Name: Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Leer driedimensionale tomografie met hoge resolutie voor het detecteren van Salmonella in geïnfecteerde organen. Deze methode onthult hoe bacteriën overleven tijdens antibiotische behandeling.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het werk werd ondersteund door de Zwitserse Nationale Wetenschapsstichting 310030_156818, 310030_182315 en NCCR_ 180541 AntiResist (naar DB).

Tracering van ziekteverwekkers van het hele orgaan via kwantificering van fluorescerende reporters

<ol><li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+understanding+the+infectious+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The importance of understanding the infectious microenvironment.</a> Lancet Infect Dis. 22 (3), e88-e92 (2022).</li>
<li>Azimi, S., Lewin, G. R., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biogeography+of+infection+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biogeography of infection revisited.</a> Nat Rev Microbiol. 20 (10), 579-592 (2022).</li>
<li>Bumann, D., Cunrath, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Salmonella-host+interactions+in+infected+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Salmonella-host interactions in infected host tissues.</a> Curr Opin Microbiol. 39, 57-63 (2017).</li>
<li>Hofmann, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+-+putting+immune+cells+into+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging - putting immune cells into context.</a> J Cell Sci. 134 (15), jcs258494(2021).</li>
<li>Blain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tridimensional+atlas+of+the+developing+human+head%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A tridimensional atlas of the developing human head.</a> Cell. 186 (26), 5910-5924.e17 (2023).</li>
<li>Ragan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+two-photon+tomography+for+automated+ex+vivo+mouse+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Serial two-photon tomography for automated ex vivo mouse brain imaging.</a> Nat Meth. 9 (3), 255-258 (2012).</li>
<li>Oh, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mesoscale+connectome+of+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A mesoscale connectome of the mouse brain.</a> Nature. 508 (7495), 207-214 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-wide+maps+reveal+stereotyped+cell-type-based+cortical+architecture+and+subcortical+sexual+dimorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Brain-wide maps reveal stereotyped cell-type-based cortical architecture and subcortical sexual dimorphism.</a> Cell. 171 (2), 456-469.e422 (2017).</li>
<li>Matho, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+glutamatergic+neuron+system+in+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the glutamatergic neuron system in cerebral cortex.</a> Nature. 598 (7879), 182-187 (2021).</li>
<li>Muñoz-Castañeda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+anatomy+of+the+mouse+primary+motor+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellular anatomy of the mouse primary motor cortex.</a> Nature. 598 (7879), 159-166 (2021).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+compartmentalization+enables+Salmonella+persistence+during+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Tissue compartmentalization enables Salmonella persistence during chemotherapy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2113951118(2021).</li>
<li>Dogga, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+aspartyl+protease+5+in+the+establishment+of+the+intracellular+niche+during+acute+and+chronic+infection+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Importance of aspartyl protease 5 in the establishment of the intracellular niche during acute and chronic infection of Toxoplasma gondii.</a> Mol Microbiol. 118 (6), 601-622 (2022).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173 (1 Spec No), 33-38 (1996).</li>
<li>Nguyen, A. W., Daugherty, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+optimization+of+fluorescent+proteins+for+intracellular+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 355-360 (2005).</li>
<li>Claudi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+variation+of+Salmonella+in+host+tissues+delays+eradication+by+antimicrobial+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy.</a> Cell. 158 (4), 722-733 (2014).</li>
<li>Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hue-shifted+monomeric+variants+of+Clavularia+cyan+fluorescent+protein%3A+identification+of+the+molecular+determinants+of+color+and+applications+in+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging.</a> BMC Biol. 6, 13(2008).</li>
<li>Drobizhev, M., Makarov, N. S., Tillo, S. E., Hughes, T. E., Rebane, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+absorption+properties+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon absorption properties of fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 8 (5), 393-399 (2011).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Burton, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparate+impact+of+oxidative+host+defenses+determines+the+fate+of+Salmonella+during+systemic+infection+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host%26Microbe%22%5BJournal%5D)">Disparate impact of oxidative host defenses determines the fate of Salmonella during systemic infection in mice.</a> Cell Host&Microbe. 15 (1), 72-83 (2014).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>de Olmos, J., Hardy, H., Heimer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+afferent+connections+of+the+main+and+the+accessory+olfactory+bulb+formations+in+the+rat%3A+an+experimental+HRP-study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The afferent connections of the main and the accessory olfactory bulb formations in the rat: an experimental HRP-study.</a> J Comp Neurol. 181 (2), 213-244 (1978).</li>
