering te bevorderen; En in het terminale ileum of het einde van de dunne darm wordt 95% van de galzouten verwijderd en weer in de circulatie gerecycled voor de uiteindelijke afzetting in de galblaas68. Galzouten hebben meestal een concentratie tussen 0,2%-2,0% (w/v) in de dunne darm en zijn van nature bacteriedodend. Shigella is echter, samen met de meeste darmbacteriën, bestand tegen galzouten en gebruikt de signalen om de infectie te versterken47. Verschillende onderzoeken hebben gedocumenteerd hoe blootstelling aan galzouten, soms in combinatie met andere signalen van de dunne darm zoals glucose, de overleving van Shigella en de virulentieregulatie voorafgaand aan infectie beïnvloedt. Van Shigella is aangetoond dat het bestand is tegen galzouten, de genexpressie verandert en een biofilm vormt en verspreidt in omstandigheden die de transit van de dunne darm reproduceren17,69. De studies hebben aangetoond dat deze veranderingen resulteren in een hypervirulent fenotype, waarbij therapietrouw en invasie worden geïnduceerd bij een daaropvolgende coloninfectie door Shigella 17,18,19,48,66. De hierboven geschetste voorwaarden documenteren dus hoe Shigella in galzouten kan worden gesubcultureerd om de transit van de dunne darm na te bootsen voorafgaand aan het uitvoeren van de therapietrouw-, invasie- of intracellulaire replicatietests. De gespecificeerde TSB-formulering bevat toegevoegde glucose ten opzichte van typische Luria-bouillon (LB)17. Als LB wordt gebruikt, is het dus belangrijk om ook de media aan te vullen met glucose (0,5%-2,0% [w/v]) om de glucosesignalen in de dunne darm op de juiste manier te beschouwen17. Bovendien worden, zoals hierboven vermeld, alle Shigella-subculturen gewassen om galzouten te verwijderen en de overgang naar de dikke darm na te bootsen voor infectieanalyses.
Traditioneel, en zoals benadrukt in de bovenstaande resultaten (Figuur 1 en Figuur 2), zijn infectietests waardevol om de rol van een bepaald gen bij Shigella-infectie te bepalen. Het fenotype van verschillende mutanten kan echter niet echt worden gewaardeerd zonder de juiste aanvulling van de bacteriële kweekmedia. Zoals eerder onderzoek heeft aangetoond, veranderen galzouten de genexpressie van S. flexneri aanzienlijk, inclusief genen voor centraal metabolisme, transcriptiefactoren, suikertransporters, resistentie tegen geneesmiddelen en virulentiegenen die ofwel gecodeerd zijn op het chromosoom of virulentieplasmide17. Deze genen geven inzicht in hoe Shigella galzouten gebruikt als een signaal om de genexpressie te veranderen en zich voor te bereiden op een eventuele infectie van de dikke darm, en daaropvolgende mutatieanalyses moeten dus worden uitgevoerd in de juiste gesupplementeerde bacteriële groeimedia voordat de effecten op virulentie in de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatietesten worden onderzocht. Zoals hierboven te zien is in figuur 1 en figuur 2, had de ΔVF-mutatie geen invloed op therapietrouw, maar wel op invasie en intracellulaire replicatie. Omdat de mutatie de invasie en intracellulaire replicatie versterkte, zijn er momenteel experimenten aan de gang om te bepalen hoe het genproduct de infectie reguleert. De mutantenanalyses dienen als een voorbeeld van hoe nieuwe inzichten in de pathogenese van Shigella kunnen worden bestudeerd, vooral in omstandigheden die het menselijke maagdarmkanaal beter nabootsen. Goede complementatieanalyses worden aanbevolen om de fenotypes van verschillende mutanten te valideren.
In combinatie beschrijven deze procedures kwantitatieve experimenten die belangrijk inzicht zullen verschaffen in de moleculaire mechanismen van Shigella-aanhankelijkheid, invasie van en replicatie in HT-29 colonepitheelcellen door de natuurlijke omgeving van het menselijke maagdarmkanaal tijdens infectie zo goed mogelijk na te bootsen. Toekomstige studies kunnen de mutanten en experimentele omstandigheden uitbreiden om een beter begrip te krijgen van hoe Shigella zich voorbereidt op menselijke gastheren en deze effectief infecteert. Ondanks tientallen jaren van onderzoek is er nog zoveel meer te ontdekken over Shigella-infectie.

