Name: Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:20:00.000+00:00
Duration: 2 min 32 s
Description: Leer een nieuwe intraperitoneale injectietechniek voor volwassen zebravissen die lichaamsschade en sterfte minimaliseert. Deze methode verbetert betrouwbaarheid bij cardiotoxiciteitsonderzoek met doxorubicine.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door de NIH (HL107304 en HL081753) en de Mayo Foundation (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) naar X.X. J.L. wordt gefinancierd door de Fundamental Research Funds for the Central Universities of Central South University, No. 56021702. Speciale dank aan Beninio Gore en Quentin Stevens voor het beheer van de zebravisfaciliteit.

Alle uitgevoerde procedures zijn goedgekeurd door de Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee, in overeenstemming met de normen die zijn uiteengezet in de 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals' (National Academies Press, 2011). Alle zebravissen in het onderzoek behoren tot de Wild Indian Karyotype (WIK) stam. De details van de reagentia en de apparatuur die voor het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.
1. Bereiding en opslag van doxorubicine bouillonoplossing
<ol><li>Verkrijg de doxorubicine-bouillon van een commerciële bron. OPMERKING: Doxorubicine is lichtgevoelig, dus koop het in poedervorm en bewaar het in ondoorzichtige containers om het te beschermen tegen blootstelling aan licht. Voer alle stappen uit voor de Dox-poederbereiding in een chemisch omhulsel.</li>
	<li>Los het Dox-poeder volledig op in gedestilleerd water en bereid een bouillonoplossing met een eindconcentratie van 5 mg/ml.</li>
	<li>Aliquot de bouillon door deze te verdelen in buisjes van 1,5 ml.</li>
	<li>Wikkel de buizen in aluminiumfolie om ze te beschermen tegen blootstelling aan licht.</li>
	<li>Bewaar de aliquot Dox-oplossing bij 4 °C voor kortstondige opslag (<1 maand), of -20 °C voor langdurige opslag10.</li>
</ol>2. Groeperen van de vissen op basis van hun lichaamsgewicht
<ol><li>Groepeer de vissen met een BW-verschil van minder dan 10% samen voor de volgende injectie. OPMERKING: Om in deze fase moeite te besparen, worden vissen met een afwijking van minder dan 10% BW gecategoriseerd als dezelfde grootte.</li>
	<li>Laat de vissen 24 uur voor de injectie vasten.</li>
	<li>Verdoof de vissen met embryowater met 0,16 mg/ml tricaïne gedurende 1 minuut.</li>
	<li>Haal de vis met tricaïne uit het water en dep beide kanten van het vislichaam in met schoon filtreerpapier om overtollig water te verwijderen.</li>
	<li>Meet en registreer het lichaamsgewicht van elke vis en breng de vis vervolgens onmiddellijk terug naar een hersteltank gevuld met vers systeemwater. OPMERKING: Dox-injectie werd uitgevoerd bij vissen na het bereiken van de leeftijd van 3 maanden. In deze studie gebruikten onderzoekers vissen van 3 maanden tot 10 maanden oud. De BW's van volwassen zebravissen van de WIK-stam kunnen variëren van 0,2 g tot 0,5 g. Langdurige anesthesie van meer dan 5 minuten, gevolgd door een Dox-injectie, leidde tot een hoge vissterfte.</li>
</ol>3. Voorbereiding van de naald en het station voor injectie
<ol><li>Bepaal het injectievolume van Dox-bouillonoplossing (bijv. 5 mg/ml) dat nodig is voor elke vis op basis van het gemiddelde lichaamsgewicht om de beoogde dosis van 20 μg/g te bereiken.</li>