<li>Smith, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CIDRE%3A+an+illumination-correction+method+for+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">CIDRE: an illumination-correction method for optical microscopy.</a> Nat Methods. 12 (5), 404-406 (2015).</li>
<li>Wendland, M., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+GFP+levels+for+analyzing+Salmonella+gene+expression+during+an+infection%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Optimization of GFP levels for analyzing Salmonella gene expression during an infection.</a> FEBS Lett. 521 (1-3), 105-108 (2002).</li>
<li>Barat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity+to+intracellular+Salmonella+depends+on+surface-associated+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Immunity to intracellular Salmonella depends on surface-associated antigens.</a> PLoS Pathog. 8 (10), e1002966(2012).</li>
<li>Rollenhagen, C., Sorensen, M., Rizos, K., Hurvitz, R., Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+selection+based+on+expression+levels+during+infection+facilitates+vaccine+development+for+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Antigen selection based on expression levels during infection facilitates vaccine development for an intracellular pathogen.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (23), 8739-8744 (2004).</li>
<li>Chen, F., Cocaign-Bousquet, M., Girbal, L., Nouaille, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27UTR+sequences+influence+protein+levels+in+Escherichia+coli+by+regulating+translation+initiation+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">5'UTR sequences influence protein levels in Escherichia coli by regulating translation initiation and mRNA stability.</a> Front Microbiol. 13, 1088941(2022).</li>
<li>Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clearer+vision+for+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A clearer vision for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 19 (4), 316-317 (2001).</li>
<li>Bumann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+Salmonella+gene+expression+in+an+infected+mammalian+host+using+the+green+fluorescent+protein+and+two-colour+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Microbiol%22%5BJournal%5D)">Examination of Salmonella gene expression in an infected mammalian host using the green fluorescent protein and two-colour flow cytometry.</a> Mol.Microbiol. 43 (5), 1269-1283 (2002).</li>
<li>Nakayama, K., Kelly, S. M., Curtiss III, R. J. B. t <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+Asd%2B+expression-cloning+vector%3A+stable+maintenance+and+high+level+expression+of+cloned+genes+in+a+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22vaccine+strain%22%5BJournal%5D)">Construction of an Asd+ expression-cloning vector: stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella.</a> vaccine strain. 6 (6), 693-697 (1988).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De lokale weefselcontext van bacteriële pathogenen is cruciaal voor het bepalen van lokale gastheeraanvallen, bacteriële aanpassingen, de lokale uitkomst van de interacties tussen gastheerpathogenen en antimicrobiële chemotherapie, en de individuele bijdragen aan de algehele uitkomst van de ziekte. Het afbeelden van bacteriën ter grootte van een micrometer in organen ter grootte van een centimeter was een uitdaging. Seriële twee-foton (STP) tomografie biedt voldoende ruimtelijke resolutie om individuele bacteriële cellen in hele organen te detecteren, geautomatiseerde secties en beeldvorming, en voldoende doorvoer (~1 orgaan per dag)11. Hoewel gastheerantigenen in vivo kunnen worden gekleurd, moeten pathogene cellen geschikte fluorescerende eiwitten tot expressie brengen om uitgebreide detectie van intracellulaire pathogene cellen te garanderen. De resulterende datasets (0,5-1,5 TeraByte per orgaan) vormen een grote uitdaging voor IT-infrastructuren voor data-analyse en -opslag.
Er zijn verschillende kritieke stappen in deze methode. Ten eerste is een pathogene stam met detecteerbare en homogene expressie van fluorescerend eiwit GFP of YFP vereist. Idealiter wordt een chromosomale expressiecassette25 gebruikt om de heterogeniteit van fluorescentie als gevolg van variatie in het plasmide-kopiegetal te minimaliseren. Voldoende fluorescentie-intensiteit is vereist, maar overmatige niveaus van fluorescerend eiwit moeten worden vermeden om fitnessstoornissen van de ziekteverwekker tevoorkomen23. Geschikte expressieniveaus kunnen worden verkregen door selectie van een geschikte promotor en fijnafstemming van de ribosomale bindingsplaats25 of het gehele 5' niet-getransleerde gebied (UTR)26. Ten tweede moet de perfusiefixatie een eerste wasbeurt met buffer omvatten om zoveel mogelijk erytrocyten uit de bloedcirculatie te verwijderen. Dit is met name van cruciaal belang voor milt en lever (hoewel volledige verwijdering van erytrocyten uit deze organen moeilijk is). Resterende erytrocyten absorberen licht in het zichtbare deel van het spectrum, waardoor de beeldkwaliteit in gevaar komt27. Ten derde is de opslag van de vaste weefsels in de cryoprotectivum van cruciaal belang om de autofluorescentie van het weefsel te verminderen, die bijzonder hoog is in