Name: Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T14:55:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Leer hoe je NHEJ- en HR-reparatie-efficiëntie analyseert in HEK-293T-cellen met behulp van GFP-gebaseerde reportersystemen en flowcytometrie. Deze methode versnelt DNA-herstelonderzoek aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit onderzoek werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Heilongjiang in China (YQ2022C036) en de Graduate Innovation Foundation van de Qiqihar Medical University (QYYCX2022-06). Figuur 1 geproduceerd met behulp van MedPeer.

1. Plasmide isolatie
<ol><li>Transformeer competente E. coli met de plasmiden EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (I-SceI die plasmide tot expressie brengt) en PCI2-HA-mCherry (plasmide die mCherry tot expressie brengt) (zie Materiaaltabel) volgens het standaard transformatieprotocol20. OPMERKING: PCI2-HA-mCherry kan worden vervangen door andere plasmiden die mCherry of DsRed tot expressie brengen.</li>
	<li>Kweek de getransformeerde E. coli in 500 ml vloeibaar LB-medium aangevuld met 100 μg/ml ampicilline 's nachts bij 37 °C met schudden.</li>
	<li>Isoleer de plasmiden met behulp van een in de handel verkrijgbare endotoxinevrije plasmide maxi-isolatiekit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).</li>
	<li>Kwantificeer de plasmideconcentraties met behulp van nanodruppel microvolume spectrofotometers. Pas de plasmideconcentratie aan naar 1 μg/μL.</li>
</ol>2. Celvoorbereiding en transfectie
<ol><li>Kweek HEK-293T cellen in DMEM medium aangevuld met 10% foetaal runderserum. Zorg ervoor dat de HEK-293T-cellen of gevestigde HEK-293T-stalcellen zich in een goede groeistatus bevinden. OPMERKING: Ingevroren cellen moeten ten minste twee splitsingsrondes ondergaan voordat ze worden getransfecteerd.</li>
	<li>Zaai op de dag voorafgaand aan de transfectie HEK-293T-cellen in een plaat met 6 putjes bij 2 × 105 cellen/putje om de volgende dag ongeveer 60% confluentie te bereiken.</li>
	<li>Bevestig op de dag van transfectie de samenvloeiing van de cellen, met als doel ongeveer 60%. Transfecteer voor de NHEJ-test de experimentele monstercellen in een plaat met 6 putjes met 1 μg EJ5-GFP, 1 μg pCBASceI en 1 μg PCI2-HA-mCherry-plasmiden, met behulp van een in de handel verkrijgbaar transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel). Vervang voor de HR-test het EJ5-GFP-plasmide door het DR-GFP-plasmide.</li>
	<li>Laat voor FACS-kalibratiecontroles een putje met cellen ongeschonden als negatieve controle. Transfecteer de cellen in een plaat met 6 putjes met ofwel (1) 1 μg EJ5-GFP (voor NHEJ-test) of 1 μg DR-GFP (voor HR-test), samen met 1 μg pCBASceI als een GFP-eenkleurige controle, of (2) 1 μg PCI2-HA-mCherry als een mCherry-eenkleurige controle.</li>
</ol>3. Analyse van de GFP-positieve en mCherry-positieve cellen door middel van flowcytometrie
<ol><li>Bevestig twee dagen na transfectie de expressie van GFP- en mCherry-eiwitten met behulp van een fluorescerende microscoop.</li>
	<li>Verwijder drie dagen na transfectie de media uit de putjes, was eenmaal met PBS en voeg 500 μL trypsine toe aan elk putje. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C om alle cellen van de plaat los te maken. Bescherm de cellen tijdens deze en de volgende stappen tegen direct licht.</li>
	<li>Voeg 500 μL volledig DMEM-media toe aan elk putje, resuspendeer de cellen en zorg ervoor dat er geen klonten zichtbaar zijn.</li>
	<li>Breng alle cellen van elk putje over in centrifugebuisjes van 1,5 ml en centrifugeer de cellen vervolgens 2 minuten bij 1000 × g bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren en was het eenmaal met 1,0 ml PBS.</li>
	<li>Nogmaals, verwijder het supernatans voorzichtig door te pipetteren, resuspendeer de cellen in 500 μL PBS en breng de cellen over naar FACS-buizen (zie Materiaaltabel). OPMERKING: Voor optimale resultaten begint u onmiddellijk na de celoogst met flowcytometrieanalyse. Als alternatief kunnen cellen enkele uren op ijs worden bewaard.</li>
	<li>Kalibreer de FACS met niet-getransfecteerde cellen (negatieve controle), EJ5-GFP/DR-GFP en pCBASceI-getransfecteerde cellen (GFP-eenkleurige controle) en mCherry-getransfecteerde cellen (mCherry eenkleurige controle). Pas de spanning en compensatie aan om fluorescentie-spillover tussen GFP en mCherry te minimaliseren.</li>
	<li>Verwerf en registreer ten minste 10.000 intacte cellen van elke buis.</li>
</ol>4. Analyse van de gegevens
OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van FlowJo-software (zie Materiaaltabel) om de FACS-gegevens te analyseren. Vergelijkbare procedures kunnen worden uitgevoerd in alternatieve analysesoftware.
<ol><li>Sleep alle FACS-bestanden naar het dashboard. Dubbelklik op een van de bestanden om de FSC/SSC-plot weer te geven.</li>
	<li>Maak een polygoonpoort om intacte cellen te selecteren, met uitzondering van puin in de linkerbenedenhoek. Noem deze subpopulatie "Intacte cellen" en sleep deze poort naar de balk "Alle voorbeelden". Blader door elk monster met behulp van de knop Volgende monster om ervoor te zorgen dat elk monster op de juiste manier wordt afgeschermd (Figuur 2A).</li>
	<li>Dubbelklik op de subpopulatie Intacte cellen van het negatieve controlemonster (niet-getransfecteerde cellen) om een nieuwe grafiek te openen. Verander de assen in FL1-H (x-as, GFP) en FL2-H (y-as, mCherry).</li>
	<li>Selecteer het gereedschap Quad Gating en klik op het uiterste rechtsboven van de negatieve celpopulatie (Figuur 2B). Sleep de vier rechthoekige poorten naar de balk "Intacte cellen". Blader door voorbeelden van GFP-eenkleurige controle of mCherry eenkleurige controle met behulp van de knop Volgende monster om ervoor te zorgen dat GFP-positieve of mCherry-positieve van negatieve controlecellen worden onderscheiden (Figuur 2C,D). Verfijn de kwadrant-gating indien nodig en pas deze gating toe op alle "Intact Cells"-populaties.</li>
	<li>Klik op de lay-outeditor. Klik met de rechtermuisknop op de representatieve plots en kies Kopiëren naar lay-outeditor. Selecteer alle representatieve plots en dubbelklik vervolgens om Graph Definition te openen. Pas het aslabel, de annotatie en de legenda naar wens aan.</li>
	<li>Het percentage mCherry-positieve cellen in experimentele monsters dient als controle van de transfectie-efficiëntie. Bereken de relatieve efficiëntie van DNA-herstel door het aantal GFP-positieve cellen te vergelijken met het aantal mCherry-positieve cellen in hetzelfde perceel.</li>
</ol>