	<li>Gebruik de volgende formule om het injectievolume te berekenen: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66500/66500eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Voeg 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) toe om de in stap 1 berekende Dox-oplossing voor injectie te verdunnen tot een totaal volume van 5 μL. OPMERKING: Gebruik een bulkoplossing voor elke groep vissen op basis van hun lichaamsgewicht en neem in elke groep 3 extra vissen op om ervoor te zorgen dat er in de loop van het experiment geen tekort is aan oplossing voor injectie.</li>
	<li>Tik zachtjes op de buis en microcentrifugeer vervolgens kort op topsnelheid om de oplossing gedurende 10 s bij kamertemperatuur op te vangen.</li>
	<li>Plaats de bereide oplossing op ijs en bescherm deze tegen blootstelling aan licht.</li>
	<li>Plaats een schoon petrischaaltje van 100 mm met een spons onder een snijmicroscoop en pas vervolgens de scherpstelling aan. LET OP: De spons bevat een 4 cm lange groef. De elastische terugtrekking van de spons biedt de vis ondersteuning en houdt het lichaam van de vis op zijn plaats. De spons kan worden hergebruikt.</li>
	<li>Rust een microspuit van 10 μl uit met een afgeschuinde naald van 34 G.</li>
	<li>Spoel de naald met 1x HBSS-buffer om eventuele luchtbellen te verwijderen en mogelijke verstoppingen van de spuit te verwijderen.</li>
	<li>Meet 5 μl van de in stap 4 bereide oplossing voor de injectie af.</li>
</ol>4. IP Dox-injectieprocedure
<ol><li>Zet de volwassen vissen gedurende 1 minuut in water met 0,16 mg/ml tricaïne om een staat van bewusteloosheid op te wekken.</li>
	<li>Plaats de vis in de groef van de ingebedde spons met de buik naar boven gericht (Figuur 1A).</li>
	<li>Steek de naald in met een hoek van bijna 0°, beginnend vanaf het middelpunt van de borstvin naar de achterkant van de hartholte (Figuur 1B). OPMERKING: Vermijd elk contact met het hart tijdens de procedure.</li>
	<li>Richt de naald naar de staart en ga onder de zilveren huid. OPMERKING: Plaats de naald in de buurt van de zilveren huid en zorg ervoor dat u niet krabt of doorboort.</li>
	<li>Controleer de naaldpunt in de buikholte gedurende de gehele operatie (Figuur 1C). OPMERKING: Vermijd beschadiging van de lever, darmen, zwemblaas en andere organen. Zorg ervoor dat de naald het einde van de darm bereikt, in de buurt van het cloacale foramen.</li>
	<li>Doseer geleidelijk en gelijkmatig de Dox-oplossing van 5 μL en trek de naald vervolgens langzaam terug langs het oorspronkelijke pad om lekkage te voorkomen (Figuur 1D).</li>
	<li>Controleer de buikholte op de aanwezigheid van Dox door een rode verkleuring van de Dox-oplossing te observeren (Figuur 1E).</li>
	<li>Verplaats de geïnjecteerde vissen snel naar een schoon oversteekaquarium gevuld met vers systeemwater om de vissen te helpen herstellen. OPMERKING: Spoel de naald tussen de injecties door één keer door met 1x HBSS-buffer.</li>
</ol>5. Beheer van vissen na injectie
<ol><li>Breng de vissen na de injectie terug in het systeem met circulatie.</li>
	<li>Vasten van alle geïnjecteerde vissen gedurende nog eens 24 uur om hun herstel te vergemakkelijken.</li>
	<li>Houd de vissen de eerste week goed in de gaten. Verwijder de overleden vissen zo snel mogelijk om besmetting van de andere vissen te voorkomen. OPMERKING: Vissterfte binnen de eerste 24 uur is waarschijnlijk te wijten aan lichamelijk letsel door de injectie of langdurige anesthesie. Registreer visaantallen om een overlevingscurve te genereren.</li>
	<li>Voer echocardiografie uit om de met Dox geïnjecteerde vis 56 dagen na injectie te fenotypen11. OPMERKING: Zorg voor uniformiteit in omstandigheden en procedures voor de overeenkomstige controlegroep die met HBSS-oplossing wordt geïnjecteerd.</li>
</ol>