Diarreeziekten veroorzaakt door darmbacteriële pathogenen vormen een aanzienlijke wereldwijde gezondheidslast. In 2016 waren diarreeziekten verantwoordelijk voor 1,3 miljoen sterfgevallen wereldwijd en waren ze de vierde belangrijkste doodsoorzaak bij kinderen jonger dan vijf jaar 1,2 jaar. De Gram-negatieve, enterische bacteriële ziekteverwekker Shigella is de veroorzaker van shigellose, een belangrijke oorzaak van sterfgevallen door diarreewereldwijd3. Shigellose veroorzaakt elk jaar aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij kinderen uit lage- en middeninkomenslanden 4,5, terwijl infecties in landen met een hoog inkomen verband houden met uitbraken van kinderdagverblijven, door voedsel overgedragen en door water overgedragen uitbraken 6,7,8,9. Ineffectieve vaccinontwikkeling10 en stijgende percentages antimicrobiële resistentie (AMR)11,12 hebben het beheer van grootschalige Shigella-uitbraken bemoeilijkt. Uit recente gegevens van de Centers for Disease Control and Prevention blijkt dat bijna 46% van de Shigella-infecties in de Verenigde Staten in 2020 resistentie tegen geneesmiddelen vertoonde13,14, terwijl de Wereldgezondheidsorganisatie Shigella heeft uitgeroepen tot een prioritaire AMR-ziekteverwekker waarvoor dringend nieuwe therapieën nodig zijn15.
Shigella-infecties worden gemakkelijk overgedragen via de fecaal-orale route bij inname van besmet voedsel of water, of door direct menselijk contact. Shigella is geëvolueerd tot een efficiënte, aan de mens aangepaste ziekteverwekker, met een infectieuze dosis van 10-100 bacteriën die voldoende zijn om ziekte te veroorzaken16. Tijdens de overgang van de dunne darm wordt Shigella blootgesteld aan omgevingssignalen, zoals verhoogde temperatuur en gal17. Detectie van deze signalen induceert transcriptionele veranderingen om virulentiefactoren tot expressie te brengen die het vermogen van de bacteriën om de menselijke dikke darm te infecteren verbeteren 17,18,19. Shigella dringt het epitheel van de dikke darm niet binnen vanaf het apicale oppervlak, maar passeert eerder door de epitheellaag na opname in gespecialiseerde antigeenpresenterende microvouwcellen (M-cellen) in het follikel-geassocieerde epitheel 20,21,22. Na transcytose worden Shigella-cellen gefagocyteerd door residente macrofagen. Shigella ontsnapt snel aan het fagosoom en veroorzaakt de celdood van macrofagen, wat resulteert in het vrijkomen van pro-inflammatoire cytokines 5,23,24. Shigella dringt vervolgens de epitheelcellen van de dikke darm binnen vanaf de basolaterale zijde, lyseert de macropinocytaire vacuole en vestigt een replicatieve niche in het cytoplasma 5,25. Pro-inflammatoire cytokines, met name interleukine-8 (IL-8), rekruteren polymorfonucleaire neutrofiele leukocyten (PMN's) naar de plaats van infectie, wat de epitheliale tight junctions verzwakt en bacteriële infiltratie van de epitheelbekleding mogelijk maakt om de basolateraleinfectie te verergeren. De PMN's vernietigen het geïnfecteerde epitheelslijmvlies om de infectie in te dammen, wat resulteert in de karakteristieke symptomen van bacillaire (bloederige)dysenterie. Hoewel invasie- en intracellulaire replicatiemechanismen grondig zijn gekarakteriseerd, toont nieuw onderzoek belangrijke nieuwe concepten aan bij Shigella-infectie, waaronder virulentieregulatie tijdens gastro-intestinale (GI) transit17, therapietrouw19, verbeterde basolaterale toegang door barrièrepermeabiliteit26 en asymptomatisch dragerschap bij ondervoede kinderen27.
Het vermogen van Shigella spp. om diarree te veroorzaken is beperkt tot mensen en niet-menselijke primaten (NHP)28. Shigella darminfectiemodellen zijn ontwikkeld voor zebravissen29, muizen30, cavia's31, konijnen 21,32,33 en varkens34,35. Geen van deze modelsystemen kan echter nauwkeurig de ziektekenmerken repliceren die worden waargenomen tijdens menselijke infectie36. Hoewel NHP-modellen van shigellose zijn opgesteld om de pathogenese van Shigella te bestuderen, zijn deze modelsystemen duur om te implementeren en vereisen ze kunstmatig hoge infectieuze doses, tot negen ordes van grootte hoger dan de infectieuze dosis van mensen 37,38,39,40,41,42. De opmerkelijke aanpassing van Shigella voor infectie van menselijke gastheren vereist dus het gebruik van van mensen afgeleide celculturen om fysiologisch relevante modellen na te bootsen voor nauwkeurige ondervraging van de pathogenese van Shigella.
Hier worden gedetailleerde procedures beschreven om de mate van Shigella-therapietrouw , invasie van en replicatie in HT-29 colonepitheelcellen te meten. Met behulp van deze gestandaardiseerde protocollen kunnen de moleculaire mechanismen waarmee bacteriële virulentiegenen en omgevingssignalen elke stap van Shigella-infectie beïnvloeden, worden ondervraagd om de dynamische interactierelatie tussen gastheer en ziekteverwekker beter te begrijpen.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu;m PES filter</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SCGP00525</td><td>Steriele, polyethersulfone filter voor het steriliseren van maximaal 50 mL media</td></tr><tr><td>14 mL kweekbuizen</td><td>Corning</td><td>352059</td><td>17 mm x 100 mm polypropyleen testbuizen met dop</td></tr><tr><td>50 mL conische buizen</td><td>Corning</td><td>430829</td><td>50 mL heldere polypropyleen conische bodem centrifugeerbuizen met lekvrije dop</td></tr><tr><td>6-well weefselkweek platen</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>Platen zijn behandeld voor optimale celbevestiging</td></tr><tr><td>Gallezouten</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8756</td><td>1:1 verhouding van cholaat naar deoxycholaat</td></tr><tr><td>Congo rood kleurstof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6277</td><td>Een op benzideen gebaseerde anionische diazoonkleurstof, >85% zuiverheid</td></tr><tr><td>Countess celtelling kamer slide</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>Te gebruiken met de Countess Automated Cell Counter</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Een zeer polair organisch reagens</td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>DMEM is aangevuld met hoge glucose, natriumpyruvaat, GlutaMAX en Fenol Rood</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>Hitte-geïnactiveerd, sterieel</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3632</td><td>Stamkooncentratie is 50 mg/mL</td></tr><tr><td>HT-29 cellijn</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td>Adenocarcinoom cellijn; van colorectale oorsprong</td></tr><tr><td>Paraffine film</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td>Laboratorium afdichtingsfilm</td></tr><tr><td>Petri schotels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>100 mm x 15 mm Petri schotels voor vaste media</td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>1x concentratie; pH 7.4</td></tr><tr><td>Select agar</td><td>Invitrogen</td><td>30391023</td><td>Een mengsel van polysacchariden geëxtraheerd uit rode zeewiercelwanden om bacteriële plateringsmedia te maken</td></tr><tr><td>T75 flessen</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td>Weefselkweek flessen</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Een veel voorkomende niet-ionische oppervlakteactieve stof en emulgator&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan blauw kleurstof</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>Een kleurstof om dode weefselkweekcellen te detecteren; alleen levende cellen kunnen de kleurstof uitsluiten</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Reagens voor celdissociatie voor het onderhoud en passeren van cellijnen</td></tr><tr><td>Tryptische Soja Bouillon (TSB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8907</td><td>Bacterieel groeimedium</td></tr></tbody></table>