FACS-analyse van GFP- en mCherry Reporter-cellen om de NHEJ- en HR-efficiëntie te evalueren

<ol><li>Huang, R., Zhou, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+repair%3A+historical+perspectives%2C+mechanistic+pathways+and+clinical+translation+for+targeted+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).</li>
<li>Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonhomologous+DNA+end-joining+for+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).</li>
<li>Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+and+the+repair+of+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks.</a> J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).</li>
<li>Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC3+promotes+homology-directed+repair+of+DNA+damage+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells.</a> Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).</li>
<li>Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative-NHEJ+Is+a+mechanistically+distinct+pathway+of+mammalian+chromosome+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair.</a> PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).</li>
<li>Gunn, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI-based+assays+to+examine+distinct+repair+outcomes+of+mammalian+chromosomal+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks.</a> Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).</li>
<li>Zuo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+alternative+end-joining+in+HNSC+cell+lines+using+DNA+Double-strand+break+reporter+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays.</a> Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).</li>
<li>Schrank, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+ARP2%2F3+drives+DNA+break+clustering+for+homology-directed+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair.</a> Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).</li>
<li>Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-PKcs+promotes+chromatin+decondensation+to+facilitate+initiation+of+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response.</a> Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hCINAP+regulates+the+DNA-damage+response+and+mediates+the+resistance+of+acute+myelocytic+leukemia+cells+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy.</a> Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).</li>
<li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WASH+interacts+with+Ku+to+regulate+DNA+double-stranded+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair.</a> iScience. 25 (1), 103676(2022).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+regulation+of+RIG-I+and+XRCC4+connects+DNA+repair+with+RIG-I+immune+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling.</a> Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).</li>
<li>Watkins, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+complexity+profiling+reveals+that+HORMAD1+overexpression+contributes+to+homologous+recombination+deficiency+in+triple-negative+breast+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers.</a> Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USP44+regulates+irradiation-induced+DNA+double-strand+break+repair+and+suppresses+tumorigenesis+in+nasopharyngeal+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma.</a> Nat Commun. 13 (1), 501(2022).</li>
<li>Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+DNA+double-strand+break+%28DSB%29+repair+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells.</a> JoVE. (43), e2002(2010).</li>
<li>Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNakanishi%2C+K+%22DNA+recombination%3A+Methods+and+Protocols%22">DNA recombination: Methods and Protocols</a>. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).</li>
<li>Cavallo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+proficiency+in+homologous+recombination+underlies+the+high+sensitivity+of+embryonal+carcinoma+testicular+germ+cell+tumors+to+cisplatin+and+poly+%28ADP-Ribose%29+polymerase+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition.</a> PLoS One. 7 (12), e51563(2012).</li>
<li>Unfried, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNA+NIHCOLE+promotes+ligation+efficiency+of+DNA+double-strand+breaks+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma.</a> Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).</li>
<li>Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCavallo%2C+F+%22Testicular+Germ+Cell+Tumors%3A+Methods+and+Protocols%22">Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols</a>. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hanahan+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+Escherichia+coli%3A+high-efficiency+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).</li>
<li>Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+steps+of+mammalian+homologous+repair+with+distinct+mutagenic+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences.</a> Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).</li>
</ol>

Er zijn geen belangenconflicten om bekend te maken.