Geoptimaliseerde intraperitoneale injectie voor toediening van verbindingen bij volwassen zebravissen

<ol><li>Tavares, B., Lopes, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Zebrafish+in+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Medica+Portuguesa%22%5BJournal%5D)">The importance of Zebrafish in biomedical research.</a> Acta Medica Portuguesa. 26 (5), 583-592 (2013).</li>
<li>Dang, M., Henderson, R. E., Garraway, L. A., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+drug+administration+in+the+adult+zebrafish+using+oral+gavage+for+cancer+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Long-term drug administration in the adult zebrafish using oral gavage for cancer preclinical studies.</a> Disease Model Mech. 9 (7), 811-820 (2016).</li>
<li>Sciarra, J. B., Tyler, A., Kolb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gelatin-based+diet+for+oral+dosing+juvenile+to+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal+Sci+Prof%22%5BJournal%5D)">A gelatin-based diet for oral dosing juvenile to adult zebrafish (Danio rerio).</a> Lab Animal Sci Prof. , https://api.semanticscholar.org/CorpusID:85611302 32-35 (2014).</li>
<li>Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+injection+into+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal injection into adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (42), e2126(2010).</li>
<li>Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injection+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injection in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (34), e1645(2009).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneally+delivered+mesenchymal+stem+cells+alleviate+experimental+colitis+through+THBS1-mediated+induction+of+IL-10-competent+regulatory+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneally delivered mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis through THBS1-mediated induction of IL-10-competent regulatory B cells.</a> Front Immunol. 13, 853894(2022).</li>
<li>De Smet, L., Ceelen, W., Remon, J. P., Vervaet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+drug+delivery+systems+for+intraperitoneal+therapy+to+extend+the+residence+time+of+the+chemotherapeutic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Optimization of drug delivery systems for intraperitoneal therapy to extend the residence time of the chemotherapeutic agent.</a> The Scientific World Journal. 2013, 720858(2013).</li>
<li>Dakwar, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomedicine-based+intraperitoneal+therapy+for+the+treatment+of+peritoneal+carcinomatosis-Mission+possible%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Nanomedicine-based intraperitoneal therapy for the treatment of peritoneal carcinomatosis-Mission possible.</a> Adv Drug Deliv Rev. 108, 13-24 (2017).</li>
<li>Al Shoyaib, A., Archie, S. R., Karamyan, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraperitoneal+route+of+drug+administration%3A+should+it+be+used+in+experimental+animal+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Res%22%5BJournal%5D)">Intraperitoneal route of drug administration: should it be used in experimental animal studies.</a> Pharmaceutical Res. 37, 1-17 (2020).</li>
<li>Ma, X., Ding, Y., Wang, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+model+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (136), e57567(2018).</li>
<li>Wang, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+echocardiographic+assessment+of+cardiac+function+in+normal+adult+zebrafish+and+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models.</a> Disease Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).</li>
<li>Christidi, E., Brunham, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+cell+death+pathways+in+doxorubicin-induced+cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Regulated cell death pathways in doxorubicin-induced cardiotoxicity.</a> Cell Death Dis. 12 (4), 339(2021).</li>
<li>Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+juvenile+doxorubicin-induced+cardiac+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Res%22%5BJournal%5D)">A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction.</a> Pediatric Res. 64 (5), 488-494 (2008).</li>
<li>Podyacheva, E. Y., Kushnareva, E. A., Karpov, A. A., Toropova, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+models+of+doxorubicin-induced+cardiomyopathy+in+rats+and+mice.+A+modern+view+from+the+perspective+of+the+pathophysiologist+and+the+clinician%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of models of doxorubicin-induced cardiomyopathy in rats and mice. A modern view from the perspective of the pathophysiologist and the clinician.</a> Frontiers Pharmacol. 12, 670479(2021).</li>
<li>Chaoul, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+drug+administration+techniques+in+zebrafish+models+of+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Assessing drug administration techniques in zebrafish models of neurological disease.</a> Int J Mol Sci. 24 (19), 14898(2023).</li>
<li>Lu, X., Lu, L., Gao, L., Wang, Y., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calycosin+attenuates+doxorubicin-induced+cardiotoxicity+via+autophagy+regulation+in+zebrafish+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Calycosin attenuates doxorubicin-induced cardiotoxicity via autophagy regulation in zebrafish models.</a> Biomed Pharmacother. 137, 111375(2021).</li>
</ol>