ontstoken weefsels en de relatief zwakke fluorescentie van de pathogene cellen kan overschaduwen. Ten vierde is de effectieve verknoping van het weefsel met het omringende agaroseblok van cruciaal belang voor een soepele vibratoomsnede zonder dat het weefsel uit het agaroseblok springt. Ten vijfde moeten fluorescerende signalen en hun identificatie als pathogene cellen onafhankelijk worden geverifieerd met behulp van orthogonale benaderingen zoals kleuring met antilichamen tegen pathogene componenten (zoals lipopolysaccharide voor Gram-negatieve bacteriën) en confocale microscopie van de secties die uit de tomograaf11 zijn gehaald. Sommige geïnfecteerde weefsels bevatten autofluorescerende deeltjes met een vergelijkbare vorm en overlappende fluorescentiespectra die gemakkelijk verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd als pathogene cellen. Ten zesde moet de hoeveelheid pathogene cellen in microkolonies worden vergeleken met orthogonale benaderingen zoals confocale microscopie om de nauwkeurigheid te beoordelen. De totale bacteriële belasting op basis van deze berekeningen moet worden geverifieerd in vergelijking met orthogonale benaderingen zoals flowcytometrie en plating.
Belangrijke aanpassingen van het veelgebruikte STP-protocol zijn onder meer het plaatsen van een smalbanddoorlaatfilter 510/20 nm voor fotomultiplier 211, om interferentie van groen-gele autofluorescentie te verminderen die bijzonder sterk is in geïnfecteerde en ontstoken lever-, milt- en Peyer-pleisters. De sterke autofluorescentie en verhoogde lichtverstrooiing van dergelijke organen in vergelijking met de hersenen (die andere toepassingen van STP domineren) genereert ook een behoefte aan effectievere correctie voor ongelijkmatige verlichting. Als andere wijziging maakt dit protocol voor dit doel gebruik van de CITERRE-benadering22 (figuur 3) en op AI gebaseerde segmentatie van bacteriën. Ten slotte werd de voorbewerking van het weefsel gewijzigd door een incubatiestap in cryoprotectant bij -20 °C op te nemen, wat de autofluorescentie van het weefsel vermindert en zo de detectie van kleine pathogene cellen met een relatief zwakke fluorescentie vergemakkelijkt11.
Probleemoplossing kan nodig zijn als er geen pathogene signalen kunnen worden gedetecteerd, of segmentatie onvoldoende gevoeligheid oplevert (er worden te veel pathogene cellen gemist) of onvoldoende precisie (te veel achtergronddeeltjes worden gesegmenteerd als pathogene cellen). Als autofluorescentie van het achtergrondweefsel detecteerbaar is, maar er te weinig pathogene signalen zijn, kunnen de pathogenen onvoldoende hoeveelheden fluorescerende eiwitten bevatten. Dit kan worden getest met behulp van confocale microscopie van weefselsecties van hetzelfde geïnfecteerde weefsel of flowcytometrie van weefselhomogenaten19,28. Onderliggende redenen kunnen zijn: onvoldoende expressieniveaus of instabiliteit van de expressiecassette. Mitigatiestrategieën kunnen alternatieve promotoren omvatten om expressie te stimuleren, codon-aanpassing van de genen die coderen voor het fluorescerende eiwit voor de pathogene soorten, gebruik van episomale constructen met een hoger aantal kopieën, of stabilisatie van expressiecassettes door chromosomale integratie of gebalanceerde-letale complementatie29. De keuze van het fluorescerende eiwit is ook belangrijk, maar detectie is mogelijk met GFP.mut2, mWasabi, YPet en TIMERbac. Als segmentatie onnauwkeurig is, kan dit worden veroorzaakt door een te zwakke pathogene fluorescentie die kan worden aangepakt zoals hierboven beschreven, of door een te hoge autofluorescentieachtergrond in het weefsel. Uitgebreide perfusie van de wasoplossing of langdurige incubatie in de opslagbuffer onmiddellijk voor inbedding in het agaroseblok en tomografie kunnen deze problemen oplossen. Ten slotte is voldoende training van het neurale netwerk vereist voor nauwkeurige classificatie, maar overmatige training kan leiden tot overfitting die de prestaties van nieuwe monsters schaadt.
Momenteel is er geen andere methode die hele organen met voldoende ruimtelijke resolutie in 3D kan afbeelden voor het detecteren van individuele bacteriën. Toekomstige verbeteringen in weefselopruiming en light-sheet-microscopie zouden een vergelijkbare resolutie kunnen bereiken. Dit kan beeldvorming met hogere snelheid en met meer fluorescerende kanalen mogelijk maken.
Een belangrijke beperking van STP is de pixelresolutie in het vlak van ~0,5 μm en de verticale resolutie van 5 tot 10 μm, wat onvoldoende is voor het oplossen van dicht bij elkaar gelegen bacteriën, bijvoorbeeld in een dicht opeengepakte microkolonie. Het is echter mogelijk om weefselsecties na tomografie te verwijderen voor secundaire confocale microscopie met hoge resolutie van geselecteerde weefseldelen. Een andere beperking van STP is de beschikbaarheid van slechts drie fluorescentiekanalen, waardoor het aantal fluoroforen dat tegelijkertijd kan worden afgebeeld, wordt beperkt. Nogmaals, secundaire analyse van opgehaalde weefselsecties met multiplexing-methoden kan de locatie en intensiteit van veel meer markers voor geselecteerde weefseldelen onthullen. Deze informatie kan worden geïntegreerd in de algehele 3D-structuur van het omliggende weefsel zoals bepaald met STP.
Concluderend maakt dit protocol gedetailleerd onderzoek mogelijk naar interacties tussen gastheer en ziekteverwekker op lokaal en orgaanniveau. Het protocol moet gemakkelijk kunnen worden aangepast aan andere ziekteverwekkers (op voorwaarde dat ze kunnen worden verkregen als fluorescerende stammen), andere organen en verschillende gastheersoorten.