epitheelcelinfectieanalyses met shigella

Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella

De aan de mens aangepaste darmbacteriële ziekteverwekker Shigella veroorzaakt miljoenen infecties per jaar, creëert langdurige groei-effecten bij pediatrische patiënten en is wereldwijd een belangrijke oorzaak van sterfgevallen door diarree. Infectie veroorzaakt waterige of bloederige diarree als gevolg van de ziekteverwekker die het maagdarmkanaal passeert en de epitheelcellen langs de dikke darm infecteert. Met een duizelingwekkende toename van antibioticaresistentie en het huidige gebrek aan goedgekeurde vaccins, zijn gestandaardiseerde onderzoeksprotocollen van cruciaal belang voor het bestuderen van deze formidabele ziekteverwekker. Hier worden methodologieën gepresenteerd om de moleculaire pathogenese van Shigella te onderzoeken met behulp van in vitro analyses van bacteriële adherentie, invasie en intracellulaire replicatie in epitheelcellen van de dikke darm. Voorafgaand aan infectieanalyses werd het virulentiefenotype van Shigella-kolonies geverifieerd door de opname van de Congorode kleurstof op agarplaten. Aangevuld laboratoriummedium kan ook worden overwogen tijdens het kweken van bacteriën om in vivo omstandigheden na te bootsen. Bacteriële cellen worden vervolgens gebruikt in een gestandaardiseerd protocol om darmepitheelcellen in weefselkweekplaten te infecteren bij een vastgestelde multipliciteit van infectie met aanpassingen om elk stadium van infectie te analyseren. Voor hechtingstesten worden Shigella-cellen geïncubeerd met verlaagde medianiveaus om bacterieel contact met epitheelcellen te bevorderen. Voor zowel invasie- als intracellulaire replicatietests wordt gentamicine gedurende verschillende tijdsintervallen toegepast om extracellulaire bacteriën te elimineren en de beoordeling van invasie en/of de kwantificering van intracellulaire replicatiesnelheden mogelijk te maken. Alle infectieprotocollen sommen aanhangende, binnengedrongen en/of intracellulaire bacteriën op door geïnfecteerde epitheelcellysaten serieel te verdunnen en bacteriële kolonievormende eenheden te plateren ten opzichte van infecterende titers op Congo-rode agarplaten. Samen maken deze protocollen onafhankelijke karakterisering en vergelijkingen mogelijk voor elk stadium van Shigella-infectie van epitheelcellen om deze ziekteverwekker met succes te bestuderen.