De hier beschreven methode is in verschillende artikelen gebruikt om de NHEJ-efficiëntie en HR-efficiëntie te beoordelen 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Deze methode is relevant voor het ophelderen van de onderliggende mechanismen van DNA DSB-herstel en het identificeren van nieuwe factoren die verband houden met NHEJ en HR. Bijvoorbeeld de functie van DNA-afhankelijke proteïnekinase katalytische subeenheid (DNA-PKcs)9, Coiline-interagerend nucleair ATPase-eiwit (hCINAP)10, WASH11, retinoïnezuur-induceerbaar gen I (RIG-I)12, röntgenreparatie cross-complementerend eiwit 4 (XRCC4)12, HORMA-domeinbevattend eiwit 1 (HORMAD1)13, ubiquitine-specifieke protease 44 (USP44)14, en lncRNA NIHCOLE (niet-coderend RNA geïnduceerd bij hepatocellulair carcinoom met een oncogene rol in ligatie-efficiëntie) in NHEJ of HR zijn onthuld of gevalideerd door de toepassing van extrachromosomale methoden. In tegenstelling tot de chromosomaal geïntegreerde benadering, maakt deze extrachromosomale benadering een snelle analyse van NHEJ- of HR-efficiëntie mogelijk door het gebruik van gevestigde stabiele cellijnen.
De extrachromosomale NHEJ- en HR-assays, die eerder zijn gebruikt in HEK-293T-cellen door ons en anderen 10,11,12, zijn ook gebruikt door verschillende andere onderzoeksgroepen in verschillende cellijnen, waaronder U2OS-cellen 16,17, embryonaal carcinoomcellen17,19, HCT116-cellen 9, SUM159-cellen13, HCC1143 cellen13, MDA-MB-436-cellen13, SUNE1-cellen14, Huh7-cellen18 en JHH6-cellen18. Het protocol hier geeft een gedetailleerde beschrijving van de NHEJ- en HR-assays die zijn uitgevoerd in HEK-293T-cellen. Gezien de opmerkelijke transfectie-efficiëntie van HEK-293-cellen, wordt een combinatie van 1 μg EJ5-GFP of 1 μg DR-GFP, samen met 1 μg pCBASceI, als voldoende beschouwd voor HEK-293T-cellen gekweekt in een plaat met 6 putjes. De transfectieomstandigheden kunnen echter verschillen in andere cellijnen dan HEK-293T 9,16,17, waardoor de onderzoeker de exacte voorwaarden voor succesvolle transfectie nauwgezet moet bepalen.
Het bereiken van de vereiste celconfluentie voorafgaand aan transfectie is een cruciale procedure in het protocol. Een onvoldoende of te groot aantal cellen kan de werkzaamheid van transfectie aanzienlijk belemmeren. Een ontoereikend aantal cellen verergert de toxiciteit na transfectie, waardoor de nauwkeurige evaluatie van DSB-herstel wordt belemmerd. Bovendien is het belangrijk om binnen één experiment dezelfde mix van plasmiden en transfectiereagens te gebruiken, omdat afwijkingen in het mengsel van EJ5-GFP/DR-GFP, pCBASceI, PCI2-HA-mCherry en transfectiereagens mogelijk van invloed kunnen zijn op het resultaat.
Naast NHEJ en HR zijn alternate end joining (a-EJ) en single-strand annealing (SSA) geïdentificeerd als aanvullende mechanismen voor het repareren van DSB's. In wildtype cellen zijn NHEJ en HR echter de primaire routes voor DSB-herstel, terwijl a-EJ en SSA in dit opzicht slechts een kleine bijdrage leveren. Het is vermeldenswaard dat de NHEJ-test met behulp van EJ5-GFP-plasmide zowel NHEJ- als a-EJ-gebeurtenissen detecteert en dus kan worden beschouwd als een test voor totaal-NHEJ, inclusief zowel NHEJ als a-EJ5. Een individuele analyse van a-EJ kan eenvoudig worden bereikt door de EJ5-GFP te vervangen door EJ2-GFP18. Soortgelijke tests kunnen ook worden uitgevoerd om de reparatie-efficiëntie van SSA te analyseren door de verstoorde GFP-reporter te vervangen door hprtSAGFP21.