Infecties komen voor in weefsels met een complexe anatomie en gecompartimenteerde fysiologie. De diverse micro-omgevingen die naast elkaar bestaan in het geïnfecteerde weefsel, kunnen het lot van lokale pathogene subgroepen en hun bijdragen aan de algehele ziekte-uitkomst bepalen. Het uitgebreid in 3D in kaart brengen van microbiële pathogenen in weefsels ter grootte van een cm blijft echter een uitdaging4. Beeldvorming van de hersenen en andere organen is een zeer actief onderzoeksgebied met voortdurend verbeterende experimentele strategieën5, maar veel methoden missen nog steeds de resolutie van minder dan μm die nodig zou zijn om bacteriële pathogenen ter grootte van μm met vertrouwen te identificeren. Seriële twee-foton (STP) tomografie6 daarentegen maakt geautomatiseerde meerkleurige, vervormingsvrije beeldvorming van hele weefsels mogelijk met een resolutie van minder dan μm in het vlak, wat volledige volumetrische datasets oplevert. Deze methode combineert herhaalde fysieke doorsnede van het weefsel met behulp van een vibratoom met intermitterende beeldvorming van twee fotonen van de opkomende blokvlakken met infrarood licht. STP-tomografie is veel gebruikt voor het in kaart brengen van dunne axonen in de hersenen om connectiviteitskaarten 7,8,9,10 vast te stellen.
STP-tomografie maakt het ook mogelijk om individuele microbiële pathogene cellen (Salmonella, Toxoplasma) in de gehele geïnfecteerde weefsels in kaart te brengen11,12 met behulp van een tomograaf. De tweede harmonische generatie onthult collageenomhulsels rond slagaders en in vezelachtige banden zoals de trabeculae van de milt, en biedt zo anatomische context. In vivo geïnjecteerde fluorescerende antilichamen kunnen worden gebruikt om gastheercellen te kleuren om interacties tussen individuele pathogene cellen en infiltrerende immuuncellen zoals neutrofielen te onthullen. Hier wordt de pijplijn beschreven met verwerking van het weefsel, beeldvorming, het naaien van beeldvormingstegels met verlichtingscorrectie, het stapelen van afbeeldingen in drie dimensies en segmentatie met behulp van machine learning-tools. Deze pijplijn levert 3D-posities op van individuele pathogenen, cellen en microkolonies binnen hun gastheercontext. Het tellen van het aantal individuele cellen binnen microkolonies blijft moeilijk vanwege resolutielimieten, maar dergelijke aantallen kunnen worden geschat op basis van de geïntegreerde helderheid van de microkolonie. De pijplijn kan gemakkelijk worden aangepast aan andere infectiemodellen als er recombinante GFP- of YFP-expressieve pathogenen beschikbaar zijn.