Anders dan de twee bestaande IP-injectiemethoden 4,10, wordt de nieuwe IP-injectiemethode gekenmerkt door de volgende onderscheidende kenmerken. Ten eerste wordt een unieke naaldpenetratiehoek gebruikt (bijna nul); ten tweede dringt de naald de vis binnen via een unieke locatie, d.w.z. een natuurlijk gat in het ventrale oppervlak van een vis, wat de injectie zou vergemakkelijken; En tot slot is de beweging van de naald van vooraan naar achter. Deze aanpassingen verminderen effectief orgaanletsel, dat het gevolg is van minimale lekkage van Dox tijdens het penetratieproces. Het pad van de naald bevindt zich net onder de zilveren huid, die continu kan worden gecontroleerd door de onderzoeker. Bijgevolg kan direct contact tussen de punt van de naald en de inwendige organen effectief worden vermeden. Na injectie blijven alle geïnjecteerde Dox in de buikholte en de enige uitgang (prikpunt) kan worden gesloten als de vis wakker is en naar voren begint te zwemmen.
Vergeleken met de twee bestaande IP-injectiemethoden 4,10, resulteert de nieuwe IP-injectiemethode consequent in minimale lichaamsschade en verbeterde overlevingskansen. Deze verklaring werd verder onderstreept door de haalbaarheid van meerdere injecties in dezelfde vis voor het genereren van een chronisch DIC-model voor zebravissen. Belangrijk is dat, in vergelijking met de vorige twee IP-injectiemethoden 4,10, de nieuwe methode snel onder de knie kan worden gekregen door onderzoekers die geen eerdere ervaring hebben met het omgaan met volwassen zebravissen. Betrouwbare DIC-modellen lijken met succes te zijn verkregen bij hun eerste of tweede poging in de handen van ten minste 4 verschillende onderzoekers. Het succes van de injectie kan gemakkelijk worden geconcludeerd binnen de eerste week na de injectie: >80%, bij voorkeur 100%, zouden vissen na de injectie moeten kunnen overleven. Alle vissen zullen overleven tot 56 dpi, wanneer de meerderheid van de vissen (>80%) vrij zou moeten zijn van duidelijke lichaamsschade. Dit is een aanzienlijke verbetering, omdat een betrouwbaar DIC-model met behulp van de eerste twee IP-methoden alleen in de hand van een onderzoeker kan worden gestabiliseerd na meer dan 3 oefenrondes met ten minste 10 vissen in elke ronde. Dit proces kan tijdrovend zijn, omdat elke praktijk ongeveer 2 maanden nodig heeft om het succes van zijn/haar injectie te concluderen. Het verminderen van weefseltrauma verbetert niet alleen het welzijn van de vissen, maar minimaliseert ook verstorende factoren die de resultaten van het onderzoek kunnen beïnvloeden.
Een cruciale stap om het succes van de nieuwe methode te garanderen, is de penetratiehoek. Zoals te zien is in figuur 2, werd bij een verandering van de penetratiehoek van 0° naar 45° een aanzienlijke vissterfte waargenomen, vermoedelijk als gevolg van een verhoogd risico op contact tussen de punt van de naald en inwendige organen.
De primaire beperking van de methode is dat de methode niet kan worden gebruikt om medicijnen af te leveren aan vissen jonger dan 3 maanden. Vanwege hun kleine lichaamsgrootte kunnen jonge vissen niet overleven na de fysieke schade die gepaard gaat met het binnendringen van een naald. De methode kan echter worden gebruikt bij volwassen vissen waarvan het lichaamsgewicht groter is dan 0,15 g, inclusief vissen in de leeftijd van 3 maanden tot 4 jaar.
Deze nieuwe methode zou op grote schaal worden gebruikt voor de toediening van geneesmiddelen bij volwassen zebravissen, vooral wanneer het gaat om potentieel giftige stoffen zoals Dox15,16. Als het gaat om niet-toxische verbindingen, moeten alle drie de methoden van toepassing zijn.

Zebravis (Danio rerio) heeft de aandacht getrokken als een experimenteel model voor het bestuderen van menselijke ziekten, omdat dit dier een hoge gen- en orgaanhomologie met mensen, externe bevruchting, gemak van genetische manipulatie en lichaamstransparantie tot vroege volwassenheid omvat, wat een groot aantal beeldvormingstoepassingen mogelijk maakt. In tegenstelling tot het eenvoudige proces van het rechtstreeks afleveren van medicijnen in het water voor zebravisembryo's en larven, is het toedienen van medicijnen aan volwassen zebravissen een meer ingewikkelde en uitdagende onderneming.
Bij volwassen vissen kunnen verbindingen worden toegediend door middel van passieve medicijnafgiftetechnieken, zoals directe toediening in het water, of door orale medicijnafgiftemethoden zoals gavaging2. Andere benaderingen zijn onder meer het bedekken van visvoer met de verbindingen en vervolgens het voeren van de vissen3, en directe toediening van in water onoplosbare medicijnen in een vooraf bepaalde concentratie, inclusief retro-orbitale of intraperitoneale injecties 4,5. Intraperitoneale toediening heeft de voorkeur voor in vivo studies van ziektemodellen vanwege de duidelijke farmacokinetischevoordelen 6. Deze methode zorgt voor een hoge geneesmiddelconcentratie en een verlengde halfwaardetijd in de peritoneale holte, wat een effectieve route biedt voor medicijnafgifte 7,8. De aanpak wordt vaak gebruikt in onderzoeksomgevingen om een optimale opname en distributie van geneesmiddelen te garanderen 9. Hoewel op injectie gebaseerde methoden efficiënt blijken te zijn voor eenmalige toediening, leiden langdurige en herhaalde injecties vaak tot lichaamsbeschadiging en chronischeinfecties.
Momenteel zijn er twee methoden voor IP-injectie bij volwassen zerbafish 4,10. Beide methoden hebben echter beperkingen bij het toedienen van giftige stoffen zoals doxorubicine, wat leidt tot ernstige schade aan de lichaamsvorm en vissterfte. De bijwerkingen kunnen de interpretatie van gegevens aanzienlijk bemoeilijken. Hoewel deze uitdagingen kunnen worden aangepakt met uitgebreide training10, is er duidelijk behoefte aan een nieuwe IP-injectiemethode die bijwerkingen minimaliseert.
Hier is ons doel om een nieuwe methode van IP-injectie te ontwikkelen die is geoptimaliseerd voor de effectieve afgifte van doxorubicine aan volwassen zebravissen, waardoor het genereren van betrouwbare doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie (DIC)-modellen wordt vergemakkelijkt met minimale lichaamsschade en bijbehorende mortaliteit.