Een DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB) is de meest schadelijke vorm van DNA-schade, die mogelijk kan leiden tot genoominstabiliteit, chromosomale herschikkingen, cellulaire veroudering en celdood als deze niet onmiddellijk wordt gerepareerd1. Twee gevestigde routes, niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologe recombinatie (HR), worden erkend voor hun effectiviteit bij het aanpakken van DNA DSB's 2,3. HR wordt beschouwd als een foutloos mechanisme voor DSB-reparatie, waarbij homologe sequenties in de zusterchromatide worden gebruikt als sjabloon om de oorspronkelijke configuratie van het beschadigde DNA-molecuul3 te herstellen. NHEJ, aan de andere kant, is een foutgevoelig DSB-reparatiepad dat de kapotte DNA-uiteinden verbindt zonder te vertrouwen op een sjabloon2.
De NHEJ-test en HR-test zijn klassieke methoden die oorspronkelijk zijn ontwikkeld in het laboratorium van Jasin in het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center en worden gebruikt om de efficiëntie van NHEJ en HR te kwantificeren, respectievelijk 4,5,6,7. Deze tests spelen een cruciale rol bij het onderzoeken van de relevante mechanismen en factoren die verband houden met NHEJ en HR 8,9,10,11,12,13,14. Beide tests zijn gebaseerd op de implementatie van twee verstoorde GFP-reporters, EJ5-GFP en DR-GFP, om de reparatie van DSB's geïnduceerd door de I-SceI-endonuclease te monitoren. De EJ5-GFP-reporter wordt gebruikt in de NHEJ-test, terwijl de DR-GFP-reporter wordt gebruikt in de HR-test. Elke reporter is subtiel ontworpen zodat de I-SceI-geïnduceerde DSB's alleen kunnen worden gerepareerd door een specifieke reparatieroute om een GFP-expressiecassette te herstellen 4,5.
De NHEJ-test en HR-test kunnen worden uitgevoerd met behulp van een chromosomaal geïntegreerde of een extrachromosomale benadering15,16. De chromosomaal geïntegreerde benadering vereist de integratie van de verstoorde GFP-reporters in het genoom, waardoor de analyse van DSB-herstel binnen een chromosomale context mogelijk is 6,15. Deze benadering vereist echter langdurige celpassaging en is ongeschikt voor vergelijkende studies met meerdere cellijnen vanwege willekeurige chromosomale integratie, waardoor naast inherente verschillen ook een extra verstorende factor wordt geïntroduceerd. In dit protocol beschrijven we de extrachromosomale NHEJ-assay en HR-assays, waarbij de voorbijgaande transfectie van de verstoorde GFP- en I-SceI-plasmiden in HEK-293T-cellen omvat, gevolgd door flowcytometrie-analyse (de experimentworkflow wordt weergegeven in figuur 1). Deze niet-geïntegreerde reporter-assays werden oorspronkelijk gerapporteerd door het laboratorium van Jasin om DNA-interstrand cross-links reparatie16 te bestuderen en zijn gebruikt om NHEJ-efficiëntie en HR-efficiëntie te beoordelen door verschillende laboratoria 9,10,11,12,13,14,17,18,19, inclusief de onze11. Deze extrachromosomale benaderingen vergemakkelijken de analyse van DSB-herstel in vergelijkende studies waarbij meerdere gevestigde stabiele cellijnen betrokken zijn.