<table><tbody><tr><td>Chemische stoffen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose Low Melt</td><td>Roth</td><td>Art. 6351.5 25g</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Instantlijm Loctite 435</td><td>Henkel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ethyleenglycol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5413-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP-100G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumborohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71321-25g</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide</td><td>Merck</td><td>106453</td><td></td></tr><tr><td>Natriummetaperiodaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311448-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640-250G</td><td></td></tr><tr><td>Natriumfosfaat monobasisch dihydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71500-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumtetraboraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221732-100g</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>AppliChem</td><td>A4734,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)</td><td>Merck</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Vacuumfiltratie 500</td><td>TPP</td><td>TPP99250</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mes</td><td>Campden Instruments Limited&nbsp;</td><td>01-01-4692</td><td></td></tr><tr><td>MAITAI Laser</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic mal om af te pellen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>TissueCyte 1000 tomograaf</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antilichamen/kleurstof</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Merck</td><td>D9542-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Primaire antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-LPS Salmonella, konijn</td><td>Sifin</td><td>REF TS 1624</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD169-PE, clone 3D6.112</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>142403</td><td></td></tr><tr><td>anti-Ly-6G-PE, clone 1A8</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>127608</td><td></td></tr><tr><td>Secundaire antilichamen</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chicken anti-rabbit Alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>A-21443</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>Bedrijf</td><td>Versie</td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>Image J</td><td>1.54g of nieuwer</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>2017b/2018b of nieuwer</td><td></td></tr><tr><td>Orchestrator (tomograaf)</td><td>TissueVision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visualisatiesoftware Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td>9.9.0 of nieuwer</td><td></td></tr></tbody></table>

driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

De meeste infecties vinden plaats in driedimensionale gastheerweefsels met een ingewikkelde anatomie en lokaal variërende gastheerfysiologie. De positionering van pathogene cellen in deze diverse omgeving heeft een aanzienlijke invloed op hun stressniveaus, reacties, lot en bijdrage aan de algehele progressie van de ziekte en het falen van de behandeling. Vanwege de technische problemen bij het lokaliseren van pathogene cellen ter grootte van μm in gastheerorganen ter grootte van een cm, is dit onderzoeksgebied echter relatief onontgonnen. Hier presenteren we een methode om deze uitdaging aan te gaan. We maken gebruik van seriële twee-fotontomografie en AI-verbeterde beeldanalyse om individuele Salmonella-cellen te lokaliseren in de hele milt, leverkwabben en hele lymfeklieren van geïnfecteerde muizen. Met behulp van fluorescerende reporters en in vivo toediening van antilichamen kan de replicatiesnelheid van afzonderlijke Salmonella-cellen , hun lokale interactie met specifieke immuuncellen en bacteriële reacties op antibiotica worden bepaald. Deze methodologieën openen wegen voor een uitgebreid onderzoek naar infecties, hun preventie en behandeling binnen de driedimensionale weefselcontext.

De beschreven procedure maakt detectie mogelijk van individuele Salmonella-cellen in volledige muizenorganen zoals milt, lever, mesenteriale lymfeklieren en Peyer's patches11 (Figuur 5 en Figuur 6). Het detecteert ook Toxoplasma gondii-parasieten in de hersenen van muizen12. Sommige geïnfecteerde weefsels, waaronder de lever, Peyer's pleisters en milt, zenden substantiële autofluorescentie uit in het groen-gele bereik. Autofluorescentie wordt verder versterkt door de fixatie met paraformaldehyde, die nodig is om de weefselstructuur te behouden. De detectie van groene fluorescentie van GFP, mWasabi en de groene component van TIMERbac tegen deze autofluorescentieachtergrond wordt verbeterd door een smalbanddoorlaatfilter 510/20 nm (dat de meeste GFP-emissies doorgeeft maar een groot deel van het autofluorescentiespectrum blokkeert) voor fotomultiplicator 2 (die groene emissies verzamelt) te plaatsen en door weefselautofluorescentie te verminderen door vaste weefsels gedurende 3 of meer dagen op te slaan in cryoprotectant11. Bacteriën moeten echter nog steeds ten minste een paar duizend kopieën per cel van GFP of andere fluorescerende eiwitten tot expressie brengen. Aan de andere kant moeten overmatige fluorescerende eiwitniveaus worden vermeden om de fitnesskosten te minimaliseren die kunnen leiden tot verzwakte virulentie.
Correcte segmentatie van fluorescerende bacteriën in de weefsels kan worden bevestigd door immunohistochemie van opgehaalde weefselsecties na beeldvorming. In het bijzonder kunnen objecten die zijn gekleurd met een antilichaam tegen bacteriële oppervlaktecomponenten zoals lipopolysaccharide worden uitgelijnd met het fluorescentiebeeld dat is verkregen door STP-tomografie (Figuur 5). Het is belangrijk op te merken dat sommige gekleurde Salmonella-cellen geen fluorescerende eiwitten hebben en dus detecteerbare fluorescentie in zowel confocale microscopie als STP-tomografie. Deze cellen zijn Salmonella die zijn gedood door het immuunsysteem van de gastheer, zoals aangetoond door flowcytometrische sortering en groeiculturen van enkelvoudig gesorteerde cellen, evenals de nauwe correlatie tussen het aantal kolonievormende eenheden op agarplaten en het aantal fluorescerende Salmonella-cellen zoals bepaald door flowcytometrie24. Bovendien kan plasmideverlies resulteren in niet-fluorescerende levensvatbare cellen en dit moet worden getest door plating op media met en zonder geschikte antibiotica die overeenkomen met de selectiemarker op het plasmide. Voor pSC101-afgeleide plasmiden is plasmideverlies in vivo zeldzaam19. Voor de meeste chromosomaal geïntegreerde expressiecassettes zoals sifB::gfp die in11 worden gebruikt, is verlies van expressie in vivo niet detecteerbaar. Als de segmentatie niet consistent is met immunohistochemische gegevens, moet de segmentatiepijplijn worden gewijzigd.
De resolutie van STP-tomografie is onvoldoende om individuele bacteriële cellen in dicht opeengepakte microkolonies op te lossen. De totale fluorescentie-intensiteit van de microkolonie maakt het echter mogelijk om het aantal Salmonella-cellen te schatten. Dit vereist een fluorescerende stam met zeer homogene fluorescentieniveaus zoals Salmonella sifB::gfp11. Het combineren van het geschatte aantal Salmonella-cellen voor alle microkolonies en afzonderlijke cellen levert totale bacteriële weefselbelastingen op die consistent zijn met alternatieve methoden zoals plating of flowcytometrie van weefselhomogenaten11. Plateren en flowcytometrie kunnen niet rechtstreeks vanuit dezelfde weefsels worden uitgevoerd, omdat ze perfusie-gefixeerd moeten zijn voor STP-tomografie. In plaats daarvan moeten ze worden gedaan met extra dieren die niet zijn gefixeerd. Als de mediane bacteriële belasting zoals bepaald door de verschillende benaderingen meer dan 3-voudig verschilt, kan de levensvatbaarheid van fluorescerende bacteriën in het gedrang komen (in het geval van lagere kolonievormende eenheden) of kunnen sommige bacteriën de fluorescerende reporterconstructie hebben verloren (in het geval van hogere kolonievormende eenheden). Er is een controle-experiment nodig om de bron van dergelijke discrepanties te identificeren.
STP-tomografie biedt de lokalisatie van bacteriële cellen binnen de 3D-structuur van de geïnfecteerde weefsels. De tweede harmonische signalen van collageen zorgen voor anatomische oriëntatiepunten zoals slagaders en trabeculae. Bovendien kunnen gastheercellen in vivo worden gekleurd door voorafgaand aan de perfusie een antilichaam tegen oppervlaktemarkers te injecteren (Figuur 5 en Figuur 6). Deze kleuring biedt extra oriëntatiepunten voor weefselcompartimenten en specifieke micro-omgevingen, waaronder ontstekingshaarden (intracellulaire markers en sommige compartimenten met diffusiebarrières zoals de witte miltpulp of de hersenen zijn niet gemakkelijk toegankelijk, geschikt voor deze in vivo kleuring). Deze benadering onthulde de witte miltpulp als een weefselcompartiment dat overleving van Salmonella op lange termijn mogelijk maakt tijdens antimicrobiële chemotherapie11.
Ten slotte kan Salmonella die zich met matige of langzame snelheden repliceert, worden geïdentificeerd en gelokaliseerd binnen de 3D-structuur van weefsels met behulp van stammen die timerbac uitdrukken, een enkele celreporter voor replicatiesnelheid11,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig01.jpg"> Figuur 1: Procedure voor beeldvorming van het hele orgaan met behulp van seriële twee-foton (STP) tomografie. (A-B) Het orgaan wordt geoogst na transcardiale perfusie en 's nachts bewaard in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C. (CE) Het orgaan is ingebed in geoxideerde agarose en verknoopt, vervolgens wordt het weefsel gescand en gesneden met behulp van STP-tomografie. De plakjes worden verzameld voor latere immunohistochemie. (F-J) Computationele analysepijplijnen voor het kwantificeren van bacterieaantallen, bevestiging van fluorescerende bacteriën en 3D-reconstructie van bacterieposities. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig02.jpg"> Figuur 2: Seriële opstelling van twee-foton (STP) tomografie. (A) Tomograaf met (B) 2-fotonbeeldvorming met (C) geautomatiseerde seriële weefselsectie. (D) Verzamelde weefselplakken voor vervolgonderzoek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig03.jpg"> Afbeelding 3: Tegelstiksels en verlichtingscorrectie. Tegels worden gestikt en ongelijkmatige verlichting wordt gecorrigeerd voor het gebruik van gecorrigeerde intensiteitsverdelingen met behulp van geregulariseerde energieminimalisatie (CIDRE). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig04.jpg"> Figuur 4: Segmentatie van Salmonella die het groen fluorescerende eiwit (GFP) tot expressie brengt met behulp van een Support Vector Machine (SVM) en een Convolutional Neural Network (CNN). (A) Representatieve afbeeldingen van GFP-objecten gesegmenteerd door SVM (links) en overeenkomstige afbeeldingen (rechts) met regio's gesegmenteerd door SVM (schaalbalk: 10 μm). (B) Geclusterde rood-groen-blauwe (RGB) waardenverdeling voor de gesegmenteerde regio's. (C) Representatieve afbeeldingen van niet-GFP-objecten die door de SVM ten onrechte als bacteriën zijn geïdentificeerd (links). CNN doet ze terecht af als achtergrond (rechts, schaalbalk: 10 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig05.jpg"> Figuur 5: Detectie van Salmonella die het groen fluorescerende eiwit (GFP) tot expressie brengt door tomografie en bevestiging door immunohistochemie. Beelden van hetzelfde gedeelte verkregen door tomografie (links) of confocale microscopie na kleuring met een antilichaam tegen Salmonella lipopolysaccharide (rechts). Neutrofielen (rood) werden gekleurd door in vivo injectie van een PE-gelabeld anti-Ly-6G-antilichaam voorafgaand aan perfusie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66469/66469fig06.jpg"> Figuur 6: 3D reconstructie en lokalisatie van Salmonella in geïnfecteerde muizenmilt. (A) Driedimensionale (3D) reconstructie van een 5 mm dikke miltplak en in vivo gekleurd vóór perfusie met anti-CD169 antilichaam (rood). Het blauwe signaal vertegenwoordigt collageen gedetecteerd door tweede harmonischen. (B) Een optisch vlak van de 3D-stapel weergegeven in (A). De posities van Salmonellacellen of microkolonies worden aangegeven met sterren. (C) 3D reconstructie van Salmonella posities (sterren) in geïnfecteerde lever. De slagaders zijn zichtbaar op basis van hun collageenomhulsels (blauw). Schaalbalk: 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66469/66469fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Hier beschrijven we een procedure die orgaanbrede detectie van pathogene bacteriën tijdens infectie en kwantificering van fluorescerende reporteractiviteiten mogelijk maakt.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