<table><tbody><tr><td>10 &mu;L NanoFil-spuit</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>NANOFIL</td><td>injectietool</td></tr><tr><td>34 G naald</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>NI34BV-2</td><td>injectietool</td></tr><tr><td>60 mm Petri-schaal</td><td>fisher scientific/fisherbrand</td><td>FB0875713A</td><td>het plaatsen van de spons&nbsp;</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Het injecteren van de Dox</td></tr><tr><td>Doxorubicine hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>D1515-10MG</td><td>medicijn voor het creëren van DIC-model&nbsp;</td></tr><tr><td>Echocardiografie</td><td>VISUAL SONICS</td><td>Vevo 3100</td><td>meten van de hartfunctie</td></tr><tr><td>Schuimspons</td><td>Jaece Industries</td><td>L800-D</td><td>het plaatsen van de vis</td></tr><tr><td>Hank's gebalanceerde zout oplossing (HBBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>14025076</td><td>Drager voor Dox</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&nbsp;</td><td>southernlabware</td><td>MyFuge/C1012</td><td>de Dox-oplossing verzamelen&nbsp;</td></tr><tr><td>Precisiebalansweegschaal</td><td>Torbal</td><td>AD60</td><td>Digitale weegschaal</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Argent</td><td>MS-222</td><td>Verdoving van vissen</td></tr><tr><td>Buis</td><td>Eppendorf</td><td>1,5 mL</td><td>opslag&nbsp;</td></tr><tr><td>vevo LAB&nbsp; software</td><td>FUJIFILM VISUAL SONICS&nbsp;</td><td>5.6.0</td><td>kwantificering van het hart</td></tr></tbody></table>

een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

An Intraperitoneal Injection Technique in Adult Zebrafish that Minimizes Body Damage and Associated Mortality

De volwassen zebravis (Danio rerio), die genetisch toegankelijk is, wordt gebruikt als een waardevol model voor gewervelde dieren om menselijke aandoeningen zoals cardiomyopathie te bestuderen. Intraperitoneale (IP) injectie is een belangrijke methode die verbindingen aan het lichaam afgeeft voor het testen van therapeutische effecten of het genereren van ziektemodellen zoals doxorubicine-geïnduceerde cardiomyopathie (DIC). Momenteel zijn er twee methoden voor IP-injectie. Beide methoden hebben beperkingen bij het omgaan met giftige stoffen zoals doxorubicine, die resulteren in bijwerkingen die zich manifesteren als ernstige schade aan de lichaamsvorm en vissterfte. Hoewel deze tekortkomingen kunnen worden overwonnen door uitgebreide training van onderzoekers, is een nieuwe IP-injectiemethode met minimale bijwerkingen wenselijk. Hier wordt een unieke IP-injectiemethode gerapporteerd die in staat is om giftige stoffen aan te pakken. Een consequent verminderde hartfunctie kan het gevolg zijn zonder dat er sprake is van significante vissterfte. De techniek is gemakkelijk onder de knie te krijgen door onderzoekers die minimale ervaring hebben met volwassen zebravissen.