<table><tbody><tr><td>6 cm dishes&nbsp;</td><td>BBI</td><td>F611202-9001</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Beyotime</td><td>ST007</td><td>Werkconcentratie: 100 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>DH5&alpha; Competent Cells</td><td>TIANGEN</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>DR-GFP</td><td>Addgene</td><td>26475</td><td></td></tr><tr><td>EJ5-GFP</td><td>Addgene</td><td>44026</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Plasmid&nbsp; kit</td><td>TIANGEN</td><td>DP117</td><td>alternatieve endotoxine-vrije plasmide-extractiekit kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>CLARK</td><td>FB25015</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V.10.1</td><td>Treestar</td><td></td><td>alternatieve analysesoftware kan worden gebruikt</td></tr><tr><td>HEK-293T cellen</td><td>National Infrastructure of Cell Line Resource</td><td>1101HUM-PUMC000091</td><td></td></tr><tr><td>Lipo3000</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td>alternatieve transfectiereagentia kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL601A</td><td></td></tr><tr><td>pCBASceI</td><td>Addgene</td><td>26477</td><td>I-SceI expresserend plasmide</td></tr><tr><td>PCI2-HA-mCherry</td><td></td><td></td><td>alternatieve plasmiden met DsRed kunnen worden gebruikt</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in hek-293t-cellen met behulp van op gfp gebaseerde reportersystemen

Analysis of Nonhomologous End Joining and Homologous Recombination Efficiency in HEK-293T Cells Using GFP-Based Reporter Systems

DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB's) vertegenwoordigen de gevaarlijkste DNA-laesies, die in staat zijn om aanzienlijk genetisch informatieverlies en cellulaire sterfte te veroorzaken. Als reactie hierop gebruiken cellen twee primaire mechanismen voor DSB-herstel: niet-homologe eindverbinding (NHEJ) en homologe recombinatie (HR). Het kwantificeren van de efficiëntie van NHEJ en HR afzonderlijk is cruciaal voor het verkennen van de relevante mechanismen en factoren die met elk verband houden. De NHEJ-test en HR-test zijn gevestigde methoden die worden gebruikt om de efficiëntie van hun respectieve reparatieroutes te meten. Deze methoden zijn gebaseerd op zorgvuldig ontworpen plasmiden die een verstoord groen fluorescerend eiwit (GFP) -gen bevatten met herkenningsplaatsen voor endonuclease I-SceI, dat DSB's induceert. Hier beschrijven we de extrachromosomale NHEJ-test en HR-test, waarbij HEK-293T-cellen worden gecoëxfecteerd met EJ5-GFP/DR-GFP-plasmiden, een I-SceI-expressieplasmide en een mCherry-expressieplasmide. Kwantitatieve resultaten van NHEJ- en HR-efficiëntie worden verkregen door de verhouding tussen GFP-positieve cellen en mCherry-positieve cellen te berekenen, zoals geteld door flowcytometrie. In tegenstelling tot chromosomaal geïntegreerde assays, zijn deze extrachromosomale assays meer geschikt voor het uitvoeren van vergelijkend onderzoek met meerdere gevestigde stabiele cellijnen.