Therapietrouw-, invasie- en intracellulaire replicatietests werden uitgevoerd waarbij S. flexneri 2457T wildtype (WT) werd vergeleken met S. flexneri ΔVF (ΔVF), een mutant waarvan wordt verondersteld dat deze de virulentie van Shigella negatief reguleert. Aangezien Shigella galzouten gebruikt als signaal om virulentie te reguleren 17,18,47, werden experimenten uitgevoerd na bacteriële subcultuur in TSB-media en TSB aangevuld met 0,4% (w/v) galzouten 18. Blootstelling aan galzouten tijdens de subcultuurstap fungeert als een voorbehandeling om de transit van de dunne darm voorafgaand aan een darminfectie na te bootsen 17,18,47. Figuur 1 analyseert het effect van de ΔVF-mutatie op het vermogen van S. flexneri om zich te hechten aan HT-29 colonepitheelcellen. Het percentage therapietrouw wordt uitgezet op de y-as en vertegenwoordigt de verhouding van herstelde bacteriën na HT-29-lysis, gestandaardiseerd op het aantal inputbacteriën. Zoals verwacht hadden zowel S. flexneri WT- als ΔVF-stammen een significante toename van de therapietrouw bij subcultuur met galzoutsuppletie in vergelijking met TSB zonder suppletie met galzouten18. Er was echter geen verschil in therapietrouw aan HT-29-cellen tussen WT- en ΔVF-mutante stammen binnen elke subcultuuraandoening. Deze gegevens geven aan dat de ΔVF-mutatie geen effect heeft op het vermogen van S. flexneri om zich te hechten aan HT-29-epitheelcellen met of zonder de galzouten voorbehandeling.
In figuur 2 werd het effect van de ΔVF-mutatie op het vermogen van S. flexneri om binnen te dringen (Figuur 2A) en te repliceren (Figuur 2B) in HT-29 colonepitheelcellen met of zonder voorbehandeling van galzouten geanalyseerd. Het percentage herstel wordt uitgezet op de y-as en vertegenwoordigt de verhouding van herstelde bacteriële cellen na HT-29-cellyse, gestandaardiseerd op het aantal invoerbacteriën. In figuur 2A was er een verwachte significante toename van het vermogen van WT S. flexneri 2457T om HT-29-cellen binnen te dringen na pre-blootstelling aan galzouten48, terwijl de S. flexneri ΔVF-mutant een kleinere toename van invasie vertoonde na pre-blootstelling aan galzouten in vergelijking met de WT-stam. De ΔVF-mutant had een verhoogde invasiesnelheid van HT-29-cellen in vergelijking met de WT-subcultuur in TSB, maar had vergelijkbare invasiesnelheden als WT wanneer gesubcultiveerd in TSB aangevuld met galzouten (Figuur 2A). Deze resultaten suggereren dat de ΔVF-mutatie het vermogen van S. flexneri om HT-29-cellen binnen te dringen verbetert, wat het effect van de pre-blootstelling aan galzouten vermindert, hoewel het invasievermogen van de ΔVF-mutant verder toenam na de subcultuur van galzouten.
Over het algemeen werden 10 keer meer bacteriën teruggevonden na nachtelijke incubatie (Figuur 2B) in vergelijking met de incubatie van 90 minuten (Figuur 2A), wat de verschillen aantoont in respectievelijk het monitoren van intracellulaire groei versus invasie. Wanneer geïnfecteerde HT-29-cellen gedurende 18 uur werden geïncubeerd om intracellulaire replicatie van de bacteriën mogelijk te maken (Figuur 2B), nam de impact van de voorbehandeling van de galzouten af voor zowel de WT- als de ΔVF-stammen . Het verminderde effect van galzouten voorbehandeling tijdens intracellulaire replicatie was echter dramatischer voor de ΔVF-mutant . Aangezien de toename van de intracellulaire replicatie van beide stammen bij voorblootstelling aan galzouten kleiner was dan de toename van de invasiepercentages in dezelfde omstandigheden, veronderstellen we dat galzouten een grotere impact hebben op de vroege stappen in de pathogenese van S. flexneri . De ΔVF-mutant vertoonde een toename van het percentage herstel van nachtelijke replicatie in HT-29-cellen