Eerder zijn twee intraperitoneale (IP) methoden gebruikt voor de toediening van doxorubicine bij volwassen zebravissen 4,10. Bij methode I, ook wel bekend als de klassieke IP-injectiemethode zoals beschreven door Kinkel et al.4, werd de naald ingebracht in een hoek van 45° ten opzichte van de middellijn tussen de buikvinnen met de buik naar boven. Bij methode II, of de alternatieve IP-injectiemethode zoals beschreven door Ma et al.10, werd de naald door de dorsale zijde van de vis ingebracht (Figuur 2A(i,ii)). Onze methode III heeft daarentegen twee grote veranderingen. Eerst wordt de positie van de injectie veranderd, waarbij de buik naar boven wijst en de naald vanuit het midden van de borstvin naar de buik wordt gericht. De penetratieplaats wordt geleid door een natuurlijk gat in dit gebied. Ten tweede wordt de hoek van de naald verkleind, die dicht bij 0° moet liggen (Figuur 2A(iii), Figuur 1).
Vergelijking tussen drie intraperitoneale injectiemethoden Om de drie IP-injectiemethoden te vergelijken, worden gegevens gepresenteerd die zijn verkregen van onderzoeker I, die geen eerdere ervaring had met zebravissen. Wanneer de methoden I en II werden gebruikt voor IP-injectie, werd een significante vissterfte waargenomen in de eerste twee weken na IP-injectie. Bij methode I werd de dood drie dagen na de injectie waargenomen, terwijl bij methode II de dood twee dagen na de injectie optrad. 70% van de geïnjecteerde vissen vertoonden zichtbare lichaamsschade, vooral rond de injectieplaats, wat zich manifesteerde als een drastisch verminderde lichaamsgrootte en gebogen lichaamsvorm één tot twee maanden na IP-injectie (Figuur 2A (iv,v)). Er werd geredeneerd dat de mortaliteit en de waargenomen schade konden worden toegeschreven aan de toxiciteit van doxorubicine12, dat tijdens het injectieproces uit het openingsuiteinde van de injectienaald zou kunnen lekken en het inwendige orgaan langs de route van de injectie zou kunnen beschadigen. Bij methode I kan de punt van de injectienaald de darm raken (figuur 2A(i)), terwijl bij methode II de zwemblaas kan raken (figuur 2A(ii)). Er werd gepostuleerd dat men kon voorkomen dat de punt van de naald een inwendig orgaan raakte door methode III te gebruiken (Figuur 2A(iii)). Er werd inderdaad een significant verbeterde overlevingskans opgemerkt, waarbij 80% van de vissen 1 maand na injectie overleefde (figuur 2B). Dit betekent een opmerkelijke verbetering ten opzichte van de overlevingspercentages voor methode I en II, die respectievelijk 53,33% en 33,33% bedroegen. Belangrijk is dat 80% van de overlevende vissen een normale lichaamsvorm vertoonde, in tegenstelling tot die gegenereerd door methode I en II (Figuur 2A(vi)). Om de succesvolle generatie van het DIC-model te valideren, werd de hartfunctie geëvalueerd door het percentage van de ejectiefractie (EF%) te meten. Inderdaad, een significante vermindering van EF% werd waargenomen 56 dagen na injectie in de groep die methode III gebruikte (Figuur 2C).
Reproduceerbaarheid van methode III door verschillende onderzoekers Om te bewijzen dat methode III gemakkelijk door verschillende onderzoekers kan worden beheerst, werden 3 onderzoekers voor de studie gerekruteerd die nog nooit eerder met zebravissen hadden gewerkt. Bij hun eerste pogingen met methode III waren alle onderzoekers in staat om 56 dagen na injectie overlevingspercentages van 85,71%, 95% en 83,33% te bereiken en een duidelijk verlaagde EF (Figuur 3A,B). Merk op dat drie onderzoekers hun experiment respectievelijk 3 keer, 3 keer en 2 keer herhaalden en consequent succesvolle resultaten behaalden. Deze gegevens bevestigden de herhaalbaarheid van methode III, waardoor onderzoekers zonder eerdere ervaring met het werken met vissen betrouwbare DIC-modellen konden genereren.
In een van de eerste pogingen met methode III testte onderzoeker II een afwijking van methode III: in plaats van 0° werd een hoek van 45° gebruikt terwijl de naald door de huid werd gestoken (Figuur 2A(iii), gestippelde pijl). Slechts 15% van de vissen overleefde twee maanden na injectie (figuur 3A), waarbij 80% van de overlevende vissen aanzienlijke lichaamsschade vertoonde. De gegevens gaven aan dat de hoek van de penetratie een cruciale stap is voor het succes van methode III.