Bacteriële infecties vormen een grote bedreiging voor de menselijke gezondheid. Antimicrobiële resistentie neemt toe en er ontbreken nog steeds vaccins voor verschillende belangrijke ziekteverwekkers. Om nieuwe wegen voor bestrijdingsstrategieën te identificeren, moeten we meer weten over hoe ziekteverwekkers reageren op het immuunsysteem van de gastheer en op antibiotica in vivo in de geïnfecteerde weefsels.Overlevende bacteriën kunnen recidieven veroorzaken als antimicrobiële middelen een infectie niet kunnen uitroeien. Met behulp van seriële tomografie laten we zien dat buiktyfus veroorzakende salmonella tijdens de therapie in een specifiek deel van de milt kan aanhouden. De ontsteking is zwak in deze regio, wat de kritieke synergie tussen antibiotica en ontsteking voor een effectieve klaring verstoort.Bacteriën zijn objecten ter grootte van een micrometer. Het is moeilijk om zulke kleine objecten in hun weefselcontext te lokaliseren. Seriële twee-fotontomografie kan één enkele bacterie in organen ter grootte van een centimeter detecteren en de replicatiesnelheid bepalen.We kunnen ook immuuncellen, zoals neutrofielen, detecteren en hun ruimtelijke relatie met de bacteriën bepalen. We bestuderen de werking van bacteriostatische antibiotica. Deze antibiotica kunnen infecties genezen, hoewel ze de groei van bacteriën alleen kunnen remmen zonder de ziekteverwekker daadwerkelijk te doden.We bepalen ook de verspreiding van bacteriële mutanten die bepaalde virulentiefactoren missen, en de impact van immuundefecten op infectie en behandeling.

high-resolution-three-dimensional-whole-organ-tomography-microbial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Niet-destructieve volume visualisatie kan alleen worden bereikt door tomografische technieken, waarvan de meest efficiënte is de x-stralen micro gecomputeriseerde tomografie (CT).