Om de nauwkeurigheid van de NHEJ- en HR-analyse te garanderen, is de implementatie van een geschikte strategie voor het aanpassen van vergoedingen en het afschermen noodzakelijk. Doorgaans manifesteert mCherry-fluorescentie zich niet in de GFP-detector bij gebruik van een filter van 530 nm. In gevallen van cellen die een extreem hoge GFP-expressie vertonen, kan de GFP-fluorescentie de mCherry-detector echter besmetten bij gebruik van een filter van 575 nm. Om deze zorgen weg te nemen, werden negatieve controle, GFP-eenkleurigecontrole en mCherry-eenkleurige controlemonsters gebruikt ter compensatie en om de gating-strategie te reguleren. Typische FACS-resultaten van de controlecellen worden weergegeven in figuur 2. Compensatieaanpassing en poortstrategie moeten de meerderheid van de GFP-positieve cellen in het kwadrant rechtsonder plaatsen (Figuur 2C) en de meerderheid van de mCherry-positieve cellen in het kwadrant linksboven (Figuur 2D).
De definitieve representatieve percelen zijn weergegeven in figuur 3A,B. Na de inductie van DSB's door I-SceI, zullen succesvolle reparatiegebeurtenissen het GFP-gen reconstrueren. Het percentage GFP-positieve cellen komt dus overeen met de efficiëntie van DNA DSB-reparatie en transfectie-efficiëntie. Het percentage mCherry-positieve cellen komt alleen overeen met de transfectie-efficiëntie. De relatieve efficiëntie van DNA DSB-reparatie kan worden berekend als de verhouding tussen GFP-positieve cellen en mCherry-positieve cellen (Figuur 3C).
Een concreet voorbeeld van de NHEJ-test om de rol van het eiwit van het Wiskott-Aldrich-syndroom en SCAR-homoloog (WASH) bij DNA-herstel te karakteriseren, wordt weergegeven in figuur 4. In dit voorbeeld hebben we de NHEJ-test uitgevoerd om de NHEJ-efficiëntie van shControl-cellen en shWASH-cellen te beoordelen (Figuur 4). Het is duidelijk dat het verlies van WASH resulteerde in een vermindering van de NHEJ-efficiëntie, wat de rol van WASH bij het bevorderen van NHEJ-efficiëntie bevestigt, zoals bepaald door de NHEJ-test.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig01.jpg"> Figuur 1: Overzicht van de workflow voor de NHEJ/HR-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig02.jpg"> Figuur 2: Gatingstrategie voor flowcytometrieanalyse. (A) FSC-H/SSC-H gating op intacte cellen. (B) Niet-getransfecteerde HEK-293T-cellen werden gebruikt als negatieve controle voor het uitsluiten van autofluorescerende cellen. (C) HEK-293T-cellen getransfecteerd met EJ5-GFP- en pCBASceI-plasmiden werden gebruikt voor het instellen van de gating voor GFP-positieve cellen. (D) HEK-293T-cellen getransfecteerd met mCherry-plasmiden werden gebruikt voor het instellen van de gating voor mCherry-positieve cellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig03.jpg"> Figuur 3: Typische resultaten. (A) Representatieve grafieken die de analyse van NHEJ illustreren. (B) Representatieve grafieken ter illustratie van de analyse van HR. (C) Modeldiagram van de berekeningsmethode. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66501/66501fig04.jpg"> Figuur 4: WASH bevordert de NHEJ-efficiëntie. (A) Representatieve grafieken die de analyse van de NHEJ-efficiëntie in shControl-cellen en shWASH-cellen illustreren. (B) Representatieve statistische resultaten waarin de NHEJ-efficiëntie tussen shControl- en shWASH-cellen wordt vergeleken. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66501/66501fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Dit protocol beschrijft een extrachromosomale niet-homologe eindverbindingstest (NHEJ) en een homologe recombinatietest (HR) om de efficiëntie van NHEJ en HR in HEK-293T-cellen te kwantificeren.