Methode III maakt het mogelijk om een chronisch DIC-model op te stellen Er werd gepostuleerd dat aanzienlijk verminderde lichaamsschade meerdere IP-injecties in dezelfde vis mogelijk zou kunnen maken, waarbij het chronische DIC-model bij muizen wordt nagebootst13,14. Daarom werd methode III gebruikt om gedurende 4 opeenvolgende weken een reeks injecties uit te voeren, met 5 μg/g Dox per week (figuur 4A). In dit experiment overleefde 100% van de geïnjecteerde vissen en 80% van hen vertoonde geen tekenen van lichaamsschade. Belangrijk is dat een significant verminderde ejectiefractie werd opgemerkt bij 56 dpi, wat wijst op de succesvolle generatie van een chronisch DIC-model bij volwassen zebravissen (Figuur 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig01.jpg"> Figuur 1: Locatie en hoek van het inbrengen van de naald voor de nieuwe IP-injectiemethode. (A) De locatie van het inbrengen van de naald. De vis ligt ondersteboven, waardoor de buikzijde bloot komt te liggen. Het hoofd is naar rechts. Tussen de borstvinnen bevindt zich een natuurlijk gat dat het binnendringen van de huid eenvoudiger maakt. (B) De hoek van het inbrengen van de naald. Het is bijna nul graden ten opzichte van het oppervlak van de vis. (C) Het spoor van de naald onder de huid. De punt van de naald wordt continu gecontroleerd zodra deze zich in de buikholte bevindt. Het instappunt ziet er anders uit dan in figuur 1A vanwege de vervorming van de huid tijdens het penetratieproces. (D) Een vis nadat Dox is vrijgelaten. De buikholte wordt rood na het loslaten van de Dox. (E) Een vis na IP-injectie. Er is geen teken van lekkage na het terugtrekken van de naald. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig02.jpg"> Figuur 2: Vergelijking van drie IP-injectiemethoden bij volwassen zebravissen. (A) Schema's van drie IP-injectiemethoden. (i-iii) Getoond worden schema's van de klassieke IP-injectie (methode I), alternatieve IP-injectie (methode II) en de nieuwe methode (methode III). Pijlen geven de penetratieplaatsen en de hoek van de naald aan voor drie injectiemethoden. Gestippelde pijl, een mislukte hoek van naaldpenetratie. Schaalbalk: 5 mm. (iv-vi) Verkleinde lichaamsgrootte en gebogen lichaamsvorm in DIC-modellen. Afgebeeld zijn representatieve vissen van DIC-vissen op 56 dpi. (B) Vergelijking van de overlevingscurven tussen drie IP-injectiemethoden. Het aantal overlevende vissen werd wekelijks geregistreerd. (Het experiment begon met een totaal van n = 15). (C) Beoordeling van de hartfunctie van vissen bij 56 dpi na Dox-stress. n = 6 vissen in de 1x HBSS-controlegroep, en het experiment begon met een totaal van n = 15 vissen in elke 3 batches geïnjecteerd met Dox. Waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardfout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig03.jpg"> Figuur 3: Methode III maakt het mogelijk om het DIC-model van de zebravis consistent vast te stellen in de handen van 3 verschillende onderzoekers. (A) Overlevingscurves van DIC-vissen met behulp van methode III door drie verschillende onderzoekers. Bij alle drie de onderzoekers werd een hoog overlevingspercentage opgemerkt. De aantallen levende vissen worden wekelijks geregistreerd. Een laag overlevingspercentage werd opgemerkt voor onderzoeker II wanneer een niet-succesvolle methode III werd gebruikt (45° naaldpenetratiehoek, zoals weergegeven door een gestippelde pijl in figuur 2A). (B) Beoordeling van de hartfunctie van DIC-vissen met behulp van methode III door drie verschillende onderzoekers. In totaal gebruikte Researcher II, voor een naaldpenetratiehoek van 45°, 3 batches (9, 12, 14) vissen voor Dox-injectie. Voor een penetratiehoek van de naald met een hoek van 0° n = werden 6 vissen gebruikt in de 1x HBSS als gedeelde controlegroep. Het experiment begon met een totaal van n = 85 vissen met RII (9, 12, 14), RIII (8, 6, 6) en RIV (12, 18) gebruikt in elk van de 8 batches geïnjecteerd met Dox door respectievelijk drie onderzoekers (II, III, IV). Waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardfout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66500/66500fig04.jpg"> Figuur 4: Methode III maakt het mogelijk om meerdere injecties met Dox toe te dienen in een volwassen zebravis, waarbij chronische DIC-modellen bij knaagdieren worden samengevat. (A) Schema's van het model voor meervoudige injecties. 5 μg/g Dox (5 μL) werd geïnjecteerd in vier opeenvolgende weken. (B) Het chronische DIC-model vertoont een verlaagd EF% bij 56 dpi. Waarden worden weergegeven als het gemiddelde ± standaardfout. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66500/66500fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Een nieuwe intraperitoneale (IP) injectiemethode bij volwassen zebravissen wordt beschreven. Bij het hanteren van giftige stoffen zoals doxorubicine is deze procedure effectiever dan de twee eerder gerapporteerde IP-methoden. De techniek is zo ontworpen dat het gemakkelijk kan worden toegepast door onderzoekers met beperkte ervaring in het zebravismodel.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