Hoge resolutie 3D-beeldvorming van Ex-Vivo Biologische monsters door Micro CT

Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van &lt;1 um heeft x &lt;1 um x &lt;3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100...

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

Gecombineerde optische en μCT beeldvorming in een muismodel van orthopedische implantaten infectie, gebruik van een bioluminescent gemanipuleerde stam van Staphylococcus aureus, die het vermogen om de dynamiek van de bacteriële infectie, evenals de overeenkomstige ontstekingsreactie en anatomische veranderingen in de noninvasively longitudinaal bewaken bone.

Gecombineerd<em&gt; In vivo</em&gt; Optisch en μCT Imaging aan Infectie, Ontsteking, en Bone Anatomie Monitor in een orthopedisch implantaat Infectie in Muizen

Wij protocollen ontwikkeld en ontworpen een aangepaste apparatuur om insluiten van millimeter-schaal specimens. We presenteren monsterbereidingsprocedures met de nadruk op het insluiten in acryl hars en polyimide buizen om rigide immobilisatie en langdurige opslag van specimens voor de ondervraging van architectuur en cel morfologie van weefsels door micro-CT.

Stijve inbedding van vaste en gekleurd, geheel Millimeter-schaal Specimens voor sectie-gratis 3D histologie door Micro-berekend tomografie

Dit protocol legt uit hoe u bacteriële samples voorbereidt en monit voor Live driedimensionale beeldvorming en hoe u de driedimensionale vorm van E. coli van die beelden reconstrueren.

Driedimensionale beeldvorming van bacteriële cellen voor nauwkeurige cellulaire representaties en precieze eiwit lokalisatie

De gehele 3D-structuur en cellulaire inhoud van organoïden, evenals hun fenotypische gelijkenis met het oorspronkelijke weefsel kan worden vastgelegd met behulp van de single-cell resolutie 3D imaging protocol hier beschreven. Dit protocol kan worden toegepast op een breed scala van organoïden variërend in oorsprong, grootte en vorm.

Single-Cell Resolutie driedimensionale beeldvorming van intacte organoïden

Hier wordt een protocol gepresenteerd dat de monstervoorbereiding en gegevensverzamelingsstappen beschrijft die nodig zijn in cryo zachte röntgentomografie (SXT) om de ultrastructuur van hele cryo-geconserveerde cellen in beeld te brengen met een resolutie van 25 nm halve toonhoogte.

Een 3D cartografische beschrijving van de cel door Cryo Soft X-ray Tomography

Cryo-STEM-tomografie biedt een middel om organellen van intacte cellen te visualiseren zonder inbedding, sectie of andere invasieve preparaten. De verkregen 3D-resolutie ligt momenteel in het bereik van enkele nanometers, met een gezichtsveld van enkele micrometers en een toegankelijke dikte in de orde van grootte van 1 μm.

Visualisatie van organellen in situ door cryo-STEM tomografie

We presenteren een stapsgewijs protocol voor hoge-resolutie, labelvrije en driedimensionale beeldvorming van organoïden met behulp van low-coherence holotomografie. Dit protocol beschrijft de voorbereiding van de organoïdecultuur, de beeldvorming en de computationele beeldanalyse, waardoor real-time visualisatie van structurele dynamiek en geneesmiddelresponsen in levende organoïden mogelijk is.

Labelvrije 3D-beeldvorming met hoge resolutie en machine learning-analyse van darmorganoïden via holotomografie met lage coherentie

Dit videoprotocol illustreert hoe scanning-transmissie-elektronenmicroscopietomografie van virologische monsters moet worden uitgevoerd. Voor optimale resultaten worden monsters bereid door vries onder hoge druk en daaropvolgende vriessubstitutie.

Scanning transmissie-elektronenmicroscopietomografie in de virologie: 3D-beeldvorming van onder hoge druk ingevroren, vriesgesubstitueerde monsters

Leer driedimensionale tomografie met hoge resolutie voor het detecteren van Salmonella in geïnfecteerde organen. Deze methode onthult hoe bacteriën overleven tijdens antibiotische behandeling.

Driedimensionale tomografie van het hele orgaan met hoge resolutie van microbiële infecties

Meer video's verkennen