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen

DNA double-strand breaks (DSBs) represent the most perilous DNA lesions, capable of inducing substantial genetic information loss and cellular demise. In ...

DNA-dubbelstrengsbreuken vertegenwoordigen de gevaarlijkste DNA-laesies. Als reactie hierop gebruiken cellen twee primaire mechanismen voor het herstel van DNA-dubbelstrengsbreuken, NHEJ en HR. Het kwantificeren van de efficiëntie van NHEJ en HR afzonderlijk is cruciaal voor het verkennen van de relevante mechanismen en factoren die ermee verband houden. De NHEJ-test en de HR-test zijn gevestigde methoden die worden gebruikt om de efficiëntie van NHEJ en HR te meten. Deze methoden zijn gebaseerd op zorgvuldig ontworpen plasmiden die een verstoord groen fluorescerend eiwitgen bevatten met herkenningsplaatsen voor endonuclease I-SceI voor inductie van DSB's.De NHEJ-test en de HR-test kunnen worden uitgevoerd met behulp van een chromosomaal geïntegreerde of een extrachromosomale benadering. De chromosomaal geïntegreerde benadering maakt de analyse van DSB-reparatie binnen een chromosomale wedstrijd mogelijk. De chromosomaal geïntegreerde benadering vereist echter langdurige cellen en is ongeschikt voor vergelijkende studies met meerdere cellijnen.In dit protocol beschrijven we de extrachromosomale NHEJ- en HR-assays met voorbijgaande transfectie van de verstoorde GFP- en I-SceI-plasmiden in HEK-293T-cellen en de daaropvolgende flowcytometrieanalyse. Deze niet-geïntegreerde reporter-assays zijn door verschillende laboratoria, waaronder het onze, gebruikt om de NHEJ-efficiëntie en HR-efficiëntie te beoordelen. In tegenstelling tot de chromosomaal geïntegreerde benadering, maakt deze extrachromosomale benadering een snelle analyse van de NHEJ- of HR-efficiëntie mogelijk door het gebruik van gevestigde, stabiele cellijnen.

analysis-nonhomologous-end-joining-homologous-recombination

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

Wij bieden een methode voor het testen van BRCA1 varianten in een weefselkweek gebaseerde test voor homologe recombinatie reparatie van DNA-schade door afbrekende endogene BRCA1-eiwit uit een cel met behulp van RNAi en te vervangen door een BRCA1-punt mutant die een codering wijzigen.

Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

De HO-gestimuleerde translocatie assay monitoren enkelstrengs gloeien na de oprichting van DNA dubbelstrengs breuken op meerdere loci in...

Kwantificering en analyse van de vorming van HO-endonuclease chromosomale translocaties Gestimuleerd door Single-Strand Gloeien in Saccharomyces cerevisiae</em

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.

Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

Dit protocol beschrijft een minigene reporter assay om de impact van 5'-splice site mutaties op splicing te monitoren en ontwikkelt suppressor U1 snRNA voor de redding van mutatie-geïnduceerde splicing remming. De reporter en suppressor U1 snRNA constructen worden uitgedrukt in HeLa cellen, en splicing wordt geanalyseerd door primer extensie of RT-PCR.

Een op reporter gebaseerde cellulaire test voor het bewaken van splicing-efficiëntie

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Hier beschrijven we een methode voor celgebaseerde visualisatie, subcellulaire lokalisatie en kwantitatieve analyse van poly(ADP-ribose) (PAR) verrijkte foci in vaste zoogdiercellen. Deze test maakt het mogelijk om plaatsen te kwantificeren van door DNA-schade veroorzaakte PARP-activatie, inclusief die geassocieerd met basenexcisieherstel of enkelstrengbreukreparatie, in de kernen van aan genotoxine blootgestelde cellen.

Visualisatie en kwantitatieve analyse van door genotoxine geïnduceerde PARP1/PARP2-activatie in cellen met behulp van een op fluorescent fusie eiwit gebaseerde reporter

Leer hoe je NHEJ- en HR-reparatie-efficiëntie analyseert in HEK-293T-cellen met behulp van GFP-gebaseerde reportersystemen en flowcytometrie. Deze methode versnelt DNA-herstelonderzoek aanzienlijk.

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen (Video) | JoVE Journal

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen

Meer video's verkennen