The adult zebrafish (Danio rerio), which is genetically accessible, is being employed as a valuable vertebrate model to study human disorders such as ...

We streven ernaar om door anthracycline geïnduceerde cardiotoxiciteitsmodellen te genereren in volwassen zebravissen, zodat we nieuwe therapeutische genen en verbindingen kunnen ontdekken. Een betrouwbare IP-injectiemethode is essentieel om het succes van dit project te garanderen. Eerder ontwikkelde IP-injectiemethoden zijn dus de klassieke en alternatieve technieken.Terwijl de klassieke methode de vis penetreert vanaf de buik via de middellijn tussen de buikvinnen, dringt de alternatieve methode de vis binnen vanaf de dorsale plaats tussen de bekken- en de anaalvinnen. Vanwege de toxiciteit van doxorubicine zijn aanzienlijke lichaamsschade en sterfte van de vissen vastgesteld met behulp van de huidige twee IP-methoden. Nieuwe onderzoekers moeten uitgebreid worden getraind voordat ziektemodellen op betrouwbare wijze in hun handen kunnen worden vastgesteld.We hebben een nieuwe IP-injectiemethode ontworpen door de naaldpenetratielocatie en de naaldpenetratiehoek aan te passen. We injecteren door een natuurlijk gat in het ventrale gebied tussen de borstvinnen en dringen door een unieke voorste naar achterste richting.

an-intraperitoneal-injection-technique-adult-zebrafish-that-minimizes

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier laten we zien hoe retro-orbitale injectie te doen in volwassen zebravissen.

Retro-orbitale injectie in Adult zebravis

Tonen we intraperitoneale injectie in volwassen zebravissen. We maken gebruik van een 10 ul NanoFil injectiespuit bestuurd door een Micro4 controller en UltraMicroPump III. Deze demonstratie omvat het gebruik van koud water als een verdoving.

Intraperitoneale injectie in de Adult zebravis

Deze video beschrijft de techniek van intramusculaire injectie voor het leveren van verbindingen in de rugspieren van een volwassen zebravis.

Intramusculaire (IM) injectie: samengestelde toediening in de dorsale spier van een volwassen zebravis

Deze video beschrijft een techniek van intraperitoneale injectie, een methode voor het leveren van oplossingen in de buikholte van Adult Zebrafish.

Intraperitoneale injectie: een methode voor oplossingsafgifte in de buikholte van een volwassen zebravis

Deze video beschrijft de techniek van het leveren van verbindingen in het hart van volwassen zebravissen met behulp van intrathoracale injectie.

Intrathoracale injectie: samengestelde levering aan het volwassen zebravishart

Deze methode baseert zich op de injectie van 0.5 − 3 l van oplossing in de thorax van volwassen zebravis. De procedure levert efficiënt proteïnen en chemische samenstellingen in de nabijheid van het zebravis hart zonder het orgaan te beschadigen. De aanpak is geschikt voor het testen van effecten van exogene factoren op verschillende weefsels van het hart.

Intrathoracale injectie voor de studie van volwassen zebravis hart

Hier presenteren we een geoptimaliseerd en effectief protocol voor de intraveneuze injectie van cellen of farmacologische middelen in volwassen zebravissen, wat resulteert in verbeterde celtransplantatie en verhoogde overlevingskansen van de behandelde zebravissen.

Geoptimaliseerde intraveneuze injectie bij volwassen zebravissen

De zebravis is een waardevol model om de mechanismen van het hart regeneratie studeren in gewervelde dieren. Hier presenteren we een protocol voor inductie van een hartinfarct bij volwassen zebravissen met cryoinjury. Deze methode resulteert in een massale celdood binnen 20% van de ventriculaire wand, vergelijkbaar met dat in zoogdiercellen infarcten.

Inductie van myocardinfarct bij Adult Zebravissen Met behulp van Cryoinjury

Een snelle manier om te screenen op melanoom modifiers met behulp van een zebravis autochtone tumor model gepresenteerd. Het maakt gebruik van de miniCoopR vector waarmee expressie van genen kandidaat melanoom in melanocyten. Een methode om melanoom-vrije overleving bochten, een invasie assay, een protocol voor antilichaam kleuring van schaal melanocyten en een melanoom transplantatie assay te verkrijgen zijn beschreven.

Screening op Melanoom Modifiers het gebruik van een zebravis Autochtone tumormodel

Het bepalen van donorcel innesteling vormt een uitdaging in de muis beenmerg transplantatie modellen die goed gedefinieerde fenotypische merkers missen. We beschreven een methode om mannelijke donor cel innesteling te kwantificeren in vrouwelijke transplantatie ontvangende muizen. Deze methode kan worden gebruikt in alle muizenstammen voor de studie van HSC functies.

Met behulp van kwantitatieve real-time PCR voor donorcel Engraftment bepalen in een concurrerende Murine beenmergtransplantatie Model

Leer een nieuwe intraperitoneale injectietechniek voor volwassen zebravissen die lichaamsschade en sterfte minimaliseert. Deze methode verbetert betrouwbaarheid bij cardiotoxiciteitsonderzoek met doxorubicine.

Een intraperitoneale injectietechniek bij volwassen zebravissen die lichaamsschade en bijbehorende sterfte minimaliseert

Meer video's verkennen