in vergelijking met WT (Figuur 2B) na beide subcultuuromstandigheden. Het percentage terugvorderingen van de ΔVF-mutant was echter vergelijkbaar, ongeacht de galzouten vóór blootstelling. Deze gegevenstrends suggereren dat de ΔVF-mutant efficiënter repliceert in HT-29-cellen in vergelijking met WT, en dat galzouten vóór blootstelling geen invloed hebben op het vermogen van de ΔVF-mutant om intracellulair te repliceren, zoals waargenomen voor WT (Figuur 2B). Aangezien het verschil tussen de mutante en WT-stammen in de pre-blootstellingstoestand van galzouten niet werd waargenomen tijdens de 90 minuten durende invasietest, veronderstellen we dat het product dat wordt gecodeerd door het verwijderde VF-gen ook de replicatie van S. flexneri in HT-29-cellen kan reguleren. Gecombineerd tonen beide analyses aan dat de ΔVF-mutant virulenter is ten opzichte van WT, wat suggereert dat het VF-genproduct een negatieve regulator is van S. flexneri-virulentie .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig01.jpg"> Figuur 1: Galzouten vóór blootstelling geïnduceerde hechting van S. flexneri aan HT-29-cellen. S. flexneri 2457T WT- en ΔVF-mutante cellen werden gesubcultureerd in TSB- of TSB-media, aangevuld met 0,4% (w/v) galzouten (TSB+BS) media. De bacteriën werden vervolgens toegepast op HT-29-cellen met een multipliciteit van infectie (MOI) van 100 en gedurende 3 uur geïncubeerd om de therapietrouw te onderzoeken. Na incubatie werden geïnfecteerde HT-29-cellen gewassen en gelyseerd, en seriële verdunningen van herstelde bacteriën werden geplateerd om kolonievormende eenheden per ml (CFU/ml) op te sommen. Het aantal aanhangende bacteriën wordt uitgezet ten opzichte van de titers van de invoerbacteriën om het percentage therapietrouw vast te stellen. De gegevens zijn representatief voor één biologische replicatie met drie technische replicaten (individuele stippen). Foutbalken geven de standaardfout van het gemiddelde (SEM) aan. Statistische significantie werd bepaald door de t-toets van een student (*p < 0,05; ***p < 0,001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66426/66426fig02.jpg"> Figuur 2: Galzouten vóór blootstelling verhoogden de invasie van WT S. flexneri en intracellulaire replicatie. S. flexneri 2457T WT- en ΔVF-mutante cellen werden gesubcultureerd in TSB- of TSB-media, aangevuld met galzouten (TSB+BS). De bacteriën werden vervolgens aangebracht op HT-29-cellen met een MOI van 100, gecentrifugeerd op de cellen en geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 45 minuten. Cellen werden gewassen met PBS en extracellulaire bacteriën werden gelyseerd door toevoeging van gentamicine aan de DMEM om uitsluitend intracellulaire bacteriën te herstellen. Na incubaties van 90 minuten (A, bacteriële invasie) of 18 uur (B, intracellulaire replicatie) werden geïnfecteerde HT-29-cellen gewassen en gelyseerd, en seriële verdunningen van teruggewonnen bacteriën werden geplateerd om kolonievormende eenheden per ml (CFU/ml) op te sommen. Het aantal intracellulaire bacteriën wordt uitgezet ten opzichte van de bacteriële titers om het percentage herstel vast te stellen. De gegevens zijn representatief voor één biologische replicaat, elk met drie technische replicaten (individuele stippen). Foutbalken geven SEM aan. Statistische significantie werd bepaald door de t-toets van een student (*p < 0,05). Let op de verschillen in de y-as schalen tussen panelen (A) en (B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66426/66426fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Het huidige protocol beschrijft infectietests om de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatie van Shigella te ondervragen met behulp van in vitro epitheelcellijnen.

Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella

The human-adapted enteric bacterial pathogen Shigella causes millions of infections each year, creates long-term growth effects among pediatric patients, ...

Shigella is een belangrijke wereldwijde ziekteverwekker die elk jaar verwoestende infectiepercentages veroorzaakt. Shigella infecteert het maagdarmkanaal om diarree of dysenterie te veroorzaken. Ons onderzoek heeft tot doel ons begrip van infectie te verbeteren om effectievere therapieën zoals vaccins en andere antimicrobiële producten te helpen ontwikkelen.Ten eerste stellen diermodellen en opkomende weefselkweektechnieken ons in staat om de fysiologie van Shigella-infectie beter te begrijpen en de complexiteit van het menselijke maagdarmkanaal getrouw te reproduceren. Ten tweede heeft de karakterisering van klinische Shigella-isolaten geholpen om de diversiteit van dit geslacht vast te leggen, belangrijke virulentiegenen te identificeren en ons begrip van infectie te verbeteren. We hebben gastro-intestinale signalen zoals galzouten en glucose gebruikt om te begrijpen hoe Shigella transit in de dunne darm overleeft en virulentiegenexpressie voor infectie in de dikke darm reguleert.We hebben aangetoond hoe Shigella bestand is tegen galzouten en hebben aangetoond dat Shigella hechtingseiwitten produceert om contact met epitheelcellen te initiëren om infectie te starten. Deze protocollen zijn ontworpen om te kijken naar belangrijke aspecten van epitheliale infectie, zoals therapietrouw, invasie en intracellulaire overleving van Shigella. We voeren deze protocollen uit met behulp van een standaard epitheelcellijn, maar hebben ook de methoden aangepast voor geavanceerde menselijke GI-modellen die nu beschikbaar zijn.Deze protocollen beschouwen elke fase van infectie afzonderlijk, wat van cruciaal belang is om de belangrijkste stappen bij Shigella-infectie te begrijpen. Ze benadrukken ook dat gecombineerde analyses een beter begrip van Shigella-infectie op een holistisch niveau kunnen vergemakkelijken.

epithelial-cell-infection-analyses-with-shigella

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Vonaesch, P. et. al., Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the infection of epithelial cells with the pathogenic bacterium Shigella flexneri and the resulting host cellular response. Bacterial effector proteins disrupt host translation, triggering the formation of membrane-less organelles called stress granules, which reflect the cell's adaptive response to infection.

Stress Granule Formation During Shigella Infection of Cancerous Epithelial Cells

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

This video demonstrates a technique for detecting local and global calcium ion response upon Shigella infection of human epithelial cells. Shigella invades host cells and releases invasion effectors, impacting intracellular calcium levels. The amplitude and frequency of the local and global cytosolic calcium are studied using a fluorescent indicator.

An Imaging Technique to Study the Calcium Response in Bacteria-Infected Cells

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Hier presenteren we protocollen om te visualiseren calcium (Ca2 +) Reacties ontlokte door HeLa cellen besmet door Shigella. Door het optimaliseren van de parameters van een bacteriële infectie en imaging met Ca2 + fluorescerende sondes, worden atypische globale en lokale Ca2 + signalen veroorzaakt door bacteriën over een groot bereik van de kinetiek van de infectie gekenmerkt.

Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door...

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Menselijke infectie door Entamoeba histolytica leidt tot amoebiasis, een belangrijke oorzaak van diarree in tropische landen. Infectie wordt gestart door pathogeen interactie met intestinale epitheelcellen, veroorzaken de opening van cel-cel contacten en bijgevolg diarree, soms gevolgd door leverbesmetting. Dit artikel geeft een model om de vroege gastheer-pathogeen interacties beoordelen in ons begrip van amoebiasis pathogenese verbeteren.

Analyse van de epitheelbeschadiging Geproduceerd door<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infectie

Leer infectieanalyses met Shigella om hechting, invasie en intracellulaire replicatie in epitheelcellijnen te bestuderen. Deze methode helpt onderzoekers therapeutica te ontwikkelen.

Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella

Meer video's verkennen